Name: triggering reactive gliosis in vivo by a forebrain stab injury
Uploaded: 2015-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury at JoVE.com

We thank Katherine Clark for technical assistance. A.D.R.G. is funded in part by 5K01MH097957-03

واستخدمت الكبار (3-4 أشهر من العمر) ذكور الفئران على مختلطة C57BL / 6 الخلفية في هذا البروتوكول. تم الاحتفاظ الحيوانات على 12 ساعة ضوء / دورة الظلام، وسمح حرية الوصول إلى الغذاء والماء. أجريت جميع الإجراءات المتبعة في هذا البروتوكول وفقا لبروتوكولات وافقت عليها اللجنة دريكسل جامعة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام. 1. إعداد المنطقة الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير الجدول الجراحية مع 70٪ من الإيثانول، ثم تغطية على مقاعد البدلاء الجراحية كامل مع منصات ماصة وترتيب الأدوات الجراحية المتاخمة لالتجسيمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نصب المعدات التجسيمي دون الذراع مناور. ترتيب سادة التدفئة على التجسيمي وتعيين إلى 37 درجة مئوية. تجنب الانهاك الحيوان عن طريق وضع قطعة صغيرة من منشفة ورقية أو وسادة الجراحية بين الحيوان وسادة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيمها باستخدام مقص، وقطع قطعة صغيرة من جلفوم تعقيمها في طبق بتري معقمة تحتوي على محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ حتى الجرميةدى للاستخدام. ملاحظة: الحفاظ على بيئة عمل معقمة باستخدام أدوات تعقيمها والمستلزمات الجراحية المعقمة. إعادة تعقيم الأدوات الجراحية أثناء إجراء أو بين الحيوانات عن طريق غمس في التعقيم حبة لمدة 10-15 ثانية، حسب الحاجة. الحفاظ على قفازات نظيفة في جميع أنحاء الداخلي عن طريق فرك اليدين مع الايثانول 70٪، حسب الحاجة، لتطهير. </li></ol> 2. الإستعداد ماوس لجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الماوس من قفص المنزل وتزن (ز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الماوس إلى الأيزوفلورين غرفة الاستقراء ووضع الأكسجين إلى 2 لتر / دقيقة والمرذاذ الأيزوفلورين إلى 5 للحث على متن طائرة من التخدير الجراحي، حوالي 3-5 دقائق. مراقبة التنفس تباطؤ والشلل. تأكد من أن الفأر هو تخدير كامل باستخدام منعكس قرصة أخمص قدميه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند مخدرا الماوس بشكل كامل، ووضع في إطار التجسيمي، تأمين الأنف في مخروط الأنف، وهو يعلق مع أنابيب إلى الأيزوفلورين. إدراج أشرطة الأذن في قناة الأذن وتشديد، وضمان رأس غير مستقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحلق رأسه من الأذن إلى الأذن، ومن بين العينين إلى خلف الأذنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الجلد مع مناديل بالتناوب من ايزوبروبيل وحل betadine اليود، 3 مرات لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الدموع الاصطناعية لكلتا العينين لمنعهم من الجفاف أثناء إجراء العمليات الجراحية. </li></ol> 3. إجراء العمليات الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد عمق التخدير بواسطة معسر إصبع القدم أو الذيل. الفأر هو في الطائرة الجراحية المناسبة عندما لا يكون هناك استجابة، وتنفس بطيء وحتى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق الجلد مجاور للسهمي من خلف العينين إلى ما يقرب من بين الأذنين في واحدة، والحركة حازمة واحد باستخدام رقم 11 شفرة المشرط. نقل الجلد جانبا ومقطع الجانب الأيمن مع مرقئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمجمة واضحة من الغشاء المغطي باستخدام الجانب مملة من مشرط رقم 11 و القطن يميل تطبيقها. اختياريا، ومسح الجمجمة مع القطن يميل قضيب انخفض بنسبة 0.9٪ في محلول ملحي. السماح ليجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لناجي مسطرة صغيرة، بمناسبة الحافة الأمامية من حج القحف في 1 ملم الذيلية إلى الدرز الإكليلي، والحافة اليسرى من حج القحف في 1 مم الوحشي للخياطة السهمي (الشكل 1)، مع علامة دائمة. ثم وضع علامة الحق والحدود الذيلية من حج القحف في 4 ملم من الغرز السهمي والإكليلي، على التوالي (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 0.5 مم مثقاب، والبدء في جعل حج القحف عن طريق حفر ببطء بعد مخطط علامة دائمة. تأكد من عدم اختراق الجمجمة تماما. اضغط بلطف على قطعة معزولة من العظم الجداري مع رقم 5 ملقط، مواطن الضعف وتفسح المجال للضغوط. عندما العظام ضعيفة ضعيفة بما فيه الكفاية في جميع أنحاء محيط، وقطعة عظم جاهز للإزالة. ملاحظة: إذا كانت صعوبة الخبرات محقق إزالة العظام في قطعة واحدة، وهذا يشير إلى أن العظام لم ضعيفة بما فيه الكفاية أثناء الحفر. النظر في حفر الجمجمة كذلك في الحيوانات اللاحقة لfacilitaإزالة سهلة الشركة المصرية للاتصالات للقطعة عظم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة 10 مل مزودة G 23 إبرة، وتطبيق كمية صغيرة من المياه المالحة 0.9٪ لامتصاص العظم معزولة ومنطقة حفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق الذراع مناور لمعدات التجسيمي. إرفاق الجديدة رقم 11 شفرة مشرط لصاحب التحقيق مع الجانب حاد النصل تواجه rostrally. ملاحظة: على الرغم من أن الأنسجة منقاري والذيلية تجربة حواف حادة وحادة النصل، على التوالي، والأضرار الميكانيكية الناجمة عن الإصابة اختراق يماثل في جميع أنحاء مدى الآفة. نلاحظ عدم وجود فروق ملموسة في السمات الرئيسية لدباق رد الفعل بما في ذلك upregulation من التعبير GFAP أو الانتشار، بين أقسام منقاري والذيلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الذراع مناور للخروج من الطريق، ورفع بعناية العظام معزولة باستخدام ملقط 5/45 الزاوية. إدراج غيض من ملقط إلى جانب العظام معزولة ورفع، وذلك باستخدام النفوذ لسحب قبالة قطعة من العظام تركت وراءها في واحد فولل حركة. ملاحظة: يجب الحرص على عدم طعن الدماغ أو تعكير صفو الجافية تحت الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ قطعة صغيرة من الرغوة جل امتصاص غارقة ووضع على الدماغ المكشوف لمنعها من الجفاف وامتصاص أي دم التي قد تكون موجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الرغوة جل في مكان، تأرجح الذراع تتلاعب في مكانه وضبط نصل إلى مركز حج القحف على رغوة جل. إزالة الرغوة جل وخفض النصل حتى يلمس طرف الجافية دون ثقب الجافية. علامة ظهري / بطني الإحداثيات باستخدام مقياس رنيه على ذراع العمودي للالتجسيمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الذراع مناور، وانخفاض ببطء شفرة بدقة 3 مم في الدماغ. ويتحقق ذلك باستخدام علامات نطاق رنيه على الذراع مناور. السماح نصل إلى البقاء في المكان لمدة 5-10 ثانية. تحريك الذراع التجسيمي مع مرفق شفرة منقاري إلى الذيلية ثلاث مرات مما يتيح للشفرة للوصول إلى حدود منقاري والذيلية من حج القحف قبل أن ينتقل إلى opposiالشركة المصرية للاتصالات نهاية. ملاحظة: لا يتم إزالة الجافية قبل إدخال شفرة. وعلى النقيض من الجافية الفئران، وهو ~ 80 ميكرون في سمك 7، الجافية الماوس هو أرق بكثير (فقط عدد قليل من طبقات الخلايا سميكة) و لا تنتج مقاومة لا يستهان بها لنصل مشرط خلال الإدراج. استخدام شفرة مشرط جديدة لكل الماوس للتأكد من أن كل حيوان يتلقى إصابة مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع ببطء الذراع التجسيمي، وإزالة شفرة من الدماغ. بعد إزالة شفرة، ووضع على الفور قطعة أخرى من جلفوم على سطح الدماغ لامتصاص أي الدم الزائد أو السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، إزالة الذراع التجسيمي والتخلص من شفرة مشرط رقم 11. بمجرد أن توقف النزيف، وإزالة جلفوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الجرح عن طريق خياطة الجلد مع خياطة غير قابل للامتصاص، مثل ethilon أو البرولين. يجب إزالة الغرز 9-10 أيام بعد الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الماوس إلى قفص وطنه، والسماح الماوس لاستعادة ببطء على اتسخينز وسادة ورصد أية علامات على الضيق. التعافي من التخدير التي يسببها isofluorane يحدث عادة خلال 2-5 دقيقة بعد إزالة من isofluorane. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى استعادتها الإستلقاء القصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة 0.5-1 مل من أفرز اللبن تحت الجلد حل قارع الأجراس لضمان الترطيب. </li></ol> 4. العناية ما بعد العمليات الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن كثب مراقبة الحيوانات بعد العملية حتى الشفاء من التخدير قبل أن تعود إلى المستعمرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحد من الألم وعدم الراحة بعد العملية، إدارة ،05-0،1 ملغم / كغم البوبرينورفين عن طريق الحقن الملكية الفكرية باتباع الإجراء فورا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الحيوانات لمدة 2-3 أيام بعد العملية عن علامات شديدة من الضيق مثل الحركات المحظورة، وعدم النظافة الشخصية، أو فقدان الوزن. الموت ببطء الحيوانات يدل أي من هذه العلامات الشدة وإزالته من الدراسة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لدراسة التشريح للأنسجة المصابين، الموت ببطء الحيوانات عن طريق ستاننضح intracardial دارد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باختصار، تخدير الحيوانات مع جرعة زائدة من الكيتامين / زيلازين، ثم perfused لintracardially مع 15-20 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم، أو حتى يتم مسح الكبد من الدم، تليها 60 مل من 4٪ لامتصاص العرق في ختام التجربة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح أدمغة وبعد الإصلاح، لمدة 2-4 ساعة في 4٪ امتصاص العرق قبل ان ينتقل الى 30٪ محلول السكروز. أدمغة القسم على ناظم البرد في 40-60 ميكرومتر، والعملية من خلال إجراءات النسيجية أو المناعى القياسية، أو كما هو موضح في جارسيا 8،9. </li></ol>

<ol>
	<li>Hamby, M. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+astrocytes+as+therapeutic+targets+for+CNS+disorders.">Reactive astrocytes as therapeutic targets for CNS disorders.</a> Neurotherapeutics. 7 (4), 494-506 (2010).</li><li>Bush, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+infiltration,+neuronal+degeneration,+and+neurite+outgrowth+after+ablation+of+scar-forming,+reactive+astrocytes+in+adult+transgenic+mice.">Leukocyte infiltration, neuronal degeneration, and neurite outgrowth after ablation of scar-forming, reactive astrocytes in adult transgenic mice.</a> Neuron. 23 (2), 297-308 (1999).</li><li>Faulkner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+astrocytes+protect+tissue+and+preserve+function+after+spinal+cord+injury.">Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).</li><li>Okada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+Stat3+or+Socs3+discloses+a+dual+role+for+reactive+astrocytes+after+spinal+cord+injury.">Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury.</a> Nature Medicine. 12 (7), 829-834 (2006).</li><li>Voskuhl, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Astrocytes+Form+Scar-Like+Perivascular+Barriers+to+Leukocytes+during+Adaptive+Immune+Inflammation+of+the+CNS.">Reactive Astrocytes Form Scar-Like Perivascular Barriers to Leukocytes during Adaptive Immune Inflammation of the CNS.</a> Journal of Neuroscience. 29 (37), 11511-11522 (2009).</li><li>Burda, J. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Gliosis+and+the+Multicellular+Response+to+CNS+Damage+and+Disease.">Reactive Gliosis and the Multicellular Response to CNS Damage and Disease.</a> Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).</li><li>Maikos, J. T., Elias, R. A., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+dura+mater+from+the+rat+brain+and+spinal+cord.">Mechanical properties of dura mater from the rat brain and spinal cord.</a> Journal of neurotrauma. 25 (1), 38-51 (2008).</li><li>Garcia, A. D., Doan, N. B., Imura, T., Bush, T. G., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP-expressing+progenitors+are+the+principal+source+of+constitutive+neurogenesis+in+adult+mouse+forebrain.">GFAP-expressing progenitors are the principal source of constitutive neurogenesis in adult mouse forebrain.</a> Nat Neurosci. 7 (11), 1233-1241 (2004).</li><li>Garcia, A. D., Petrova, R., Eng, L., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+discrete+populations+of+astrocytes+in+the+adult+mouse+forebrain.">Sonic hedgehog regulates discrete populations of astrocytes in the adult mouse forebrain.</a> J Neurosci. 30 (41), 13597-13608 (2010).</li><li>Amat, J. A., Ishiguro, H., Nakamura, K., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+and+kinetics+of+proliferating+microglia+and+astrocytes+following+cortical+stab+wounds.">Phenotypic diversity and kinetics of proliferating microglia and astrocytes following cortical stab wounds.</a> Glia. 16 (4), 368-382 (1996).</li><li>Hozumi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+prosaposin+ameliorates+spatial+learning+disturbance+and+reduces+cavity+formation+following+stab+wounds+in+rat+brain.">Administration of prosaposin ameliorates spatial learning disturbance and reduces cavity formation following stab wounds in rat brain.</a> Neuroscience letters. 267 (1), 73-76 (1999).</li><li>Ness, R., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptomeningeal+cells+modulate+the+neurite+growth+promoting+properties+of+astrocytes+in+vitro.">Leptomeningeal cells modulate the neurite growth promoting properties of astrocytes in vitro.</a> Glia. 19 (1), 47-57 (1997).</li><li>Byrnes, K. R., Fricke, S. T., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+differences+between+rats+and+mice+after+spinal+cord+injury.">Neuropathological differences between rats and mice after spinal cord injury.</a> Journal of magnetic resonance imaging : JMRI. 32 (4), 836-846 (2010).</li><li>Steward, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approaches+to+neurotrauma+research:+opportunities+and+potential+pitfalls+of+murine+models.">Genetic approaches to neurotrauma research: opportunities and potential pitfalls of murine models.</a> Experimental neurology. 157 (1), 19-42 (1999).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Hanisch, U. -. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debris+clearance+by+microglia:+an+essential+link+between+degeneration+and+regeneration.">Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration.</a> Brain. 132 (2), 288-295 (2008).</li><li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Barrier+to+Regeneration+in+the+CNS:+Activated+Macrophages+Induce+Extensive+Retraction+of+Dystrophic+Axons+through+Direct+Physical+Interactions.">Another Barrier to Regeneration in the CNS: Activated Macrophages Induce Extensive Retraction of Dystrophic Axons through Direct Physical Interactions.</a> Journal of Neuroscience. 28 (38), 9330-9341 (2008).</li><li>Ip, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Cells+Contribute+to+Myelin+Degeneration+and+Axonopathic+Changes+in+Mice+Overexpressing+Proteolipid+Protein+in+Oligodendrocytes.">Immune Cells Contribute to Myelin Degeneration and Axonopathic Changes in Mice Overexpressing Proteolipid Protein in Oligodendrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 26 (31), 8206-8216 (2006).</li><li>Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+systemic+inflammation+to+chronic+neurodegeneration.">Contribution of systemic inflammation to chronic neurodegeneration.</a> Acta neuropathologica. 120 (3), 277-286 (2010).</li><li>McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chondroitin+sulfate+proteoglycans+neurocan+and+phosphacan+are+expressed+by+reactive+astrocytes+in+the+chronic+CNS+glial+scar.">The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.</a> Journal of Neuroscience. 19 (24), 10778-10788 (1999).</li><li>Silver, J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+beyond+the+glial+scar.">Regeneration beyond the glial scar.</a> Nature reviews. Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 32 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Buffo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+progeny+of+reactive+gliosis:+A+source+of+multipotent+cells+in+the+injured+brain.">Origin and progeny of reactive gliosis: A source of multipotent cells in the injured brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3581-3586 (2008).</li><li>Sirko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+in+the+injured+brain+acquire+stem+cell+properties+in+response+to+sonic+hedgehog.+[corrected].">Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. [corrected].</a> Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

فمن الأهمية بمكان أن الجمجمة أو الجافية الأساسية لا تلف أثناء الحفر. استخدام الضغط الخفيف أثناء الحفر لضمان الجمجمة لم يتم ثقب. بالإضافة إلى ذلك، يجب توخي الحذر في حين رفع قطعة الجمجمة لضمان الجافية لا انطلق مع العظم. إصابة الدماغ الأمامي طعنة وصفت هنا نماذج من اصابة في اختراق إلى الجهاز العصبي المركزي. وإن كان أقل للترجمة سريريا من النماذج المصرف التجاري العراقي مثل FPI أو CCI، يخدم نموذج آفة الدماغ الأمامي طعنة كأداة مفيدة لمجموعة واسعة من الدراسات التي تهدف إلى تحقيق العديد من الأحداث الحيوية الخلوية، أو الجزيئية سببها CNS إهانة منفصلة. على الرغم من العجز المعرفي قد ذكرت في الفئران، 3 أسابيع بعد خضوعه لطعنة الثنائية 11، وتجدر الإشارة إلى أن جانب واحد طعنة نموذج الآفة، كما هو موضح هنا، هو الانسب للدراسات معالجة استجابة الخلايا للإصابة. الجوانب الأساسية لعمليات عصبية مرضية مختلفة، مثل إعادةدباق نشط وتشكيل ندبة يمكن ملاحظة بسهولة ودراستها. وعلى النقيض من FPI أو CCI التي تنتج منتشر على نطاق واسع أمراض الأعصاب، وتفعيل الدبقية المترجمة وعلم الأمراض، وتسهيل المقارنات داخل الحيوان، وبين نصفي الكرة الأرضية الجرحى ويصب بأذى. بالإضافة إلى ذلك، تسلل خلايا السحائية في الجهاز العصبي المركزي في موقع الآفة يمثل فرصة لتحقيق التفاعل بين هذه الخلايا والخلايا النجمية على رد الفعل المحلية. في الواقع، هذه التفاعلات هي الحاسمة في تشكيل ندبا، ولقد ثبت لتنظيم سلبا على خصائص متساهلة من الخلايا النجمية على رد الفعل إلى تجدد المحاور (12). هنا نستخدم إجراءات المناعى القياسية لإظهار بعض الملامح الرئيسية لدباق النجمي رد الفعل مثل تضخم من أجسام الخلايا والعمليات، وزيادة التعبير GFAP، والانتشار الناجم عن الإصابة. لاحظ أنه على الرغم من تسوس الأسنان لا وحظ في الفئران في 1-2 أسابيع فلخوار هذا الإجراء، والدراسات باستخدام الفئران تقرير تشكيل تجويف، 3 أسابيع بعد الإصابة (11). وقد لوحظت اختلافات في الأعصاب بين الفئران والجرذان أيضا عن وقوع إصابات في النخاع الشوكي. في حين أن الفئران التي تخضع لإصابات الحبل الشوكي الخراجات المعرض أو تشكيل تجويف في موقع الآفة، هذه التجاويف لا تشكل في الفئران 13،14. هذا الإجراء هو بسيط وموثوق بها، استنساخه بسهولة، ويتطلب الحد الأدنى من المعدات. ويمكن تعديلها بسهولة لإجراء دراسات الفئران أو الماوس. على وجه الخصوص، يمكن استخدام هذا النموذج مع مختلف خطوط الماوس المعدلة وراثيا أو في الدراسات الدوائية توفير نظرة جديدة في آليات تنظيم استجابة الجهاز العصبي المركزي للإصابة. حجم الآفة وشدة يمكن تعديلها عن طريق ضبط عمق المسافة شفرة وسفر الذراع التجسيمي عقد نصل إلى إنتاج ثقوب منفصلة بدلا من الآفات الميكانيكية الطولية. وبالتالي، يمكن أن الدماغ الأمامي طعنة نموذج اصابة بمثابة experimenta ممتازل منصة التي لدراسة جوانب محددة من مختلف استجابات عصبية مرضية للإصابة. إصابة الجهاز العصبي المركزي تثير استجابة المعقدة التي هي دينامية ومتعددة الخلايا 6. بالإضافة إلى الخلايا النجمية على رد الفعل، الخلايا الدبقية الصغيرة تعبئة بسرعة في phagocytose الحطام والشروع سواء المؤيدة والمضادة للالتهابات شلالات الإشارات 15-18. تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة الغازية تنتج السيتوكينات وكيموكينات، وخلق بيئة معادية لوظيفة الخلية الطبيعية والبقاء 19-21. خارج الخلية المصفوفة (ECM) جزيئات، مثل كبريتات شوندروتن بروتيوغليكان (شبكة الكهرباء الجنوبية)، وتنتج من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا النجمية على رد الفعل والخلايا الليفية، وخلق بيئة معادية للتجديد وإعادة التنظيم الهيكلي للبقاء الخلايا العصبية 22،23. نحن هنا لشرح بعض الملامح الرئيسية لدباق النجمي رد الفعل التي تحدث بعد إصابة الدماغ الأمامي طعنة. Upregulation من و المتوسطةilaments مثل GFAP، وانتشار نجمية، وتشكيل ندبة الدبقية، تليها إعادة تشكيل الأنسجة لاحق يتم تقييمها بسهولة باستخدام إجراءات المناعية القياسية. وتجدر الإشارة إلى أنه في حين أكد بعض ملامح دباق رد الفعل هنا، دباق رد الفعل هو غاية للسياق تعتمد، مع ميزات مختلفة وملامح التعبير الجيني التي تظهر اعتمادا على الزناد محددة 24. ومع ذلك، هناك عدد من الخصائص الأساسية بشأن استجابة الجهاز العصبي المركزي للإصابة ومحاولات إصلاح يمكن أن تكون على غرار ودرس في الدماغ الأمامي طعنة الأنسجة lesioned. في الواقع، وقد تبين أنه استهدف الاجتثاث من تكاثر الخلايا النجمية على رد الفعل بعد إصابة الدماغ الأمامي طعنات تؤدي إلى زيادة عمليات التسلل الكريات البيض في الجهاز العصبي المركزي وزيادة انحطاط العصبي، مما يدل على خصائص اعصاب من الخلايا النجمية على رد الفعل 2. وفي الآونة الأخيرة، عزل الخلايا النجمية على رد الفعل بعد اختراق الآفة طعنات، بالتحرير ليس إصابة غير الغازية، تظهر العصبية إمكانات الخلايا الجذعية في المختبر 25،26. وبالتالي فإن طعنة الدماغ الأمامي هو نموذج إصابة قوية لدراسة مجموعة واسعة من الأحداث البيوكيميائية، الخلوية، والجزيئات الناجمة عن إصابة الجهاز العصبي المركزي. سوف سهولة وبساطة هذا النموذج إصابة تسهيل إجراء المزيد من الدراسات التي يمكن أن تؤدي إلى رؤى جديدة في استجابة الجهاز العصبي المركزي إلى آليات الإصابة والإصلاح.

A major challenge for developing successful therapies to treat the injured CNS is an incomplete understanding of the complex multicellular events that are triggered by the trauma. Reactive astrocytes are gaining increasing recognition as a promising target for novel therapies1. Though historically regarded as hostile to neural repair, reactive astrocytes are now recognized as critical components of a complex, multicellular neuroprotective response that includes attenuation of inflammatory processes and limiting secondary damage and neurodegeneration2-6. Although the neuropathological characteristics of reactive gliosis have long been well defined, the cellular and molecular mechanisms regulating reactive gliosis, and the diverse array of downstream consequences remain poorly understood. Understanding the mechanisms that drive reactive gliosis, as well as the subsequent cellular and molecular events, is an important step towards developing strategies aimed at promoting the neuroprotective properties of reactive gliosis, while attenuating the detrimental effects. 
Here we demonstrate a method to induce severe reactive astrogliosis in the forebrain of adult mice using a stab injury. In contrast to other traumatic brain injury (TBI) models, such as controlled cortical impact (CCI) or fluid percussion injury (FPI), which require specialized equipment to produce an injury, the forebrain stab requires only a stereotaxic device to stabilize the head and a No. 11 scalpel blade. Thus the forebrain stab lesion model is more broadly accessible to a wide range of laboratories that do not have access to the specialized devices necessary for creating an FPI or CCI injury. The method described here enables investigators to reliably and reproducibly trigger a robust gliosis response to investigate subsequent cellular and molecular events. Once recovered from surgery, animals that have received a forebrain stab injury can survive for prolonged periods without the need for specialized care and can be returned to the colony for acute, intermediate, or chronic studies. Though less clinically translatable than FPI or CCI models of TBI, a forebrain lesion produced by a stab injury serves as a simple yet useful experimental model to investigate basic biological mechanisms underlying reactive gliosis and other neuropathological events following trauma to the CNS.

<table><tbody><tr><td>Stereotax</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726049</td><td></td></tr><tr><td>High speed micro drill</td><td>Harvard Apparatus</td><td>724950</td><td></td></tr><tr><td>stainless steel scalpel blade, #11</td><td>MedVet</td><td>JOR581S</td><td></td></tr><tr><td>5/45 angled forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm</td><td>Fisher</td><td>NC9841478</td><td></td></tr><tr><td>Rb anti-GFAP</td><td>DAKO</td><td>&amp;nbsp;Z033429-2</td><td>Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:1,000 (fluorescence)</td></tr><tr><td>Shp anti-BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab1893</td><td>Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:500 (fluorescence)</td></tr><tr><td>Biotinylated goat anti-rabbit</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000&amp;nbsp;</td><td>Dilution - 1:400 (bright-field)</td></tr><tr><td>Biotinylated rabbit anti-sheep</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-6000</td><td>Dilution - 1:400 (bright-field)</td></tr><tr><td>Alexafluor 488 goat anti-rabbit</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td>Dilution - 1:400 (bright-field)</td></tr><tr><td>Alexafluor 568 donkey anti-sheep</td><td>Life Technologies</td><td>A-21099</td><td>Dilution - 1:1,000 (fluorescence)</td></tr><tr><td>DAPI Nucleic Acid Stain</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>Dilution - 1:1,000 (fluorescence)</td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td>Dilution - 1% (bright-field)</td></tr></tbody></table>

triggering reactive gliosis in vivo by a forebrain stab injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive astrogliosis. Reactive astrocytes exert both inflammatory and protective effects that inhibit and promote, respectively, neural repair. The mechanisms underlying the diverse functional properties of reactive astrogliosis are not well understood. Achieving a greater understanding of these mechanisms is critical to developing therapeutic strategies to treat the injured CNS. Here we demonstrate a method to trigger reactive astrogliosis in the adult mouse forebrain using a forebrain stab lesion. This lesion model is simple, reliable, and requires only a stereotaxic device and a scalpel blade to produce the injury. The use of stab lesions as an injury model in the forebrain is well established and amenable to studies addressing a broad range of neuropathological outcomes, such as neuronal degeneration, neuroinflammation, and disruptions in the blood brain barrier (BBB). Thus, the forebrain stab injury model serves as a powerful tool that can be applied for a broad range of studies on the CNS response to trauma.

لأن الحيوانات تمر هذا الإجراء لا يتطلب تدرج فترات بقاء المتخصصة الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية، قصيرة أو طويلة الأجل بسهولة في الدراسة، وهذا يتوقف على الحاجة إلى تحقيق أمراض حادة أو مزمنة بعد الاصابة. الملامح الرئيسية لدباق رد الفعل، مثل upregulation من GFAP وتضخم في سوما، يمكن ملاحظة في أقرب وقت 2-3 أيام بعد الإصابة. مرحلة الذروة من انتشار الخلايا النجمية لرد الفعل هو خلال أيام 3-5 بعد إصابة 10. نتائج التمثيلية المبينة أدناه هي من الحيوانات التي تلقت طعنة الجرح الآفة في وقت سابق من 7 أيام. مورفولوجيا العام والتهندس الخلوي من الدماغ الأمامي بعد إصابة الدماغ الأمامي طعنة يمكن تصور من قبل تلطيخ نيسل (الشكل 2). على الرغم من أن المسار شفرة هو الأبرز في جميع أنحاء وسط الآفة، والتهندس الخلوي القشري تعطلت يكشف عن مدى منقاري والذيلية للر التالفةالقضية. الخلايا النجمية على رد الفعل يمكن ملاحظة من قبل المناعية للGFAP (الشكل 3). لاحظ أن العديد من الخلايا النجمية القشرية لا يحمل المستويات التي يمكن اكتشافها immunohistochemically من GFAP في غياب بسبب الاصابة. ومع ذلك، يتم upregulated GFAP التعبير بشكل كبير في نصف الكرة المماثل للإصابة في حين تبقى عند مستويات منخفضة نسبيا في نصف الكرة الأرضية المقابل (الشكل 3)، مما يشير إلى أن الخلايا النجمية على رد الفعل تقتصر على نصف الكرة المماثل. لاحظ أنه في حين أن المماثل الأنسجة القشرية للآفة يوضح upregulation ملحوظ في GFAP، علامات نجمي الأخرى، مثل S100β يتم التعبير عنها بشكل جوهري في حالة عدم وجود إصابة (الشكل 4)، والحفاظ على مستويات التعبير مماثلة بعد الإصابة (الشكل 4). بالإضافة إلى زيادة التعبير GFAP، الخلايا النجمية على رد الفعل تخضع تضخم الخلايا. تصبح أجسام الخلايا والعمليات الموسعة وتظهر تلطيخ مكثفة لGFAP (الشكل 3). انتشار الخلايا النجمية على رد الفعل يمكن ملاحظة من قبل إدارة الثيميدين التناظرية، 5-برومو-2&#39;-deoxyuridine (BrdU)، أو عن طريق المناعية للعلامات التكاثري Ki67 أو PCNA. نحن بشكل روتيني إدارة 200 ملغ / كغ BrdU، والملكية الفكرية، للحيوانات خلال أيام 3-5 اصابة التالية، في ذروة دباق التفاعل 10 (الشكل 3). إلا أن جرعة دقيقة وتوقيت BrdU ينبغي النظر بشكل مستقل عن كل دراسة، واضعا في الاعتبار أن BrdU سوف تسمية دائم الخلايا التي تمر الانتشار، فضلا عن نسلهم، في وقت الإدارة، ولكن أن الخلايا التي تدخل دورة الخلية قبل BrdU يبدأ، أو بعد تناوله BrdU كاملة، لن تكون وضعت. في الشكل (4)، وتبين لنا واسعة شارك في التعريب بين GFAP وBrdU في إصابة آخر 1 أسبوع، مشيرا إلى أن العديد من الخلايا النجمية على رد الفعل انتشرت خلال وقت إدارة BrdU. لاحظ أن العلاقات العامة<html> يتم ترجمة oliferating الخلايا النجمية على رد الفعل في الغالب المجاورة لجوهر الآفة، في حين أن الخلايا النجمية على رد الفعل المترجمة البعيدة عن جوهر الآفة هي إلى حد كبير غير التكاثري (الشكل 4). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52825/52825fig1.jpg" /> الشكل 1: رسم تخطيطي للجمجمة الفأر، والتي تصور منطقة حج القحف خطوط زرقاء تصور علامات أولية تحديد حدود المنطقة التي سيتم حفرها. يتم قياس علامات العليا واليسرى في 1 ملم أدناه أو الأفقي إلى الغرز الاكليلية أو السهمي، على التوالي. يتم قياس علامات أسفل واليمين في 4 ملم من الغرز الاكليلية والسهمي، على التوالي. يتم تنفيذ حج القحف عن طريق حفر دائرة داخل حدود ملحوظ (الخط المنقط)، وخلق حج القحف هذا هو ما يقرب من 3 ملم في القطر (خط متقطع). التخطيطي ليست على نطاق كبير. &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52825/52825fig2.jpg" /> الشكل 2: تلطيخ نيسل في جميع أنحاء مدى منقاري-الذيلية من حجم الآفة. (A - C) شرائح الاكليلية من أدمغة المصابين 1 أسبوع إصابة آخر، والتي تبين المماثل نصف الكرة إلى الآفة. إدراجات تصوير التكبير في الصور من المناطق محاصر. المسار شفرة هو الأبرز في مركز الآفة، ~ 2.5 ملم من Bregma (السهم في B). لاحظ التهندس الخلوي القشري تعطلت (إدراجات) في أقسام الأمامي (A) والخلفي (C) إلى مركز الآفة. مقياس شريط 500 ميكرون، أقحم، 250 ميكرون. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52825/52825fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52825/52825fig3.jpg" /> الشكل (3): </<html> قوية&gt; المناعية Brightfield لGFAP 1 أسبوع بعد إصابة الدماغ الأمامي طعنة. (A - B) وصور التكبير منخفضة من GFAP تلطيخ في المقابل (A) والمماثل (B) نصفي الكرة الأرضية من قسم الأنسجة نفسه من حيوان مصاب. ويظهر موقع الآفة في (B)، ويظهر في المنطقة المقابلة في نصف الكرة الأرضية المقابل لم يصب في (A). شريط النطاق، 100 ميكرون. (C - D) وصور التكبير عالية من العادي (C) ورد الفعل (D) النجمية من نصفي الكرة الأرضية المقابل والمماثل، على التوالي. لاحظ تضخم الكبير في خلايا الجسم وعمليات نجمية رد الفعل في (D)، مقابل (C). شريط النطاق، 10 ميكرومتر. 825 / 52825fig4.jpg &quot;/&gt; الرقم 4: الخلايا النجمية على رد الفعل تتكاثر بعد إصابة الدماغ الأمامي طعنة. (A - B) تلطيخ مناعي لBrdU (الحمراء)، وGFAP (الأخضر) في لم يصب، والسيطرة (A) وجرح (B) العقول، 1 أسبوع بعد الاصابة طعنات. (C - D) Immunofluroescent تلطيخ لBrdU (الحمراء)، وعلامة نجمي S100β (الأخضر) في يصب بأذى (C) وجرح (D) نصفي الكرة الأرضية، 1 أسبوع بعد الاصابة طعنات. تلقى الحيوانات BrdU خلال الأيام 3-5 إصابة آخر. لاحظ أن العديد من الخلايا النجمية تنتشر في موقع الآفة في القشرة المصابة (B و D، الأشكال، السهام)، في حين أن الخلايا النجمية في القشرة لم يصب لا تتكاثر (A و C، الأشكال). Counterstaining مع دابي (الأزرق). الحانات النطاق، 100 ميكرون، أقحم، 25 ميكرون.

Watch this Scientific Journal Video about Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury at JoVE.com

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods.

مما اثار رد الفعل دباق<em&gt; في فيفو</em&gt; من الدماغ الأمامي الطعنة الإصابات

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

triggering-reactive-gliosis-in-vivo-by-a-forebrain-stab-injury

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

10.5K Views.  Drexel University. This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods. 

Video: Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

والنموذج الإصابات المعنية بالتحقيق في وسط الجهاز العصبي في إصلاح<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Neuroscience

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

الصدمة الحادة الدماغ في الفئران تليها الطولية التصوير ثنائي الفوتون

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

طعنة الإصابة بالجروح من اسماك الزرد الكبار الدماغ الانتهائي: طريقة المعنية بالتحقيق في تكوين الخلايا العصبية والدماغ الفقارية التجديد

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

النمذجة الخلايا النجمية إمراض<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

نموذج إصابة جرح الطعنة للتكتوم البصري البالغ باستخدام الزرد و Medaka للتحليل المقارن للقدرة التجديدية

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Developmental Biology

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

نموذج إصابة المورفولوجية في فيفو لدراسة نيوروريجينيريشن في الطرفية والجهاز العصبي المركزي

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these mechanisms is crucial for developing neural regenerative therapies. Drosophila melanogaster is a leading model for studies of neural development but historically has not been exploited to investigate adult brain regeneration. This is primarily because the adult brain exhibits very low mitotic activity. Nonetheless, penetrating traumatic brain injury (PTBI) to the adult Drosophila central brain triggers the generation of new neurons and new glia. The powerful genetic tools available in Drosophila combined with the simple but rigorous injury protocol described here now make adult Drosophila brain a robust model for neural regeneration research. Provided here are detailed instructions for (1) penetrating injuries to the adult central brain and (2) dissection, immunohistochemistry, and imaging post-injury. These protocols yield highly reproducible results and will facilitate additional studies to dissect mechanisms underlying neural regeneration.

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

This article provides detailed protocols for inflicting Penetrating Traumatic Brain Injury (PTBI) to adult Drosophila and examining the resulting neurogenesis.

تحفيز وتحليل تكوين الأعصاب للبالغين في الدماغ المركزي Drosophila

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

نموذج مغلق الرأس يتم التحكم فيه كهرومغناطيسيا لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة في الفئران

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell types of an animal's brain, upon exposure to exogenous stimuli. Here, the administration of a closed-skull traumatic brain injury (TBI) and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent longitudinal intravital imaging in mice is shown. Mice are intracranially injected with an adeno-associated virus (AAV) expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) under a neuronal specific promoter. After 2 to 4 weeks, the mice are subjected to a repetitive TBI using a weight drop device over the AAV injection location. Within the same surgical session, the mice are implanted with a metal headpost and then a glass cranial window over the TBI impacting site. The expression and cellular localization of EGFP is examined using a two-photon microscope in the same brain region exposed to trauma over the course of months.

This study demonstrates delivery of a repetitive traumatic brain injury to mice and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent intravital imaging of a neuron-expressed EGFP using two-photon microscopy.

التصوير داخل الجسم لتعبير البروتين الفلوري في الفئران المصابة بإصابة دماغية رضحية مغلقة الجمجمة ونافذة الجمجمة باستخدام مجهر ثنائي الفوتون

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Stab-Wound Mouse Model for Studying Hemorrhage and Inflammation in Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury (TBI) results from physical damage, often caused by accidents or sports-related incidents. The causes of TBI are diverse, including concussions, brain contusions, hematomas, and skull fractures. To replicate these different causes, various TBI mouse models have been developed using distinct protocols. Physical brain injury leads to both primary and secondary brain injuries, which exacerbate neuronal loss. Primary injury occurs immediately after the damage, often due to hemorrhage, and subsequently triggers secondary injuries, including inflammation around the lesion. Developing a TBI model suitable for assessing hemorrhage extension and inflammatory severity is therefore crucial. This protocol introduces a method for mimicking penetrating brain injury, referred to as the stab-wound TBI mouse model, to study mechanisms of hemorrhage, inflammation, and neuronal loss associated with TBI pathology. This model is created by puncturing the skull and brain with needles and is simple to execute without the need for specialized experimental equipment. Additionally, the minor injury inflicted on the mouse cerebral cortex using a needle does not affect the animal's behavior post-surgery. This feature allows researchers to study the localized effects of brain injury without concerns about broader behavioral consequences. Sample data from stab-wounded mouse cerebral cortices demonstrate the model's effectiveness in assessing blood leakage into the parenchyma, glial activation, and inflammatory cytokine production. Furthermore, this protocol facilitates the evaluation of blood coagulants and anti-inflammatory compounds, aiding in the development of therapeutic agents for TBI.

Simplified traumatic brain injury (TBI) models have facilitated the development of therapeutic approaches. This protocol outlines the creation of a stab-wound mouse cortex using needles, enabling the analysis of hemorrhage and inflammation. The stab-wound TBI mouse model offers the advantage of being performed without requiring specialized equipment.

نموذج فأر الطعن الجرح لدراسة النزيف والالتهاب في إصابات الدماغ الرضحية

Traumatic brain injury (TBI) results from physical damage, often caused by accidents or sports-related incidents. The causes of TBI are diverse, including ...

مما اثار رد الفعل دباق

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

والنموذج الإصابات المعنية بالتحقيق في وسط الجهاز العصبي في إصلاح