Name: atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers
Uploaded: 2015-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك، والمركز الألماني لأبحاث السرطان، وجامعة توبنغن، وBundesministerium FÜR Bildung اوند Forschung (منح رقم 0312040). نشكر ادوارد هيرمان لمساعدتنا أتمتة تحليل البيانات منحنى القوة والدكتور جاكوب Suckale للقراءة متأنية لهذه المخطوطة.

<ol>
	<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscope.">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).</li><li>Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Tunneling+Microscopy+and+Atomic+Force+Microscopy:+Application+to+Biology+and+Technology.">Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology.</a> Science. 242, 209-216 (1988).</li><li>Gaczynska, M., Osmulski, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+of+biological+complexes:+What+can+we+learn.">AFM of biological complexes: What can we learn.</a> Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).</li><li>Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -. C., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+for+structure+and+dynamics+of+biomembranes.">AFM for structure and dynamics of biomembranes.</a> BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).</li><li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+A+Nanotool+in+Membrane+Biology.">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).</li><li>Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F., Bar&#243;, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. , (2012).</li><li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supported+lipid+bilayers:+From+biophysical+studies+to+sensor+design.">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li><li>Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+of+Biological+Membranes.">Atomic Force Microscopy of Biological Membranes.</a> Biophys. J. 96, 329-338 (2009).</li><li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Solid-Supported+Lipid+Bilayers+by+Spin-Coating.">Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li><li>Raviakine, I., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Supported+Phospholipid+Bilayers+from+Unilamellar+Vesicles+Investigated+by+Atomic+Force+Microscopy.">Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy.</a> Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).</li><li>Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+AFM+and+Two-Focus+SFCS+Study+of+Raft-Exhibiting+Model+Membranes.+.">Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. .</a> ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).</li><li>Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+effects+on+membrane+structure+and+dynamics.">Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics.</a> Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).</li><li>Dom&#232;nech, &. #. 2. 1. 0. ;., Sanz, F., Montero, M. T., Hern&#225;ndez-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+structural+study+of+the+main+phospholipid+components+comprising+the+mitochondrial+inner+membrane.">Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane.</a> BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).</li><li>Dom&#232;nech, &. #. 2. 1. 0. ;., Morros, A., Caba&#241;as, M. E., Teresa Montero, M., Hern&#225;ndez-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+from+hexagonal+phases.">Supported planar bilayers from hexagonal phases.</a> BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+line+tension+on+the+lateral+organization+of+lipid+membranes.">Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes.</a> J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).</li><li>Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+on+Supported+Lipid+Bilayers:+Effect+of+Temperature+and+Sample+Preparation.">Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation.</a> Biophys. J. 103, 38-47 (2012).</li><li>Butt, H. -. J., Franz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rupture+of+molecular+thin+films+observed+in+atomic+force+microscopy+I.+Theory.">Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory.</a> Physical Review E. 66, 031601 (2002).</li><li>Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Temperature+on+the+Nanomechanics+of+Lipid+Bilayers+Studied+by+Force+Spectroscopy.">Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy.</a> Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).</li><li>Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raft+domain+reorganization+driven+by+short-+and+long-chain+ceramide:+a+combined+AFM+and+FCS+study.">Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study.</a> Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).</li><li>Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+spectroscopy+as+a+tool+to+investigate+the+properties+of+supported+lipid+membranes.">Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes.</a> Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+Formation+by+a+Bax-Derived+Peptide:+Effect+on+the+Line+Tension+of+the+Membrane+Probed+by+AFM.">Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM.</a> Biophys. J. 93, 103-112 (2007).</li><li>Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+future+of+scanning+probe+microscopy:+Combining+atomic+force+microscopy+with+other+surface-sensitive+techniques,+optical+microscopy+and+fluorescence+techniques.">The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques.</a> Nanoscale. 1, 40-49 (2009).</li><li>Simons, K., Vaz, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+Systems,+Lipid+Rafts,+and+Cell+Membranes1.">Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1.</a> Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).</li><li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafts+defined:+a+report+on+the+Keystone+symposium+on+lipid+rafts+and+cell+function.">Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function.</a> The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).</li><li>Kahya, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Lipid+Mobility+of+Raft-exhibiting+Model+Membranes+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy.">Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome:+classification,+preparation+and+applications.">Liposome: classification, preparation and applications.</a> Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).</li><li>Butt, H. -. J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+thermal+noise+in+atomic+force+microscopy.">Calculation of thermal noise in atomic force microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li><li>Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids.">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).</li><li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).</li><li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).</li><li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging.">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li><li>Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides.">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li><li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration.">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li><li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes.">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li><li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration.">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li><li>Rigaud, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

SLBs تتألف من DOPC: SM: تشول (2: 2: 1) تشكلت على الميكا بعد الامتزاز الحويصلة وتمزق الناجمة عن كلوريد الكالسيوم. هذه التركيبة الدهنية فصل إلى L د وL س مراحل. وأثرى مرحلة L س في سفينغوميالين والكوليسترول وأقل السائل / أكثر لزوجة (الشكل 1A) من د مرحلة L 11. فصل L س من L د المرحلة يظهر هياكل دائرية كما ارتقى فوق المحيطة بها (الشكل 1B، C). منصات هي س مراحل L محاطة L د مراحل. وينظر إلى عيوب غشاء (أو ثقوب في غشاء) أيضا (الشكل 1B، السهم الأزرق) ونبذة ارتفاع عبر هذا العيب يظهر سمك طبقة ثنائية. ويمكن أيضا أن يتم فحص L د / L س فرق الارتفاع من خلال النظر في ملف تعريف ارتفاع AFM (الشكل 1C). إعداد الدهونخليط مهم جدا كما يحدد تكوين خصائص طبقة ثنائية. أثناء إعداد طبقة ثنائية المعتمدة، فمن المهم للعمل في درجات الحرارة وأشار إلى تشكيل السليم للمراحل الدهون (الخطوة 1.4.5). أثناء التصوير، والحفاظ على قوة منخفضة مهم جدا حتى لا تدمر طبقة ثنائية ولا تتراكم الأوساخ على معلومات سرية. بعد AFM التصوير، ويتم اختيار مناطق SLB وسبر استخدام القوة الطيفي. التحليل الطيفي قوة يسمح لنا للتحقيق خصائص أخرى للغشاء، وتحديدا قوة اختراق (1D الشكل). وL د وL س مراحل تظهر قوة اختراق مختلفة وسمك (الشكل 1E، F). وتتلخص الخصائص في الجدول 1. ونلاحظ أنه بالمقارنة مع Chiantia وآخرون 11، تم الحصول على قيم مماثلة لقوة اختراق في د مرحلة L لكن انخفاض قيمة للمرحلة L س. هذا يمكن أن يكوننظرا لكميات أقل من الكولسترول المستخدمة في الأغشية لدينا (كنا DOPC: SM: نسبة تشول 2: 2: 1، في حين أنها تستخدم من 1.5: 1.5: 1). وهذا يدل أيضا على أهمية خلط نسبة الدهون الصحيحة - عاملا حاسما في استنساخ النتائج. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام الدهون المختلفة (طول السلسلة، ودرجة التشبع) أيضا إلى تغيير خصائص طبقة ثنائية 6،15،18. بينما بالتآمر توزيع القوات اختراق مفيد ويمكن أن تظهر بالفعل اختلافات في خصائص طبقة ثنائية، مزيدا من التحليل لتوزيع قوة اختراق يمكن استخدامها لاستخلاص الخواص الميكانيكية الأخرى بما في ذلك خط التوتر ونشر ضغط 11،17،21. لفترة وجيزة، وصفت الاحتمالات، P (F) لقياس قوة اختراق معينة، F، من خلال التواصل التنوي نموذج 11،15،17: <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/52867/52867eq1.jpg" /> حيث A هو ريسوناتردد الامتحانات التنافسية الوطنية للتعزية، K هو ثابت ربيع ناتئ، والخامس هو سرعة هذا النهج، Γ هو التوتر خط (الطاقة حافة المطلوبة للحفاظ على ثقب في غشاء مفتوح)، R هو نصف قطر AFM تلميح، ك B هو ثابت بولتزمان، T هو درجة الحرارة، وS هو الضغط نشر أو الطاقة المصاحبة لإغلاق ثقب (عكس التوتر الغشاء - الطاقة اللازمة لأن تمارسها الغشاء لفتح ثقب 32). هذه المعادلة يمكن أن تكون متكاملة ويمكن حساب موانئ دبي / DF على النحو التالي: <img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/52867/52867eq2.jpg" /> A، K، R هي خصائص AFM ناتئ / غيض التي يمكن الحصول عليها من خلال ناتئ المعايرة. T والخامس معلمات التجريبية التي يجب أن تبقى ثابتة طوال التجارب. موانئ دبي / DF ثم يتم تركيبها على الرسم البياني للحصول على خط التوتر والضغط الانتشار. كما تؤثر على العديد من المعلمات P (F)، من experiوينصح mentalists استخدام نصائح مماثلة وشروط اكتساب لقيم قابلة للمقارنة لخط التوتر والضغط الانتشار. التلوث من طرف AFM (بما في ذلك التراب والحويصلات غير مدمجة على طرف المكتسبة أثناء التصوير) يؤدي إلى نتائج غير قابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، واختيار من الدعم يؤثر على الخواص الميكانيكية للغشاء 20. أسلوب آخر يمكن أن تميز الخواص الميكانيكية للدهن طبقة ثنائية هي تطلع micropipette حويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) 33. في هذه التقنية، يتم احتساب التوتر غشاء من تشوه GUVs خلال الطموح. وعلاوة على ذلك، من خلال زيادة شفط، يمكن للمرء حساب التوتر الذي تصدعات GUV (أو تحلل التوتر) 34، والتي يمكن أن تكون ذات صلة خط التوتر في نموذج التواصل التنوي. عيب واحد من هذه التقنيات هو تعقيد حساب التوتر غشاء للتخلص فصل الأغشية، كما فا مختلفةسيس لها خصائص ميكانيكية مختلفة 35. هذا هو على النقيض من AFM قوة التحليل الطيفي، حيث يمكن وصفها مراحل على حدة. وعلاوة على ذلك، في حين أن هناك حاجة إلى العديد من GUVs لتحقيق نتائج ذات الصلة إحصائيا، يمكن للAFM إنتاج توزيع واحد في SLB. ومع ذلك، غشاء إعادة عرض الآثار (على سبيل المثال، tubulation والانغلافات) وتصور بسهولة أكبر مع GUVs، مما يجعلها نظم أفضل لوصف هذه الآثار المتعلقة الشكل جنبا إلى جنب مع الخواص الميكانيكية. في تطبيقات أخرى لدراسة آثار بروتينات الغشاء على خصائص طبقة ثنائية، فمن الممكن ادراج تنقية البروتينات في هذه الحويصلات لجعل proteoliposomes. أسلوب واحد للقيام بذلك تستخدم المنظفات لمساعدة البروتينات لتحقيق الاستقرار وإدراجها في الغشاء. تنقية اللاحقة عن طريق الغسيل الكلوي أو حجم الاستبعاد اللوني يزيل البروتينات حرة والمنظفات في حل 36. نهج آخر يتطلب وضع علامات علىفي تنقية البروتينات (على سبيل المثال، الحامض الأميني أو ستربتافيدين العلامات) وتتضمن شركاء تقارب لهذه العلامة في الجسيمات الشحمية (مع حامض والنيكل nitriloacetic (ني NTA) أو الدهون المعقدة البيروكسيديز). باختصار، وصفنا أسلوبا لتحليل طبقات ثنائية الدهون. بسبب عالية الدقة، ويمكن AFM تكشف عن هياكل ميكرومتر الفرعي في الغشاء، والتي تشمل مراحل الدهون وغيرها. التحليل الطيفي القوة، وهنا يستخدم لوصف الأغشية الدهنية، ويمكن أن تستخدم أيضا على بروتينات الغشاء والجزيئات الحيوية الأخرى على الغشاء.

قوة الذرية المجهر (AFM) يولد صورة لسطح عن طريق المسح الضوئي عبر منطقة من العينة باستخدام ناتئ مع طرف حاد جدا 1. حركة ناتئ المسابير طوبولوجيا سطح العينة. وقد تم تطبيق AFM على نطاق واسع لجزيئات البيولوجية - بما في ذلك البروتينات والحمض النووي، والأغشية، نظرا لتنوعها في تحليل عينات الثابتة في الهواء أو دولة شبه الأم في السائل 2-5. وبصرف النظر عن قدرتها التصوير عالية الدقة في نطاق نانومتر، يعمل ناتئ AFM بمثابة ربيع للتحقيق القوات التفاعل (التصاق والتنافر) والخواص الميكانيكية للعينة 5،6. هذا هو المعروف باسم قوة التحليل الطيفي. في هذا الوضع، وتحقيق نهج أول العينة ويمارس قوة على ذلك، ومن ثم تراجع حتى أنه يفقد الاتصال مع العينة (الشكل 1A). تظهر منحنيات ولدت القوة كدالة للمسافة ناتئ لكل من التطبيقصرصور وتراجع. العديد من الخصائص بما في ذلك معامل المرونة لقياس صلابة من المواد، وقوات التصاق يمكن أن تستمد. طبقات ثنائية الدهون المعتمدة هي الأغشية البيولوجية نموذج الكذب على رأس دعم قوي - عادة الميكا، والزجاج البورسليكات، السيليكا تنصهر فيها، أو المؤكسد السيليكون 7. انهم مستعدون باستخدام تقنيات مختلفة مثل ترسب حويصلة، طريقة انجميور-بلودجيت وتدور طلاء 8،9. وقد استخدم التصوير AFM لمتابعة تشكيل هذه طبقات ثنائية بدعم 10، وتحقيق مختلف الهياكل التي شكلتها أغشية تركيبات مختلفة 11-15. أداء قوة التحليل الطيفي على النتائج طبقات ثنائية المعتمدة في قمة في منحنى النهج. هذه الذروة تشير إلى القوة اللازمة لاختراق طبقة ثنائية، ويسمى القوة الخارقة. كما يمكن قياس سمك طبقة ثنائية باستخدام منحنى القوة 6. قوة اختراق نموذجية من طبقات ثنائيةتتراوح ما بين 1-50 ن ن 6. هذه الخصائص تعتمد على التعبئة الدهون (المرحلة سائل أو هلام) وهيكل (أسيل طول السلسلة ودرجة التشبع) وتعديلها من قبل غشاء نشط وكلاء 16. وقد شرحت النظرية وراء القطيعة 17 والمعلمات تجريبية أخرى مثل النعومة ناتئ، دائرة نصف قطرها طرف وسرعة نهج تؤثر أيضا على قوة اختراق 15،16،18. وقد استخدمت القوة الطيفي لتحليل خصائص مراحل مختلفة الدهون 11،19، والتغيرات التي تعتمد على تكوين 12،20، فضلا عن آثار الجزيئات الحيوية الأخرى، مثل الببتيدات، على استقرار الغشاء 21. التوجه شقة من طبقات ثنائية معتمد من المفيد للجمع بين AFM مع وسائل أخرى مثل مأكل سطح الرنين 22 ومضان المجهر 11،19 لتوصيف هيكل وخصائص الأغشية بشكل أفضل. هذا بروتو فيديو تفصيليوالمقصود العقيد لإعداد طبقات ثنائية الدهون تدعم استغلال ترسب الحويصلة وتحليلها مع AFM وقوة التحليل الطيفي. في حين الحويصلات من مختلف الأحجام يمكن استخدامها لإعداد طبقات ثنائية، ويركز هذا البروتوكول على الحويصلات unilamellar الصغيرة والكبيرة. وتميزت بدعم طبقات ثنائية تلك المرحلة تفصل في أمر السائل (L س) والسائلة المختلين (L د) مراحل 11،15. ويتكون الغشاء من دى oleoyl-فسفاتيديل (DOPC)، سفينغوميالين (SM)، والكولسترول (شول) في 2: 2: 1 النسبة. هذه نماذج تكوين الطوافات الدهنية، والتي من المقترح أن تتصرف كما منابر هامة للاتجار البروتين والفرز، مما يشير الى الخلايا والعمليات الخلوية الأخرى 23،24.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sphingomyelin (Brain, Porcine)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), 99.8%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), 88%</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogenphosphate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), &gt;99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogenphosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;), molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip, 24&amp;nbsp;x&amp;nbsp;60&amp;nbsp;mm, 1&amp;nbsp;mm thickness</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Punch and Die Set</td><td>Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica blocks</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.&amp;nbsp; Always handle mica with gloves or tweezers.</td></tr><tr><td>Laboratory Equipment Grease</td><td>Borer Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Liposome Extruder</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Adhesive Tape</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (&lt;a href=&quot;http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf&quot;&gt;Data sheet&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Silicon Nitride AFM Cantilever&amp;nbsp;</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>DNP-10</td><td>Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60&amp;nbsp;nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

طبقات ثنائية بدعم الدهون تتكون من DOPC: SM: تشول (2: 2: 1) تم تصويره في AFM (الشكل 2 AC). بسبب تركيبة الدهون، لوحظت SM / تشول الغنية L O و DOPC الغنية L د مراحل. يمكن الشخصى ارتفاع من التصوير AFM توفر معلومات هامة عن هيكل الغشاء. من خلال النظر في ملف الارتفاع، ويمكن قياس سمك طبقة ثنائية في وجود عيوب في الغشاء (الشكل 2B)، أو الفرق في الارتفاع بين L س / L د مراحل يمكن تقديمها. بالإضافة إلى ذلك، AFM يسمح لوجه التحديد حدد المناطق التي تمثل هذه المراحل وتحليل الخصائص الميكانيكية الخاصة بهم باستخدام القوة الطيفي (الشكل 2 D - F). يتم استخدام منحنيات القوة المستمدة من وضع قوة التحليل الطيفي لقياس قوة اختراق من خلال إيجاد قيمة القوة في ذروة منحنى القوة (الشكل 2D و E)، وmembrسمك انو بطرح قيمة المسافة من ذروة منحنى القوة لقيمة المسافة عندما يبدأ منحنى القوة في الارتفاع مرة أخرى (الشكل 2D و F). حساسية قياسات AFM تعتمد على المواد كهرضغطية والحلقات ردود الفعل الإلكترونية. على هذا النحو، قبل التجارب به، من المهم أن تحصل على دراية AFM اقامة. هناك نوعان من أداة مشتركة إعداد للمواد كهرضغطية: (1) أنبوب الماسح الضوئي التي وضعت العينة على رأس المواد كهرضغطية ويتم فحص العينة بناء على بلاغ قادرة على الحركة. أو (2) المرحلة الثنية حيث يتم تركيب طرف على المواد كهرضغطية بدلا من العينة. في الحالة الأخيرة، والمواد كهرضغطية والالكترونيات وغيرها محمية من تسرب. وهناك الكثير من النماذج AFM للتطبيقات البيولوجية يكون هذا التكوين. أثناء التصوير، وغيض AFM قد تفقد الاتصال مع العينة ويؤدي إلى الخاطئة ليasurements. اعتمادا على عدد بمسح تضيع، الصورة يمكن تصحيح عن طريق إزالة خطوط المسح وباستخدام فلتر كثافة يعني لاستخلاص القيم الجديدة من المنطقة المحيطة بها (الشكل 3). ولكن في معظم الحالات، وهذا لا تسفر عن صورة جيدة وينصح ببساطة تجاهل الصورة. وهناك غيرها من الأعمال الفنية التي تحتاج إلى مراقبة. هذه تنشأ من كليلة / التالفة / نصائح القذرة فضلا عن حيود بقعة الليزر وراء ناتئ 31. في هذه الحالات، يجب التخلص من الصور ويجب استبداله طرف AFM. خلال قياسات التحليل الطيفي القوة، قد تنشأ العديد من التحديات: (1) عدم وجود قمم (الشكل 4A)، (2) وجود أكتاف بدلا قمم واضحة المعالم (الشكل 4B)، (3) زيادة صغيرة وplateauing لاحقا بأسعار منخفضة جدا قوات (الشكل 4C - D). ويمكن أن يعزى غياب الذروة إلى قياس في المنطقة دون BILشروط آير أو لاكتساب عدم الأمثل. فمن المستحسن أن يتم الحصول على صورة AFM قبل القيام قوة التحليل الطيفي للتأكد من أن طبقة ثنائية هو في الواقع الذي يتم قياسه. شروط اكتساب فضلا عن معلومات سرية المواصفات / ناتئ تؤثر على احتمال حدوث حدث اختراق 17. وهناك معلومات أكثر وضوحا يمكن أن تثقب بسهولة طبقة ثنائية، على هذا النحو، قد تظهر قوة اختراق منخفضة أو لا تظهر على الإطلاق لأنه أقل من مستويات الضوضاء. . زيادة سرعة النهج أيضا يزيد من قوة اختراق 16. كما هو الضغط على طبقة ثنائية من قبل طرف وجزيئات الدهون تتفاعل أيضا لتبديد هذه القوة. بسرعة أقل النهج، طبقة ثنائية المادة الدهنية لديها ما يكفي من الوقت لكي تتوازن قبل الخطوة التالية في القوة، وهذا يزيد من احتمال أن حدث اختراق يمكن أن يحدث. في أعلى سرعة النهج، سلالم قوة أسرع من رد فعل من الدهون، وعلى هذا النحو، فإن احتمال حدث اختراق أقل في نفس القوة. فمن POSSible أنه باستخدام عالية السرعة النهج، يتم الوصول إلى نقطة مجموعة قبل فواصل طبقة ثنائية مما أدى إلى عدم قمم يمكن ملاحظتها. لا توجد تقارير لشرح ظهور الكتفين على منحنى لكننا نفترض أنه يمكن أن يكون نتيجة لضغط مادي قبل انفراجة. وعلاوة على ذلك، هضبة أو قمم واسعة في القوات منخفضة جدا قد تشير إلى وجود أوساخ أو المواد الدهنية فضفاضة في الطرف. نصائح قد تتراكم الأوساخ والمواد شحمي في غضون عدة القياسات. الأوساخ والمواد التي تعلق على طرف يجعلها حادة، وبالتالي زيادة قوة اختراق. فمن المستحسن أن منحنيات القوة يتم الحصول عليها في المناطق المختلفة إذا تنشأ هذه التحديات. والتوصية الثانية هي تغيير نصائح (وهذا سوف يتطلب إعادة تقويم). وأخيرا، قد تحتاج سرعة النهج إلى تعديل أو استخدام معلومات سرية مع مواصفات مختلفة (نصف قطرها طرف وصلابة) ويمكن اعتبار. قوة اختراق تتراوح ما بين 0-50 ن ن 6، على هذا النحو، رانه الربيع الدائم للناتئ يمكن أن يكون في حدود 0،05 حتي 0،7 N / م. معظم الكابولي التجارية لديها دائرة نصف قطرها طرف الاسمي حوالي 20-40 نانومتر. بدلا من استخدام النصائح التقليدية، ويمكن أيضا أن يكون اشترى الكابولي tipless ويمكن أن تعلق مجالات دائرة نصف قطرها المعروفة (والتي عادة ما تكون monodisperse في حجم التوزيع) لهم. للحصول على بيانات قابلة للتكرار، استخدم دائما شروط اكتساب نفس والمواصفات تعزية لنفس مجموعة من التجارب. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52867/52867fig1.jpg" /> الشكل 1: مبادئ قوة التحليل الطيفي (A) تسلسل نهج التراجع للناتئ من العينة. يظهر خط أحمر انحراف ناتئ من موقف توازنها (خط أسود). (B) الكابولي معايرة تحويل الإشارة الكهربائية (في فولت) لفرض (في نيوتن). من خلال الاستحواذ على سينسي ناتئيتم تحويل الناقلية والربيع ثابت انحراف الرأسي (فولت) في المسافة والمسافة حيز التنفيذ باستخدام قانون هوك. (C) عند الاتصال في قياسات قوة التحليل الطيفي، حركة المسح الضوئي Z-بيزو لا يأخذ بعين الاعتبار ناتئ الانحناء. ويمكن أن يتم تصحيح هذا عن طريق طرح انحراف العمودي، العاشر (في وحدات المسافة) من حركة ض بيزو، ض (كما في وحدات المسافة). في هذه الطريقة، الفعلي فصل طرف عينة، بدلا من مجرد حركة ض بيزو، يمكن الإبلاغ، الذي يعد مقياسا أكثر دقة من المسافات ومهم من أجل قياس سمك العينة. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52867/52867fig2.jpg" /> الشكل 2: AFM من SLBs (A) مخطط SLBs تتألف من DOPC: SM: تشول (2: 2: 1) فصل في السائل المختلين (L د) وسائل أمر (L س) مراحل. (B </sترونج&gt;) A 50 ميكرون × 50 ميكرون صورة AFM من SLBs. يتوافق ملف خط أدناه إلى الخط الأصفر في الصورة. تظهر العيوب غشاء (السهم الأزرق) سمك طبقة ثنائية لتكون تقريبا. 4 نانومتر. (C) يناظر المربع الأصفر في B (10 ميكرون × 10 ميكرون). وصفت L O و L د مراحل. يتوافق ملف خط أدناه إلى الخط الأصفر في الصورة. تظهر مرحلة L س 1-2 نانومتر أعلى من المرحلة L د. (D) منحنى القوة عينة تبين كيف تستمد قوة اختراق وسمك الغشاء. (E) قوة الاختراق و(F) غشاء توزيع سمك لL د وL س مراحل مع تركيب الضبابي لتقدير. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52867/52867fig3.jpg" /> الرقم 3: فقدان الاتصال أثناء التصوير يؤدي إلى. مسح الخطوط التي لا تتوافق مع ما تبقى من صورة معتمدة طبقة ثنائية مكونة من DOPC: SM: تشول (2: 2: 1) مع فقدان الاتصال في بعض بمسح الخط. شريط النطاق 2 ميكرون. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52867/52867fig4.jpg" /> الرقم 4: التحديات في قوة التحليل الطيفي (A) وبعض المنحنيات قوة ليس لديهم القمم. قد يكون (B) ومنحنى الكتفين بدلا من قمم واضحة المعالم. (C) بعد زيادة طفيفة قد تحدث هضبة في غياب الذروة. (D) المظهر من هضبة مع ذروة واضحة المعالم. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> منطقة الغشاء </td><td> اختراق قوة (ن ن) </td><td> غشاء سمك (نانومتر) </td></tr><tr><td> L د المرحلة </td><td> 6 ± 1 </td><td> 4.7 &amp;# 177؛ 0.5 </td></tr><tr><td> المرحلة L س </td><td> 8 ± 1 </td><td> 6 ± 1 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: خصائص غشاء DOPC: SM: تشول (2: 2: 1). SLBs المرحلة L د ديها قوة اختراق من 6 ± 1 ن ن وبسمك 4.7 ± 0.5 نانومتر. وL س يحتوي على 8 ± 1 ن ن وسمك 6 ± 1 نانومتر. الفرق في الارتفاع بين المرحلتين هو 2 ± 1.4 نانومتر.

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.6K Views.  Interfaculty Institute for Biochemistry. We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Video: Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biochemistry

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

التحقيق احدة جزيء التصاق بواسطة القوة الذرية الطيفي

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Engineering

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

نانومتر الفرعي التصوير القرار مع السعة التشكيل الذرية المجهري القوة في السائل

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

إعداد ميكا المدعومة الدهون طبقات ثنائية لارتفاع القرار المجهر الضوئي التصوير

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Visualizing Solution Structure at Solid-Liquid Interfaces using Three-Dimensional Fast Force Mapping

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the solution conditions such as ion concentrations, pH, ligands, and trace additives, as well as the underlying crystallography and chemistry. In this context, three-dimensional fast force mapping (3D FFM) has emerged as a promising tool for investigating solution structure at interfaces. This capability is based on atomic force microscopy (AFM) and allows the direct visualization of interfacial regions in three spatial dimensions with sub-nanometer resolution. Here we provide a detailed description of the experimental protocol for acquiring 3D FFM data. The main considerations for optimizing the operating parameters depending on the sample and application are discussed. Moreover, the basic methods for data processing and analysis are discussed, including the transformation of the measured instrument observables into tip-sample force maps that can be linked to the local solution structure. Finally, we shed light on some of the outstanding questions related to 3D FFM data interpretation and how this technique can become a central tool in the repertoire of surface science.

Here, we present a protocol for using three-dimensional fast force mapping - an atomic force microscopy technique - for visualizing solution structure at solid-liquid interfaces with the subnanometer resolution by mapping the tip-sample interactions within the interfacial region.

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the ...

Chemistry

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

القوة الذرية المجهرية المسافة البادئة القائمة على الكابولي: قياسات الخواص الميكانيكية على المستوى النانوي في الهواء والسوائل

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

تجميع نماذج محاكاة الخلايا المدعومة والموقوفة ثنائية الطبقات لدراسة التفاعلات الجزيئية

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

مجهر القوة نتوء: أسلوب لتحديد حجم القوات المتقدمة بنتوءات الخلية

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...