نحن نقدر ساريسا الطبية الحيوية لعملهم في تطوير أجهزة الاستشعار المستخدمة في هذا المخطوط. وأيد هذا البحث من قبل الوطني للقلب والرئة والدم المعهد يمنح HL108880 (A. Staruschenko)، HL 116264 (A. كاولي) وHL 122662 (A. Staruschenko وA. كاولي)، وهو مشروع ممول من كلية الطب في لجنة شؤون البحث العلمي ويسكونسن # 9306830 (O. Palygin) والنهوض و# برنامج البحوث والتعليم صحة ويسكونسن 9520217، والباحث الصغير منحة من مؤسسة الوطنية للكلى (O. Palygin).

إجراءات الحيوانات التالية انضمت إلى دليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم الحصول على موافقة مسبقة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC). وينبغي أن يتم استعراض تعليمات الشركة الاستشعار خلال تصميم التجربة وقبل استخدامها: ملاحظة. وباتباع هذه التعليمات تنتج أفضل النتائج عند استخدام أجهزة الاستشعار. 1. الاستشعار المعايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول الأسهم الجديدة قبل بدء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء مخزن وتحتوي على 10 ملي NaPi العازلة، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم MgCl 2، و 2 ملي الجلسرين. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. تخزين في 2-8 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تركيز الأسهم ATP (100 ملم) المخزنة في -20 ° C، إنشاء الطازجة 10 ملي ATP حل المعايرة عن طريق إضافة الأوراق المالية 10 ميكرولتر إلى 90 ميكرولتر من العازلة A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب استشعار ATP عن طريق وضع طرفها (الشكل 2) في رانه الإماهة غرفة تحتوي على مخزن A لمدة 10 دقيقة على الأقل في 2-8 ° C. ملاحظة: بعد الإماهة، لا ينبغي أن يتعرض أجهزة الاستشعار في الهواء لأكثر من 20 ثانية أو ربما يتم تخفيض حساسية الاستشعار. إذا كان متوقعا التعرض الطويل للهواء، وتراجع استشعار لفترة وجيزة في حل من الجلسرين. ويمكن استخدام أجهزة الاستشعار لتجارب متعددة ولكن هذه يجب أن تحدث في نفس اليوم الذي استشعار الإماهة. يمكن تخزين أجهزة الاستشعار في غرفة الإماهة مع العازلة A لمدة تصل إلى 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على قناة potentiostat المزدوج (الشكل 3) وبدء برنامج نظام التسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة المعايرة مع 3 مل من العازلة A. مكان القطب المرجعية في غرفة المعايرة. اتخاذ كل أجهزة الاستشعار من غرفة الإماهة، ثم إرفاقه مناور وأدخله في حل غرفة المعايرة. ملاحظة: استخدام سيليكون المغلفة طبق بتري القياسية باعتباره غرفة المعايرة. تنفيذ جميع المعايرة والحادي والعشرينudies في قفص فاراداي على طاولة الهواء المختبر عالية الأداء للحد من الضوضاء إشارة خلال التسجيلات amperometry (الشكل 4). المعايرة تتم الأفضل أقرب إلى بدء جمع البيانات ممكن. لتقديم الطلبات في الجسم الحي الوقت الأمثل للمعايرة وخلال فترة النقاهة بعد جراحة الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فيفو السابقين المعايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء voltammetry دوري في غرفة المعايرة من قبل ركوب الدراجات أجهزة الاستشعار من -500 إلى +500 بالسيارات بالسيارات بمعدل 100 فولت / ثانية لمدة 10 دورات. هذا يحسن كثيرا من حساسية من أجهزة الاستشعار. انظر الشكل 5 للآثار لوحظ من 10 دورات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استقطاب أجهزة الاستشعار ل+600 بالسيارات بعد الدورة الأخيرة. وأجهزة الاستشعار الحالية الاضمحلال إلى الخط المقارب. ويتحقق القراءة ثابتة بعد مدة لا تقل عن 5 دقائق. تسجيل القراءة الصفر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الجسم الحي معايرة أجهزة الاستشعار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدم تنفيذ voltammetry دوري على المجراة الحرفيروبية. بدلا من ذلك، استقطاب أجهزة الاستشعار في غرفة المعايرة لمدة 30 ثانية إلى +500 بالسيارات. ثم تعيين potentiostat إلى 0 بالسيارات والسماح للاستشعار الحالي ليرتفع إلى الخط المقارب. وأجهزة الاستشعار الحالية تأخذ 2 دقيقة على الأقل إلى الخط المقارب. تسجيل القراءة الصفر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على التوالي إضافة كميات محددة من حل ATP الى غرفة لإنتاج خط معايرة تضم مجموعة الكشف المطلوب. الحل ATP تنتج ذروة حادة في إشارة الاستشعار في البداية، تليها تسوس كما ينشر على ATP بالتساوي في جميع أنحاء الغرفة. قيم الإشارات سجل مرة واحدة على مستوى إشارة قد استقرت بعد كل إضافة للاعبي التنس المحترفين. أرقام 6A و 7 تظهر آثار واقترح تركيزات ATP لكل من خارج الجسم الحي والدراسات المجراة على التوالي. ملاحظة: من المهم للتأكد من الانتقائية من الأقطاب الكهربائية باستخدام الزبالين من التحاليل. هذا البروتوكول يستخدم آبيراز لاختبار خصوصية استشعار ATP والكاتالاز لH &lt;دون&gt; 2 O 2 إشارة (أرقام 6B). إذا الأدوية على أن تدار، ينبغي تحديد قياسات للتفاعل مع أجهزة الاستشعار قبل الدراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر من آبيراز من مخزون من 2 ملغ / مل (89 UN / ملغ) لاختبار خصوصية استشعار ATP (التيار تنتجها تطبيق ATP أن تخفض إلى مستوى الصفر (الشكل 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر من الكاتلاز من مخزون من 2mg / مل (100 UN / ملغ) لاختبار خصوصية من أجهزة الاستشعار لاغية (التيار التي تنتجها H 2 O 2 التطبيق يجب أن تخفض إلى القراءة صفر). </li></ol> 2. جراحة الحيوان للدراسات الاستشعار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عملية جراحية لخارج الجسم الحي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوان التجريبي مع isoflurane (5٪ تحريض، 1،5-2،5٪ الصيانة) / الصف O الطبية 2 أو طريقة أخرى وافق 15 &#39;يجب أن تراقب 12 الحيوانات بشكل مستمر لضمان مستوى مناسب من التخدير. سانتتستخدم قادرة التنفسي رد الفعل معدل وقرصة أخمص قدميه لتأكيد التخدير المناسب. ملاحظة: الموت ببطء الحيوان وفقا لبروتوكولات IACUC المعتمدة. عند الانتهاء من جميع إجراءات عدم البقاء على قيد الحياة والموت ببطء الحيوانات الخدر بعمق بضع الصدر حمل استرواح الصدر للتأكد من زوال إنسانية لهذا الحيوان 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران على طاولة العمليات الجراحية التي تسيطر عليها درجة الحرارة في موقف ضعيف. مع الحفاظ على عمق التخدير المناسبة، وجعل شق خط الوسط من حوالي 5 سم وذلك تمشيا مع الكلية اليسرى وفضح الشريان الأورطي البطني البعيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لف رباط حول الاضطرابات الهضمية والشرايين المساريقي العلوي، والشريان الأورطي البطني فوق هذه الشرايين ولكن لا ligate. التفاف اثنين من الأربطة حول الشريان الأورطي البطني تحت الشرايين الكلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشبك الشريان الأورطي البطني فوق الحروف المركبة. ربط انخفاض رباط. يقثطر الشريان الأورطي البطني مع أنابيب البولي ايثيلين (PE50). تأمين القسطرة مع ربطة الشريان الأورطي الثاني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المشبك وligate المساريقي والاضطرابات الهضمية الشرايين. يروي الكلى في 6 مل / دقيقة مع هانكس محلول الملح المتوازن في RT لمدة 2-3 دقيقة حتى يتم المقشر الكلى تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئصال الكلى والقسطرة، متصلة جزء من الشريان الأورطي. وضع الكلى إلى 3 مل طبق بتري مملوءة بمحلول حمام. ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها بروتوكول التجربة في RT. يحتوي الحل حمام في ملي: 145 كلوريد الصوديوم، 4.5 بوكل، 2 MgCl 2، 1 CaCl 2، 10 HEPES، ودرجة الحموضة 7.35 تعديلها مع هيدروكسيد الصوديوم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عملية جراحية لفي الجسم الحي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران باستخدام بروتوكولات IACUC المعتمدة. لفي الجسم الحي تحليل تخدير الفئران مع الكيتامين (20 ملغ / كغ IM) وinactin (50 ملغ / كغ الملكية الفكرية). يجب مراقبة الحيوانات باستمرار لضمان مستوى مناسب من التخدير. وتستخدم مجموعة مستقرة التنفسي رد الفعل معدل وقرصة أخمص قدميه لتأكيد التخدير المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عمق التخدير الصحيح هو الحصول علىالطبعه، وضع الفئران في موقف ضعيف على سطح الارض يمكن التحكم بدرجة حرارته تقع على الطاولة الهواء. وينبغي مسخن المياه السطحية والحفاظ على 36 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الحفاظ على عمق التخدير المناسبة، وجعل شق خط الوسط حوالي 5 سم وذلك تمشيا مع الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخيط قدرة على الصمود وترسيخ الأنسجة الجلدية وتحت الجلد بحيث الكلى بالكامل مرئيا. وضع الكلى في كوب الكلى للحد من أي حركة القطع الأثرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ضخ الرابع من 2٪ BSA: 0.9٪ كلوريد الصوديوم في 1 مل / 100 ز / ساعة عبر الوريد الوداجي للحفاظ على حجم الدم. يقني؛ يدخل القنية كل من الحالب لجمع البول. العلاقات مكان حول المساريقي والاضطرابات الهضمية الشرايين متفوقة وأبهري البعيدة للتلاعب ضغط التروية الكلوي (أرقام 10A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان مطلوبا تطبيق كلاء الدوائية خلال التجارب المجراة، يوصى بإدخال قسطرة الخلالي (أرقام 10B </strong&gt;). </li></ol></li></ol> الإعداد 3. الحصول على البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج الحصول على البيانات وتحديد قطبية لها على حد سواء خارج الجسم الحي وفي التجارب المجراة على بأكسيد الألومنيوم إيجابي. وضع برنامج لحفظ البيانات كرمز ASCII. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع micromanipulators لالإدراج السريع للأجهزة الاستشعار في الكلى. ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم التحقيق وهمية تعلق على micromanipulator للمساعدة في تحقيق موضع المطلوب من أجهزة الاستشعار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فيفو السابقين الحصول على البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي الكلى مع الحل حمام (من 2.1.6) عن طريق الشريان الأورطي مقنى بمعدل ثابت من 650 ميكرولتر / دقيقة. باستخدام مقص جراحي، وإزالة بعناية الكبسولة الكلى، وهو أمر ضروري لإدخال جهاز الاستشعار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين الكلى مع الأربطة المطاطية مربوطة على الكلى وتعلق على طبق المغلفة سيليكون مع دبابيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القطب إشارة على مقربة من الكلى في طبق بتري مع طرفها المغمورة فيحل العازلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الحصول على البيانات الجسم الحي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الكلى في كوب الكلى. اعتمادا على سلالة وعمر الحيوان استخدام حجم الكأس التي يحمل الكلى فضفاضة الشكل 8 عروض بمرتين من الكؤوس الكلى. تستخدم أكواب مماثلة للنهج الفسيولوجية المختلفة التي تركز على تحليل وظائف الكلى مثل بزل مجهري الخ 16. ملاحظة: إن موقف كوب الكلى أمر بالغ الأهمية لإزالة الضوضاء الميكانيكية التي تنتجها التنفس الحيوان، ولكن لا ينبغي أن تتداخل مع أو منع نضح الكلى أو تدفق البول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سماح 45 دقيقة من وقت الانتعاش قبل تنفيذ جمع البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة 26-30G، وجعل ثقب ثقب في الموقع المطلوب وعمق من أجهزة الاستشعار في الكلى. وصمة عار ثقب السطح لإزالة الدم ناضح. إضافة حل الجلسرين على سطح الكلى. وهذا يمنع السطح الكلى من الجفاف أثناء التجربة. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أول مستشعر من غرفة الإماهة وإرفاقه micromanipulator. بسرعة، في غضون 20 ثانية، وإدراج القطب في الحفرة التي تم إنشاؤها حديثا في الكلى. كرر الخطوات من 3،5-3،9 لاستشعار فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج القطب المرجعية في الكلى، ما يقرب من 1 سم من من أجهزة الاستشعار. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على potentiostat وتفعيل برنامج تسجيل على الكمبيوتر. الشكل 9 يظهر الإعداد النهائي للخارج الحي الحصول على البيانات الكلى. يوضح الشكل 10 الإعداد النهائي للحصول على البيانات الكلى في الجسم الحي مع القسطرة المدرجة. </li></ol> تحليل 4. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد ملف بيانات ASCII إلى المنشأ أو أي برامج أخرى مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز العلاقة الحالية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخطية وظيفة تناسب / استقراء لبناء تركيز الخطي (محور السينية) للتيار (ص -axis) علاقة للATP أو H 2 </suب&gt; نقطة O 2 المعايرة (أرقام 6 و 7). خطي خط مناسبا: ص = MX + ب </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مساواة التيار الى تركيز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح آثار يقاس من أجهزة الاستشعار لاغية من تلك من أجهزة الاستشعار ATP للحصول على التيار الفعلي التي تنتجها ATP داخل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل القيم ATP في السلطة الفلسطينية التي حصلت عليها amperometry إلى نانومتر باستخدام معادلة المعايرة بالتفصيل في 4.2.1. تحديد تركيز التتبع البيانات تطرح من أجهزة الاستشعار ATP عن طريق استيراد كل تيار المعدل في &quot;س&quot; قيمة وحل لص (تركيز الحليلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبالمثل، حساب H 2 O 2 تركيز من معادلة المعايرة لها إذا لزم الأمر. </li></ol>

<ol>
	<li>Palygin, O., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+substances+with+enzymatic+microelectrode+biosensors+in+the+kidney.">Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).</li><li>Clark, L. C., Lyons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrode+systems+for+continuous+monitoring+in+cardiovascular+surgery.">Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery.</a> Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).</li><li>Haruyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-+and+nanobiotechnology+for+biosensing+cellular+responses.">Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).</li><li>Huckstepp, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+hemichannel-mediated+CO2-dependent+release+of+ATP+in+the+medulla+oblongata+contributes+to+central+respiratory+chemosensitivity.">Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity.</a> J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).</li><li>Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+contribution+of+ATP+P2+receptors+to+electrically-evoked+electrographic+seizure+activity+in+hippocampal+slices:+Evidence+from+purine+biosensors+and+P2+receptor+agonists+and+antagonists.">Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists.</a> Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).</li><li>Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-dependent+inhibition+of+dopamine+release+in+striatum+is+mediated+by+a+new+diffusible+messenger,+H2O2.">Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2.</a> J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).</li><li>Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+mechanistic+dissociation+of+ATP+and+adenosine+release+during+ischaemia+in+the+mammalian+hippocampus.">Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus.</a> J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).</li><li>Lalo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+ATP+from+astrocytes+modulates+phasic+and+tonic+inhibition+in+the+neocortex.">Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex.</a> PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).</li><li>Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K++depolarization+evokes+ATP,+adenosine+and+glutamate+release+from+glia+in+rat+hippocampus:+a+microelectrode+biosensor+study.">K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study.</a> Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).</li><li>Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signaling+in+hypothalamic+tanycytes:+potential+roles+in+chemosensing.">Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).</li><li>Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+ATP+in+the+ventral+medulla+during+hypoxia+in+rats:+role+in+hypoxic+ventilatory+response.">Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response.</a> J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).</li><li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H2O2+release+in+freshly+isolated+kidneys.">Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).</li><li>Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+sensitivity+of+glucose+sensor+implanted+into+subcutaneous+tissue.">Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue.</a> Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).</li><li>Wilson, G. S., Gifford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+for+real-time+in+vivo+measurements.">Biosensors for real-time in vivo measurements.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).</li><li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Channel+Analysis+of+TRPC+Channels+in+the+Podocytes+of+Freshly+Isolated+Glomeruli.">Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li><li>Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+ex+vivo+analysis+of+tubule+function.">In vivo and ex vivo analysis of tubule function.</a> Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).</li><li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors:+Fundamentals+and+applications+-+Historic+book+now+open+access.">Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access.</a> Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).</li><li>Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+electrode+biosensors:+theory+and+applications.">Enzyme electrode biosensors: theory and applications.</a> Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).</li><li>Barlett, P. N., Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immobilization+of+enzymes+in+electropolymerized+films.">A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films.</a> J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).</li><li>Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+microelectrodes+for+choline+and+acetylcholine+and+their+applications.">Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications.</a> Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).</li><li>Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+biosensor+for+real-time+measurement+of+ATP+in+biological+tissue.">Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue.</a> Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).</li><li>Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-enzyme+microelectrode+sensor+for+detecting+purine+release+from+central+nervous+system.">A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system.</a> Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).</li><li>Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+biosensor+sensitivity+in+aqueous+and+organic+solvents+using+a+combination+of+poly(pyrrole-ammonium)+and+poly(pyrrole-lactobionamide)+films+as+host+matrices.">Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices.</a> J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+overflow+in+skeletal+muscle+1A+arterioles.">ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles.</a> J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).</li><li>Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+interstitial+fluid+ATP+responses+to+arterial+pressure+and+tubuloglomerular+feedback+activation+during+calcium+channel+blockade.">Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).</li><li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+renal+perfusion+pressure+on+renal+medullary+hydrogen+peroxide+and+nitric+oxide+production.">Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production.</a> Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).</li><li>Khan, A. S., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+consequences+of+using+micro-electrodes+and+microdialysis+probes+in+the+brain.">Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain.</a> Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).</li></ol>

قدمت أجهزة استشعار لتسجيل الفيديو من هذه المخطوطة التي كتبها ساريسا الطبية المحدودة (كوفنتري، المملكة المتحدة).

وقد وضعت البروتوكولات الحالية لتعزيز والقرار الزماني والمكاني للATP وH 2 O 2 الإشارات على الكلى-perfused الدم خارج الجسم الحي معزولة، perfused والحية. الاختلافات بين البروتوكولات وأجهزة الاستشعار المستخدمة هنا توفر الحصول على البيانات الأمثل لأي كلاء الدوائية أو الدراسات الفسيولوجية. تتكون بروتوكولات 1) استشعار المعايرة، 2) إجراء العمليات الجراحية، 3) إعداد الحصول على البيانات، و4) تحليل البيانات. أنها تمكن القياسات في الوقت الحقيقي من التحاليل للعديد من الظروف التجريبية. وسيؤدي ذلك إلى مزيد من الضوء على أمراض الكلى وتطوير علاجات دوائية أكثر فعالية. نحن هنا تستخدم أجهزة استشعار لتحليل ATP وH 2 O 2. ومع ذلك، وأجهزة استشعار للمواد أخرى متوفرة أيضا ويمكن استخدامها. تم تطبيق البروتوكولات المذكورة هنا لدراسة ATP وH 2 O 2 في الكلى الفئران، ولكن في نفس methoيمكن بسهولة د تعديلها لتطبيقها في الفئران. وبالتالي، فإن هذا النهج لديه إمكانات كبيرة بالنظر إلى وفرة من نماذج القوارض الوراثية. وقد تم تطوير التصميم الأساسي لهذه الأجهزة مسرى مكروي الأنزيمية في عام 1960 من قبل كلارك وليون 2. بعد التطوير الأولي من أجهزة الاستشعار، تم إحراز تقدم في كل من التصميم 17-19 والتطبيقات 20. Llaudet آخرون 21،22 طور التصميم الرئيسي للاعبي التنس المحترفين أجهزة الاستشعار المستخدمة في البروتوكولات الحالية في حين تستخدم أساليب من Cosneir وآخرون. (23) لطلاء الانزيم. وقد كشفت هذه المجسات ATP يشير في عدد من العمليات الفسيولوجية بما في ذلك الإفراج ATP من الخلايا النجمية في الدماغ 8، وتنظيم التنفس 4،24، والهيكل العظمي والعضلات شرين تنظيم 25. مؤخرا تم استخدام بروتوكول فيفو السابقين لقياس ATP يشير في الكلى 12. والهدف من هذه المخطوطة طالصورة لتوفير توجيهات ورؤى فعالة للكشف عن المواد المحلية مثل ATP في الكلى. أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمية لها مزايا عديدة أكثر من الوسائل الحالية لقياس التحاليل المجراة. ومع ذلك، يجب استخدام احتياطات خاصة لهذا النهج كما في أي طريقة أخرى جديدة. التحقق من صحة مع نهج مستقر يوفر الثقة في البيانات التي تم الحصول عليها. على سبيل المثال، تم إجراء قياسات microdialysis كما هو موضح سابقا 26،27. لم يلاحظ أي فرق كبير بين تراكيز الذروة التي تحددها أجهزة الاستشعار وتلك التي تم الحصول عليها من عينات غسيل الكلى 12. الحد من microdialysis هو أنه يقيس فقط مستويات ثابتة للدولة من تحليلها. على هذا النحو، لا يمكن أن يتحقق تقييم التغيرات الديناميكية في الخلايا مما يشير فقط مع استخدام أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمية. مواصفات المصنع من أوقات الاستجابة استشعار تختلف بين أجهزة الاستشعارأنواع. خارج الحي أجهزة الاستشعار لديها وقت الاستجابة من 5-10 ثانية، وأجهزة الاستشعار في الجسم الحي من 30-35 ثانية للصعود إشارة 10-90٪. آثار المعايرة (أرقام 6 و 7) تدل على قرار وقت إضافة الحليلة / إزالة. لكل من أجهزة الاستشعار وmicrodialysis النهج، مطلوب استخدام إنزيمات معينة لمنع إشارة التي تنتجها تحليلها لضمان خصوصية. البروتوكولات وصفها لديها العديد من التحديات. كما هو الحال مع أي الإدراج الاستشعار في الأنسجة، ويحدث تلف الأنسجة. هذا يمكن تفعيل مسارات الإشارات التي قد تؤثر على القياسات 28. للحد من تلف الخلايا، ستكون هناك حاجة إلى أجهزة الاستشعار أرق. ومع ذلك، فإنه من الصعب اختراق كبسولة الكلى مع أجهزة الاستشعار وهكذا يتم استخدام الإبر لجعل ثقب دخول صغير. هي مجسات رقيقة أكثر عرضة للثني وتعطيل طلاء على الإدراج. أجهزة الاستشعار قطرها أكبر وأكثر مقاومة الانحناء وresultaالضرر الشمالي للمن الطلاء. الشكل (3) يوضح جهاز استشعار رقيقة وسميكة. بالإضافة إلى مقاومة أجهزة الاستشعار سميكة على الانحناء، وأنها تحتوي على طبقة أكثر سمكا من الطلاء، وتوفير مزيد من الحماية للطبقة الأنزيمية. كان القلق من تلف الأنسجة الناجمة عن استخدام أجهزة الاستشعار سميكة أقل بكثير في الكلى مما سيكون عليه في أنسجة المخ. ويقترب عمق الإدراج ويجب التأكد من صحتها الموضع النهائي بعد الانتهاء من القياسات على الكلى. تقدير بين القشرة والنخاع الطبقات باستخدام جهاز استشعار طول الحافة بمثابة دليل الإدراج وغير كافية كما غيض الاستشعار هو 0.5 ملم وقشرة الكلى 2-3 مم. قاذورات من أجهزة الاستشعار يحدث أيضا بمعدل أكبر في الدم، وبالتالي الحد من استخدام أجهزة الاستشعار في فترة طويلة في بروتوكولات الجسم الحي لتجربة واحدة. أسفرت تسجيل أوقات 1-1 ساعة ونصف إلا في الانجراف استشعار صغير. المعايير الرئيسية عند تقييم أداء جهاز استشعار انخفاض هو انخفاض الحساسيةلتحليلها أثناء عملية المعايرة. زيادة الضجيج الكهربائي وعدم الاستقرار من خط الأساس الحالية يمكن أن يشير أيضا إلى أن الطرف استشعار معطوب. لقياسات دقيقة للاعبي التنس المحترفين، يتعين على أجهزة استشعار (ATP وخالية) يكون الضجيج والاستقرار خصائص مماثلة لمزيد من الطرح للإشارة. خلاف ذلك، واحدة من أجهزة الاستشعار ويجب استبداله. لانخفاض مستوى الضجيج والكشف عن تجمعات صغيرة من تحليلها، ويقترح استخدام أجهزة استشعار جديدة لكل حيوان. عدة خطوات حاسمة للنتائج التجريبية الناجحة. أجهزة الاستشعار هشة للغاية ويجب التعامل معها بعناية لتجنب إتلاف طرف الاستشعار. أيضا، بعد الإماهة، لا ينبغي أن يتعرض أجهزة الاستشعار في الهواء لأكثر من 20 ثانية. مطلوبة التسجيلات الضوضاء المنخفضة للكشف بنجاح الإشارات البيولوجية في الأنسجة. لهذا الغرض، لا بد من الجدول الهواء المختبر عالية الأداء وأسس الكهربائية المناسب. إضافة الكميات الدقيقة لتحليلها الدرجي الخطوات المعايرة هو ضروري لدقة تحديد تركيز في التجارب. وتحقيق المقاصة جيدة في الكلى في الجسم الحي السابقين جراحات الكلى يؤدي إلى التسجيلات الناجحة. استخدام الإنزيمات آبيراز والكاتالاز في المعايرة والتجارب يسمح لتقييم استشعار حساسية غير محددة ويؤكد القياسات. هذه البروتوكولات توفر تتعزز بشكل كبير من التفصيل من إشارات الخلية في الكلى. تحسن الحساسية والدقة الزمنية التي تتيحها أجهزة الاستشعار قد تسمح لنا لحل التغييرات في ATP يشير في الحالات المرضية وبعد التلاعب الدوائية التي كانت غير قابلة للكشف في وقت سابق. بروتوكول في الجسم الحي هو مناسب تماما للدراسات فسيولوجية معقدة في حين خارج الجسم الحي هو الأمثل لدراسة التطبيقات الدوائية على الكلى. تصميم أجهزة الاستشعار في الجسم الحي المستخدمة هنا يمكن مقاومة غير مسبوقة ضد التدخل في BLالعود-perfused الأنسجة. مجتمعة، هذه المجسات توفر كمية كبيرة من التطبيقات التي كانت في السابق غير ممكن مع البروتوكولات والتقنيات الموجودة.

وكانت أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمي (المشار إليها أيضا باسم أجهزة الاستشعار في هذا المخطوط) أداة قيمة لدراسة العمليات الإشارات الحيوية في الخلايا والأنسجة الحية. أجهزة الاستشعار بتوفير المزيد من قرار الزمني والمكاني من الخلايا الجزيئات يشير في تركيزات ذات الصلة من الناحية البيولوجية. بدلا من أخذ العينات وتحليل سوائل خارج الخلية التي اتخذت في فترات على مدى فترات طويلة من الزمن، هذه المجسات تستجيب بالسرعة تتفاعل الانزيمات لتحليلها، وبالتالي إنتاج قياسات الوقت الحقيقي 1،2. كشف سريع من تركيزات فراغي من العوامل autocrine ونظير الصماوي، مثل البيورينات أو بيروكسيد الهيدروجين، وديناميات الإفراج عنهم يمكن استخدامها لإنشاء لمحة عن آثار المخدرات في الظروف العادية والمرضية 3. حاليا، كانت الغالبية العظمى من التطبيقات التي تستخدم أجهزة الاستشعار في الدماغ شرائح الأنسجة والثقافات خلية 4-10. البروتوكولات بالتفصيل في هذا الهدف مخطوطة لوضع الوسائل لقياس تركيزات بدقة في الوقت الحقيقي من التحاليل في الكلى كلها. وقد وضعت البروتوكولات التالية لدراسة ATP الخلالي وH 2 O 2 الإشارات في الكلى. في البيئة المحلية في الكلى، وcatabolized خارج الخلية ATP بسرعة عن طريق ectonucleotidases الذاتية إلى مشتقاته (ADP، AMP والأدينوزين). أجهزة الاستشعار المستخدمة هنا هي انتقائية للغاية إلى ATP على البيورينات أخرى أو ATP منتجات التحلل 11. وهذا يوفر ميزة كبيرة لأنها تتيح رصد دقيق لتركيزات ثابتة وديناميكية الإفراج ATP وظيفة إشارات لها. يتم قياس تركيز ATP الخلالي باستخدام مزيج من اثنين من الميكروية، جهاز استشعار ATP وجهاز استشعار لاغية. جهاز استشعار لاغية في تركيبة مع تطبيقات الكاتالاز قادر على كشف الخلالي H 2 O 2 تركيزات 12. البروتوكولات التالية تستخدم اثنين من تصاميم مختلفة من الحرفيRS التي لها خصائص الأمثل إما خارج الجسم الحي أو في التطبيقات الجسم الحي. وتقوم كل من التصاميم على تفاعل محفز متتابعة من كيناز الجلسرين والجلسرين أوكسيديز-3-فوسفات الواردة في طبقة استشعار الأنزيمية وتحركها من وجود ATP. في مجموعة من أجهزة الاستشعار المستخدمة في السابق الدراسات المجراة، H 2 O 2، وناتج التفاعل الأنزيمي النهائي، تم الكشف عنها بواسطة الأكسدة على البلاتين / الايريديوم (PT-IR) سلك كهربائي. أجهزة استشعار للدراسات في الجسم الحي وتقوم بدلا من ذلك على H 2 O 2 تخفيض على الوسيط الذهب المطلي القطب مصممة للالأنسجة perfused الدم. هو مبين في الشكل رقم 1 هو مخطط كل من البروتوكولات المذكورة في هذه المخطوطة. جهاز استشعار لاغية مطابق لالمقابل استشعار ATP لها إلا أنها تفتقر إلى الانزيمات ملزمة. لذلك، بالإضافة إلى الكشف عن H 2 O 2 مع إنزيم الكاتلاز، والشرق الأوسط وأفريقيا استشعار لاغيةسورس التدخلات غير محددة. يتم حساب تركيزات ATP عن طريق طرح الكشف عن اغية التدخلات غير محددة وخلفية H 2 O 2 من إشارة استشعار ATP. العديد من أجهزة الاستشعار وتتوفر أيضا تجاريا للكشف عن التحاليل الأخرى بما في ذلك الأدينوزين، ionosine، هيبوزانتين، أستيل كولين، الكولين، الصوديوم، الجلوكوز، اللاكتات، د-سيرين للخارج الحي التطبيقات أو الأدينوزين، ionosine، وهيبوزانتين في الجسم الحي عندما يقترن اغية المقابلة أجهزة الاستشعار. قدرة جهاز استشعار للكشف عن أدق التحاليل تتوقف على ما قبل السليم والمعايرة ما بعد 13. وهذا يضمن أن التحليل يمثل الانجراف في حساسية الاستشعار التي تحدث أثناء الاستخدام في الأنسجة البيولوجية. أجهزة الاستشعار يحمل مستودع من الجلسرين الذي يتم استخدام كاشف في التفاعلات الأنزيمية الاستشعار. إذا لم يتم استخدام أجهزة الاستشعار في حلول حمام تحتوي على الجلسرين، وسوف تزول مع الزمن. أقصر صمرات تسجيل مفيدة ضرورية للحد من انجراف استشعار ذلك الحين. استشعار بالإضافة إلى ذلك قاذورات التي كتبها البروتياز الذاتية وشظايا البروتين يمكن أن يقلل كثيرا من حساسية من أجهزة الاستشعار 14. المخطوطة الحالية تنص على استخدام أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمية للخارج الحي والاستعدادات الكلى الجسم الحي. يوفر في الوقت الحقيقي تحليلها الكمي بتفاصيل غير مسبوقة من الإشارات الخلوية التي قد تكشف عن رؤى جديدة في آليات أمراض الكلى وكلاء الدوائية.

<table><tbody><tr><td>Sensor Kit</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.&amp;nbsp; Also included with the kit is the user&#039;s choice of sensors.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissaprobe null sensor 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissagold null sensor 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Manual</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf&quot;&gt;http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Faraday cage&amp;nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual channel potentiostat</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Type II Faraday cage</td></tr><tr><td>Data acquisition program</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Model R99E</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic illuminator</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>air table</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane ventilator</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 ml petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>needle</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26-30 G</td></tr><tr><td>pins</td><td></td><td></td><td>Standard dissection pins</td></tr><tr><td>catheter</td><td></td><td></td><td>Polyethylene tubing (PE50)</td></tr><tr><td>catheter tissue glue</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>suture</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>rubber bands</td><td></td><td></td><td>any 2-4 mm wide rubber bands</td></tr><tr><td>silicone</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Clear 1#</td><td></td></tr><tr><td>clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>standard dissection kit</td><td></td><td></td><td>Kit should include scalpel and dissection sissors&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kidney Cup</td><td></td><td></td><td>Of own design</td></tr><tr><td>standard chemicals</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM ATP solution</td></tr><tr><td>hydrogen peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>inactin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>ketamine</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney

وقد استخدمت على نطاق واسع أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمية لقياس إشارات الخلية في الوقت الحقيقي. أكثر من استخدامها قد اقتصر على شرائح الدماغ والخلايا العصبية الثقافات. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطبيق هذه التكنولوجيا إلى الأجهزة كلها. وقد أحرز تقدم في تصميم أجهزة الاستشعار ممكن قياس الإشارات الخلوية في الكلى في الجسم الحي perfused الدم. تسرد البروتوكولات الحالية الخطوات اللازمة لقياس ATP وH 2 O 2 الإشارات في الخلالي الكلى الفئران. وتستخدم تصميمين استشعار منفصلة للخارج الحي والبروتوكولات الجسم الحي. والمغلفة كلا النوعين من أجهزة الاستشعار مع biolayer الأنزيمية رقيقة فوق طبقة permselectivity لإعطاء الاستجابة بسرعة، أجهزة الاستشعار الحساسة وانتقائية. طبقة permselectivity يحمي إشارة من interferents في الأنسجة البيولوجية، وطبقة الأنزيمية تستخدم للتفاعل محفز متتابعة من كيناز الجلسرين والجلسرين-3-فوسأوكسيديز الفوسفات في وجود ATP لإنتاج H 2 O 2. مجموعة من أجهزة الاستشعار المستخدمة في السابق الدراسات المجراة الكشف عن مزيد من تحليلها عن طريق أكسدة H 2 O 2 على البلاتين / الايريديوم (PT-IR) سلك كهربائي. أجهزة الاستشعار للدراسات في الجسم الحي وتقوم بدلا من ذلك على الحد من H 2 O 2 على الوسيط الذهب المطلي القطب مصممة للالأنسجة perfused الدم. تم الكشف عن التغييرات تركيز النهائية amperometry الوقت الحقيقي تليها معايرة لتركيزات معروفة من تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، خصوصية إشارة amperometric يمكن التأكد من خلال إضافة الانزيمات مثل الكاتلاز وآبيراز التي كسر H 2 O 2 و ATP تبعا لذلك. هذه المجسات أيضا تعتمد بشكل كبير على المعايرة دقيقة قبل وبعد كل تجربة. البروتوكولات التاليين تضع دراسة كشف في الوقت الحقيقي من ATP وH 2O 2 في أنسجة الكلى، ويمكن تعديل أيضا على تمديد الطريقة الموصوفة لاستخدامها في المستحضرات البيولوجية الأخرى أو الهيئات كلها.

تصميم مسرى مكروي جهاز الاستشعار البيولوجي الأنزيمية يسمح للكشف في الوقت الحقيقي من التحاليل في الكلى كلها. ويتضح تصميم تجربة العام إما خارج الجسم الحي أو الدراسات المجراة في الشكل 1. وأجهزة الاستشعار المستخدمة وتختلف الإجراءات الجراحية اعتمادا على ما إذا كانت الدراسة هو الجسم الحي السابقين أو في الجسم الحي. للحصول على نتائج قابلة للتكرار، ما قبل دقيقة والمعايرة ما بعد حاسمة. ويبين الشكل 6A أثر التمثيل في إشارة يرى من خارج الحي استشعار ATP خلال المعايرة. لاحظ أن آبيراز بسرعة القضاء على إشارة ATP. كان الكاتالاز أي تأثير على إشارة ATP ويدل على خصوصيته إلى H 2 O 2 يخلق (الشكل 6B). تنتج إجراء المعايرة نوبة الخطي الذي يستخدم لحساب التغيرات الدينامية من ATP (6A الشكل، اللوحة اليمنى). وفي السادسفو معايرة أجهزة الاستشعار تنتج أي أثر مماثلة لتلك التي لاستشعار خارج الحي. ومع ذلك، فإن هذا الاستشعار بالكشف عن التخفيض بدلا من التيارات المؤكسدة وعلى هذا النحو التيار ينتج سالبة. معايرة هذه المجسات كما تنتج نوبة الخطي في مجموعة ،3-80 ميكرومتر (الشكل 7A اللوحة اليمنى). وأظهرت خصوصية في الجسم الحي استشعار لاعبي التنس المحترفين على المنتجات البيورين أخرى في الشكل 7B. النهج وصفها هنا يسمح لنا بقياس المستويين القاعدية من المواد المحلية والتغيرات الحادة ردا على ضخ المخدرات 12. هو مبين في الشكل 11 لانج التغيرات في تركيز الذاتية الخلالي من H 2 O 2 في الفئران المقاومة للملح وحساسية للملح II التي يسببها. لهذه التجارب، تم perfused الكلى المعزولة حديثا من سبراج داولي (SD) أو دال (SS) الفئران حساسية للملح مع 1 ميكرومتر انج الثاني تحت تدفق الصفحي ثابت (650 ميكرولتر / دقيقة). كما SHOسفل في الشكل 11، آنغ II الحث على الافراج حاد في H 2 O 2 في الكلى من كلا SD والجرذان SS. ومع ذلك، فإن السعة القصوى لكل استجابة ومرتفعة بشكل ملحوظ في الفئران SS، وخصوصا عندما تم تغذية الحيوانات مع اتباع نظام غذائي الملح العالية 12. هو مبين في الشكل (12) هو تطبيق التمثيل في أجهزة الاستشعار في الجسم الحي. ضخ الكاتالاز (5 ميكروغرام / مل) تماما كتل H 2 O 2 إشارة الكشف عنها بواسطة جهاز الاستشعار البيولوجي. وتوضح هذه التجارب على استخدام أجهزة الاستشعار الأنزيمية محددة جنبا إلى جنب مع تقنية amperometric للكشف عن مستويات القاعدية من المواد المحلية والقياسات في الوقت الحقيقي من إطلاق سراحهم ردا على التدخل الدوائي. التطبيقات الأخرى لهذا النهج لدراسة دور الإشارات purinergic وبيروكسيد الهيدروجين وتحسين معرفتنا وفهمنا من أمراض الكلى مثل حساسية للملح وارتفاع ضغط الدم، ثور الكلويالإجهاد idative وأمراض الكلى المزمنة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig1.jpg" /> يتم الشكل 1. تخطيطي من البروتوكولات. معايرة مع تحليلها من الفائدة واختبار خصوصيته مباشرة قبل بدء التجارب. وينبغي أن يتبع البروتوكول في الجسم الحي للتجارب الفسيولوجية المعقدة والجسم الحي السابقين للتطبيقات الدوائية. وينبغي أن يتم معايرة آخر تجربة وأخذها بعين الاعتبار خلال تحليل البيانات. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig2.jpg" /> الرقم 2. الأنزيمية مسرى مكروي الاستشعار، واثنين<html> وتظهر أحجام الاستشعار المستخدمة في تطبيقات خارج الحي، 50 ميكرون و 125 ميكرون الأقطار. كل سلك استشعار يمتد إلى أنبوب شعري للاتصال موصل نهاية الذهب (لا يظهر). يظهر أقحم تلميح استشعار المغلفة مع الانزيمات لكشف ATP. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig3.jpg" /> الرقم 3. مزدوجة القناة Potentiostat. القنوات potentiostat المسمى CH1 CH2 و. 1) CH1 الاتصال استشعار ATP و 2) CH2 وخالية استشعار اتصال 3) الاتصالات التي تقترن كهربائيا إلى القطب المرجعية. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html> الحمار = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig4.jpg" /> الرقم 4. إعداد أجهزة الاستشعار. يتم تنفيذ الحصول على البيانات في قفص فاراداي للحد من الضوضاء الكهربائية وعلى طاولة المختبر عالية الأداء لسطح عمل خالية من الاهتزاز. 1) يستخدم جدول الجراحية التي تسيطر عليها درجة الحرارة إلى الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان خلال التجارب الفسيولوجية 2) هي التي تعلق على micromanipulators لمحولات تصاعد المغناطيسي لتحديد المواقع مرونة من أجهزة الاستشعار خلال التجربة 3) وهناك حاجة إلى مصدر الضوء عن العمليات الجراحية وأجهزة الاستشعار الإدراج 4 ) قناة مزدوجة potentiostat 5) حامل لأجهزة الاستشعار. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> p_upload / 53059 / 53059fig5.jpg &quot;/&gt; الرقم 5. voltammetry دوري للحصول على الدراسات المجراة سابقا، ويجري استشعار voltammetry دوري لمدة 10 دورات بين -0.5 و 0.5 V قبل بروتوكول المعايرة. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig6.jpg" /> الرقم 6. Amperometry معايرة للفيفو السابقين. (A) تستخدم المعايرة إضافة تركيزات ATP المعروفة في حل الحمام. المقابلة القيم amperometric المسجلة على مستوى الخط المقارب (تتبع الأسود). التيارات الحصول على خلق معادلة المعايرة. يظهر مثال على اللوحة اليمنى. تتبع الأحمر هو كوريهالإقليم الشمالي من أجهزة الاستشعار لاغية الذي يستجيب فقط إضافة H 2 O 2. يتم معايرة (B) مستشعر لاغية مع إضافة المعروف H 2 O 2 تركيزات (الأسهم الحمراء) إلى حل حمام والخطوط المقاربة تسجل القيم amperometric (الأسهم السوداء رقيقة). إضافة الكاتالاز إلى حل حمام (السهم الاسود الكثيف) النتائج في تسوس الحالي السريع. وتظهر اللوحة اليمنى خالية المعادلة معايرة أجهزة الاستشعار. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم، الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig7.jpg" /> الرقم 7. Amperometry معايرة ل؛ تتم في فيفو معايرة في الجسم الحي أقطاب بطريقة مماثلة لتلك التي تفصيلا في السابق الدراسات المجراة باستثناء ردود الفعل تخفيض تسبب عكس الحالي (القطبية). (A) إضافة تركيزات ATP المعروف تنتج تيار amperometric على استشعار ATP (تتبع الأسود) ولكن ليس له تأثير على استشعار لاغية (تتبع الأحمر). إضافة آبيراز يسقط التيار من أجهزة الاستشعار ATP. وأكد (B) خصوصية من أجهزة الاستشعار ATP من خلال إضافة 10 ميكرومتر وكلاء مختلفة purinergic (UTP، UDP والأدينوزين). مزيد من التطبيقات ATP توفر تيار amperometric اكتشاف مستقر. (C) صورة مجهرية من أجهزة الاستشعار في الجسم الحي على أساس الوسيط الذهب المطلي الكهربائي. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا فيقو</a>إعادة. <img alt="الرقم 8" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig8.jpg" /> الرقم 8. الكؤوس الكلى. وفي دراسات في الجسم الحي، وتعقد الكلى لا تزال تستخدم المقاوم للصدأ أكواب الكلى الصلب هو مبين. تستخدم بمرتين من الكؤوس لاستيعاب الكلى الحجم. هذه الكؤوس تقلل من القطع الأثرية الحركة التي تم إنشاؤها بواسطة التنفس الحيوان. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig9.jpg" /> الرقم 9. فيفو السابقين الكلى معزولة وPerfused. يتم وضع الكلى معزولة في طبق 1) بتري المغلفة مع سي سميكةأسفل licone لدبوس الإدراج 2) ومقنى الشريان الكلوي وتعلق على ضخ حقنة لنضح المستمر خلال التجربة 3) جهاز استشعار ATP، 4) وأجهزة الاستشعار لاغية تندس في الكلى 5) يوضع القطب المرجع بالقرب من الكلى المغمورة في حل حمام. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig9large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 10" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig10.jpg" /> الرقم 10. في فيفو الدم الكلى Perfused. (A) تتعرض الكلية اليسرى ووضعها في كوب الكلى، يبقى الكلية اليمنى سليمة داخل الحيوان. يتم إدراج كل من أجهزة الاستشعار في الكلى. هي التي غرست كلوريد الصوديوم عن طريق الوريد الوداجي القثطار لمواجهة تسببت في فقدان السوائل ب: BSAذ تندس كبير خط منتصف شق (B) مثال من التجربة في الجسم الحي مع القسطرة الخلالي زرع للتطبيقات الدوائية مباشرة 1) يقام الكلى بنسبة فنجان الكلى 2) استشعار ATP 3) جهاز استشعار لاغية و4) القطب المرجعي إلى السطح البطني في الكلى 5) القسطرة زرعها في الكلى وتعلق على مضخة تحوي للدفعات الدوائية الصفحي. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig10large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم، الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 11" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig11.jpg" /> الرقم 11. مثال تحليل فيفو من H 2 </<html> فرعية&gt; O 2 في الكلى. يسبب انج II نضح H 2 O 2 الافراج في قشرة الكلى الفئران. (A) التغييرات في الوقت الحقيقي للمتوسط ​​H 2 O 2 تركيز (تظهر القضبان الرمادية الخطأ المعياري) من إجمالي N = 8 تطبيقات (4 الكلى من 4 الفئران مختلفة). الحانات على رأس تمثل تطبيق انج II. (ب) H أقصى 2 O 2 قيم تركيز السعة خلال نضح انج الثاني للسبراغ داولي (SD) ودال حساسية للملح (SS) الفئران التي تغذت على وجبات منخفضة وعالية الملح، على التوالي. * - P &lt;0.05 مقابل الفئران SD. ويتم تكييف هذا الرقم من 12 إشارة بإذن. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig11large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> /files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg &quot;/&gt; الرقم 12. وفي تحليل فيفو من H 2 O 2. مثال للتقييم في الجسم الحي من خلالي H 2 O 2 تركيز في النخاع من الفئران SS تغذية اتباع نظام غذائي منخفض الملح (كما هو موضح في الشكل 10B). أنتجت تطبيق الخلالي من الكاتالاز عن طريق القسطرة زرع للفاصل 5 دقائق حصار كامل للH 2 O 2 في إشارة إلى النخاع الكلوي. الحد من الكاتلاز، من فشل من قبل تدفق الدم الكلوي، أدى إلى انتعاش جزئي للإشارة، الذي تم حظره مرة أخرى عن طريق تطبيق الكاتالاز إضافي (10 دقيقة). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53059/53059fig12large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney at JoVE.com

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

استخدام الأنزيمية أجهزة الاستشعار لقياس الذاتية ATP أو H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; في الكلى

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

use-enzymatic-biosensors-to-quantify-endogenous-atp-or-h2o2

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

11.8K Views.  Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney. 

Video: Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

التصوير النهج لإجراء تقييمات للسمية الأكسدة باستخدام أجهزة استشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Cancer Research

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

قياس متزامنة من بيروكسيد الهيدروجين فائق أكسيد/وإنتاج NADH Dehydrogenases المتقدرية المحتوية على فلافين

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Biochemistry

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell death. These processes affect and are affected by the redox status of and ATP production by mitochondria. Here, we describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors that can detect mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells. Mitochondrial redox state is measured using redox-sensitive Green Fluorescent Protein (roGFP) that is targeted to the mitochondrial matrix. Mito-roGFP contains cysteines at positions 147 and 204 of GFP, which undergo reversible and environment-dependent oxidation and reduction, which in turn alter the excitation spectrum of the protein. MitGO-ATeam is a F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) probe in which the &epsilon; subunit of the FoF1-ATP synthase is sandwiched between FRET donor and acceptor fluorescent proteins. Binding of ATP to the &epsilon; subunit results in conformation changes in the protein that bring the FRET donor and acceptor in close proximity and allow for fluorescence resonance energy transfer from the donor to acceptor.

We describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors, which are based on GFP, to monitor mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells.

أجهزة الاستشعار التي تقيس Ratiometric الدولة الأكسدة الميتوكوندريا وATP في الخلايا الحية الخميرة

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Bioengineering

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensors للكشف عن حوزتي النشاط في فيفو لتشخيص موسع

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

والأحيائي بسيط لتقييم العوامل الأوعية الدموية غشائي النمو

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

قياس<em&gt; في المختبر</em&gt; أتباز آخر لالأنزيمية توصيف

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Identification of the Source of Secreted Proteins in the Kidney by Brefeldin A Injection

Chronic kidney disease (CKD) is one of the top ten leading causes of death in the USA. Acute kidney injury (AKI), while often recoverable, predisposes patients to CKD later in life. Kidney epithelial cells have been identified as key signaling nodes in both AKI and CKD, whereby the cells can determine the course of the disease through the secretion of cytokines and other proteins. In CKD especially, several lines of evidence have demonstrated that maladaptively repaired tubular cells drive disease progression through the secretion of transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), connective tissue growth factor (CTGF), and other profibrotic cytokines. However, identifying the source and the relative number of secreted proteins from different cell types in vivo remains challenging.
This paper describes a technique using brefeldin A (BFA) to prevent the secretion of cytokines, enabling the staining of cytokines in kidney tissue using standard immunofluorescent techniques. BFA inhibits endoplasmic reticulum (ER)-to-Golgi apparatus transport, which is necessary for the secretion of cytokines and other proteins. Injection of BFA 6 h before sacrifice leads to a build-up of TGF-&#946;, PDGF, and CTGF inside the proximal tubule cells (PTCs) in a mouse cisplatin model of AKI and TGF-&#946; in&#160;a mouse aristolochic acid (AA) model of CKD. Analysis revealed that BFA + cisplatin or BFA + AA increased TGF-&#946;-positive signal significantly compared to BFA + saline, cisplatin, or AA alone. These data suggest that BFA can be used to identify the cell type producing specific cytokines and quantify the relative amounts and/or different types of cytokines produced.

Identifying the cell type responsible for secreting cytokines is necessary to understand the pathobiology of kidney disease. Here, we describe a method to quantitatively stain kidney tissue for cytokines produced by kidney epithelial or interstitial cells using brefeldin A, a secretion inhibitor, and cell-type-specific markers.

Chronic kidney disease (CKD) is one of the top ten leading causes of death in the USA. Acute kidney injury (AKI), while often recoverable, predisposes ...

تصوير بيروكسيد الميتوكوندريا في خلايا الخميرة الحية باستخدام mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أبحاث الميتوكوندريا - mtHyper7 Biosensor للتحليل تحت الخلوي 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

تصوير mtHyPer7 ، وهو مستشعر حيوي نسبي لبيروكسيد الميتوكوندريا ، في خلايا الخميرة الحية

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

استخدام الأنزيمية أجهزة الاستشعار لقياس الذاتية ATP أو H

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video