Name: an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time
Uploaded: 2014-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time at JoVE.com

DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات الحيوانية في إطار المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة لويزفيل، والتمسك اللوائح الاتحادية. 1. إعداد منخفضة الكالسيوم 2+ و 2 ملي كا 2+ السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) Perfusates <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2X منخفضة الكالسيوم 2+ (0.1 ملم) سهم C العازلة، 2X الكالسيوم الطبيعي 2+ (2 ملم) سهم منطقة عازلة، و2X المالية B عازلة كما هو موضح في الجدول 1. الحلول الأسهم الفردية تسمح تعديل المحتوى أيون (على سبيل المثال، منخفضة أو الصفر الكالسيوم 2+) ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنضح داخل القلب أثناء تشريح، إضافة 100 مل من 2X منخفضة الكالسيوم 2+ سهم C و 100 مل من 2X المالية B في زجاجة من البلاستيك لجعل الكالسيوم منخفض 1X 2+ ACSF. خلط وتخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو جعل الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنضح من خارج الحي الحبل الشوكي أثناء ايماججي، إضافة 500 مل من 2X العادي الكالسيوم 2+ المالية وو 500 مل من 2X المالية B في زجاجة 1 لتر لتوليد 1X ACSF. خلط وتخزين بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو جعل الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة من مخازن ACSF إلى 7.4. مع الحفاظ على ACSF في درجة حرارة الغرفة، ووضع منخفض الكالسيوم 2+ ACSF على الجليد ثم فقاعة كلا مخازن بالغاز كربوجين (95٪ O 2، 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام وبشكل مستمر خلال نضح. </li></ol> 2. إعداد فيفو السابقين غرفة التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف بطانية للتدفئة (أي اغلاق التلقائي) حول زجاجة ACSF وضبط الحرارة إلى منخفض / الإعداد المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ACSF خط نضح مخصص في زجاجة متصلة مضخة نضح وتمشيا سخان التي تسيطر عليها وحدة تحكم في درجة الحرارة وردود الفعل مسبار درجة الحرارة ثنائي القطب كما هو مبين في الشكل 1A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق مرحلة المجهر شقة إدراج (152 X 102 مم) إلى 2 الفوتون الإثارة / أسيوطocal مرحلة المجهر مزودة حاوية التسرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع غرفة كبيرة نضح حمام مفتوح (ث ل س س ح و 12 × 24 × 8 ملم) في وعاء تسرب لاستيعاب وتوفير تدفق مستمر من ACSF الاوكسيجين الطازجة إلى الحبل الشوكي خارج الجسم الحي (انظر الشكل 1B لمناسبة السابق فيفو التصوير تصميم غرفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط المعادن منفذ إخراج سخان على خط إلى خارج الحي غرفة التصوير باستخدام أنابيب مناسبة. وضع وسادة ماصة رقيقة تحت غرفة التصوير فيفو السابقين للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة المخزن المؤقت / الأنسجة أثناء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الالتزام غرفة التصوير خارج الحي في الجزء السفلي من إدراج الحاويات تسرب / المرحلة باستخدام تك لزجة قابلة للإزالة. فإن سهولة تشكيل تك لزجة تسمح للغرفة الى تعديلها حسب الحاجة لضمان مسار الهدف في ضوء هو عمودي على سطح الأنسجة. إذا لزم الأمر، استخدم مستوى بولس لضبط الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمينفي خط ردود الفعل سخان مسبار درجة الحرارة بالقرب من مدخل السائل غرفة وغير القابل للصدأ أنبوب الشفط الصلب متصلة خط فراغ عند مخرج القاعة. أصحاب الشريط المغناطيسي وممص مكروى المناسب والمفيد في هذا الصدد. بدوره على مصدر فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة نضح لبدء ملء غرفة التصوير مع ACSF المؤكسج. ضبط مضخة نضح إلى 1.5-2 مل لكل دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحكم في حجم ACSF في غرفة التصوير عن طريق ضبط خط فراغ. من المهم أن يكون هناك ما يكفي من ACSF في غرفة التصوير لتغطية جزء الحبل الشوكي والسماح مسافة العمل كافية بين هدف غمس الماء وسطح الأنسجة. المايلين ومحاور عصبية يمكن أن تتأثر ضارا إذا لم يتم المغمورة قطاع النسيج تماما في ACSF الاوكسيجين الطازجة الرائدة التحف التي يسببها المجرب ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تحكم في درجة الحرارة سخان في الخط بحيث درجة حرارة سائل الإرواء في غرفة التصوير هي درجة حرارة الغرفة القريب. </li></ol> &lt;ص الطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. تشريح الكبار الفئران عنق الرحم الحبل الشوكي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء بالغ 6-10 أسبوع thy1 القديمة -YFP الماوس المعدلة وراثيا (استخدام سلالة المناسب الذي لديه الفلورسنت التعبير البروتين في الخلايا العصبية الجذرية الظهرية العقدة) عن طريق حقن جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال التخدير (200 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تحت المستوى المناسب من التخدير (على سبيل المثال، أي رد فعل لقرصة أخمص قدميها، وفقدان طرفة رد الفعل)، حلاقة بعناية الجلد المغطي للنخاع الشوكي والدماغ مع كليبرز الجراحية. تطهير الجلد باستخدام بتدين و 70٪ منصات الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش الصدر / منطقة البطن مع الايثانول 70٪، ثم يروي هذا الموضوع transcardially باستخدام المبرد،-فقاعات كربوجين الكالسيوم منخفض 2+ ACSF. (انظر الشكل 1C لمقاعد البدلاء اقترح تشريح وضع أعلى متابعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما تتضاءل الكبد، وتأمين إبرة نضح في القلب باستخدام مقطع صغير. تحويل الموضوع على الوصول إلى الجانب الظهري حلق لهذا الموضوع، ومسح منطقة حلق مع 70٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وجعل شق الجلد الظهرية على طول خط الوسط ابتداء من الأنف إلى الورك باستخدام مقص تشريح لفضح الدماغ والعمود الفقري (الشكل 2A). تأمين إعداد من خلال وضع دبابيس في الأنف والكفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح من هذه النقطة، وقطع بقوة عبر السطح الظهري من الجمجمة على مستوى بصيلات الشم. إدراج واحدة من النصائح مقص في الحواف الجانبية للشق وقطع على طول حواف قلنسوة ثنائيا حتى المخيخ. ملاحظة: لا المكوس تماما قلنسوة كما هو مطلوب في وقت لاحق لرفع الأنسجة المغطي من الحبل الشوكي في جميع أنحاء تشريح (انظر الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع قلنسوة لفضح الدماغ. خفض بلطف الحواف اليسرى واليمنى من العظم الجداري (الموجود في المخيخ) وتسحبه إلى الوراء نحو caudally لفضح الدماغ / الحبل الشوكي (الشكل 2C </stroنانوغرام&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص يميل غرامة عقدت في زاوية 45 درجة إلى سطح الطاولة وقطع فقرات ثنائيا فقط أقل شأنا من الجذور الخلفية العصبية. ملاحظة: تجنب الاتصال مع الأعمدة الظهرية بيضاء مشرقة. هذه الألياف هي تلك التي سيتم تصويرها (الشكل 2D) ويمكن أن تتلف بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع قلنسوة والظهرية سطح العمود الفقري مع ملقط يميل غرامة، وسحب بلطف النسيج المغطي في قطعة واحدة كما يتم إجراء تخفيضات لفضح الحبل الشوكي. مواصلة خفض فقرات إلى المستوى الصدري العلوي لعزل شريحة 1-2 سم من الحبل عنق الرحم للتصوير لاحقة (الشكل 2E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص لقطع بالتوازي الأنسجة / العظام إلى العمود الفقري والانسجة واضحة تحت العمود. جعل هذه التخفيضات عن مستوى ممكن. من المهم جدا أن الأنسجة تكمن مسطحة في غرفة بحيث الحبل هو مستوى للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مشرط رقم 11 لالقطع جذع الدماغ (الماضيإنهاء ألياف الحزمة النواة الناحلة) وعلى مستوى الصدري العلوي لعزل جزء الحبل الشوكي العنقي (انظر الشكل 2F). استخدام المقص لقطع الأنسجة / عظم في هذه نفس نقطتين. وينبغي أن يتضمن الأنسجة المعزولة 2/3 العمود الفقري يشمل الدماغ الذيلية، وتوسيع عنق الرحم، والجزء العلوي من الحبل الشوكي الصدري (الشكل 2G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العمود الفقري معزولة في طبق بتري من-فقاعات كربوجين، الكالسيوم منخفض المبردة 2+ ACSF. إذا لزم الأمر، وتقليم الأنسجة تحت العمود الفقري حتى انها تقع شقة في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العمود الفقري معزول إلى غرفة التصوير خارج الحي وزيادة تدريجية في درجة حرارة سائل الإرواء أكثر من 1 ساعة إلى 36-37 درجة مئوية. الحفاظ على درجة الحرارة هذه أثناء التصوير. </li></ol> 4. التنسيب من فيفو السابقين النخاع الشوكي إلى غرفة التصوير والمايلين وصفها مع النيل الأحمر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين بعناية العمود الفقري في طغرفة maging مع شريحة المناسب المناسبة يعقدون تعديل أسفل مع منصة الشبكة العمودية التي تتكون من المواضيع ليكرا الدقيقة (إزالة المواضيع الوسطى من منصة الشبكة للسماح مساحة للالحبل الشوكي؛ انظر الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قسامة من النيل الأحمر (5 ملي الأسهم في DMSO و 0.22 ميكرون تصفيتها، ويمكن تخزينها لمدة 1 شهر في 4 درجات مئوية، أو 6 أشهر في -20 درجة مئوية في الظلام). فقط قبل إضافة النيل الأحمر إلى غرفة التصوير، والحد من تدفق مضخة نضح وضبط خط فراغ لضمان السوائل في غرفة ويغطي دائما الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5-10 ميكرولتر النيل الأحمر حل الأسهم إلى غرفة التصوير قرب نهاية الذيلية من الحبل (الشكل 3B). استخدام ماصة 1 مل إلى المزيج بلطف النيل الأحمر في جميع أنحاء الغرفة. السماح النيل الأحمر على البقاء في غرفة لمدة 1-2 دقائق، ثم ضع خط فراغ ذهابا وضبط مضخة نضح إلى 1.5-2 مل لكل دقيقة ليروي باستمرار الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية رفع المسرح المجهرومحاذاة الهدف مع مركز للجزء الحبل الشوكي وإعلامي على أعمدة الظهرية حتى الهدف غمر المياه ما يقرب من 10 مم من سطح ACSF في الغرفة. استخدام المجهر عجلة التركيز الأنفية لجلب ببطء الهدف لأسفل حتى أنها تمس برفق سطح ACSF. استخدام مصدر الضوء epifluorescent لتركيز أعمدة الظهرية في مجال الرؤية (الشكل 3C). </li></ol> 5. فيفو السابقين التصوير من الحبل الشوكي الماوس مع TPLSM والتي يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي (LiSCI) ملاحظة: يوفر الوريد الخلفي علامة مفيدة لتوسيط الأنسجة والألياف الحزمة النواة الناحلة (تنشأ من خلايا الجسم من الظهرية العقد الجذرية ويصعد من T6 وتحت على طول خط الوسط من الحبل الشوكي) بالتوازي مع هذه الأوعية الدموية. كما توفر YFP + عنق الرحم توقعات الجذر الظهري سمكا علامة مفيدة مثل الارتفاع الألياف وتنحدر أفقيا إلى YFP + الحزمة النواة الناحلة الألياف التي هي أصغر في قطر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم محاذاة الأنسجة الحبل الشوكي بشكل مناسب، والتبديل إلى وضع المسح الضوئي ليزر لأداء التصوير الأساسي من الصعود الحزمة النواة الناحلة الألياف مياليني. لإثارة كلا YFP والنيل الأحمر، استخدام مصدر ليزر ثنائي الفوتون ضبطها إلى 950 نانومتر الطول الموجي (~ 17 ميغاواط قياس في الخروج من 25X، 1.1 الهدف NA) وdichroics المناسب (DM) والمرشحات ممر الموجة لعزل الانبعاثات الفلورسنت من fluorophores (نستخدم 525/50 DM560، DM640 600/60، 685/70 و، لفصل YFP، والنيل الأحمر إلى الأصفر البرتقالي، وقنوات الحمراء الموسعة، على التوالي). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان أكثر من 3٪ من محاور عصبية تظهر الأجسام الشبه الكروية محور عصبي أثناء التصوير الأساسي (30-60 دقيقة)، ونبذ إعداد بسبب القطع الأثرية التي يسببها المجرب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحث على LiSCI بواسطة المكبرة مجال الرؤية ل30.3X (لخلق ~ 20 ميكرون قطر الاجتثاث). ضبط الليزر إلى 800 نانومتر، وزيادة قوة الليزر ل~ 110 ميغاواط فيالعينة. سماح 5 ميدانية كاملة من بالاشعة عرض ليزر لضمان مقطوع الألياف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد LiSCI عن طريق تغيير إعدادات الليزر إلى الإعدادات التصوير (950 نانومتر، 17 ميغاواط في العينة، 2.08X) ومسح الأنسجة لتصور الاجتثاث. تحقق من قطر الاجتثاث وأن محاور ذاب الأولية ومقطوع تماما (انظر الشكل 3D). استخدام إعدادات الوقت الفاصل على المجهر جنبا إلى جنب مع التقاط ض لتسجيل الاستجابة الديناميكية من المحاور والمايلين إلى إصابة ما يصل إلى 8-10 + ساعة بعد الإصابة. ملاحظة: إذا كان الاجتثاث غير مكتمل (أي transection ناقصة من الألياف)، ونبذ إعداد، وتحديد آليات الإصابة الأولية والثانوية سيتم مرتبك. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تصوير شرائح الحبل الشوكي معزولة تصل إلى 24 ساعة بعد LiSCI مع خفيفة الى معتدلة فقط تلف الأنسجة LiSCI مستقل. </li></ol>

<ol>
	<li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS.">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).</li><li>Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+regulating+axon+regeneration:+an+integrin+perspective.">Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective.</a> Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).</li><li>McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+in+combinatorial+approaches+for+spinal+cord+regeneration.">Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration.</a> Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).</li><li>Pernet, V., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Nogo-A+in+axonal+plasticity,+regrowth+and+repair.">The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair.</a> Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).</li><li>Bradbury, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitinase+ABC+promotes+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury.</a> Nature. 416, 636-640 (2002).</li><li>Cregg, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+beyond+the+glial+scar.">Functional regeneration beyond the glial scar.</a> Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).</li><li>Park, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+axon+regeneration+in+the+adult+CNS+by+modulation+of+the+PTEN/mTOR+pathway.">Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway.</a> Science. 322, 963-966 (2008).</li><li>Coleman, M. P., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration,+wld(s),+and+nmnat.">Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).</li><li>Sulaiman, W., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+peripheral+nerve+injury,+regeneration,+and+functional+recovery:+from+bench+top+research+to+bedside+application.">Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application.</a> Ochsner J. 13, 100-108 (2013).</li><li>Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+a+new+growth+cone+after+axotomy:+the+precursor+to+axon+regeneration.">Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).</li><li>Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganized+microtubules+underlie+the+formation+of+retraction+bulbs+and+the+failure+of+axonal+regeneration.">Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration.</a> J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).</li><li>Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+degeneration+'dieback'+in+the+corticospinal+tract+after+transection+injury+of+the+rat+spinal+cord:+a+confocal+microscopy+study.">Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study.</a> J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).</li><li>Fishman, P. S., Mattu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+severed+cortical+projection+axons.">Fate of severed cortical projection axons.</a> J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).</li><li>McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+activated+phagocytes+and+myelin+degeneration+to+axonal+retraction/dieback+following+spinal+cord+injury.">The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury.</a> Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).</li><li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+treatment+reduces+delayed+oligodendrocyte+death,+attenuates+axonal+dieback,+and+improves+functional+outcome+after+spinal+cord+injury.">Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+laser-scanning+microscopy+of+Ca2++dynamics+in+visual+motion-sensitive+neurons.">In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons.</a> Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).</li><li>Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+of+cortical+astrocytic+networks+in+vivo.">Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo.</a> PLoS Biol. 2, 96 (2004).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-+and+short-term+intravital+imaging+reveals+differential+spatiotemporal+recruitment+and+function+of+myelomonocytic+cells+after+spinal+cord+injury.">Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury.</a> J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+single+neuron+axotomy+triggers+axon+regeneration+to+restore+synaptic+density+in+specific+cortical+circuits.">In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits.</a> Nat Commun. 4, 2038 (2013).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo.">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58, 1133-1144 (2010).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+microglia+in+the+mouse+cortex+in+vivo.">Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation.">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nat Commun. 3, 1227 (2012).</li><li>Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+maintenance+of+molecular+domains+in+myelinated+axons.">Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons.</a> J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).</li><li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2-mediated+alternative+activation+of+microglia+is+protective+after+spinal+cord+injury.">Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury.</a> Brain. 137, 707-723 (2014).</li><li>Greenspan, P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrofluorometric+studies+of+the+lipid+probe,+nile+red.">Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red.</a> J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).</li><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).</li><li>Tajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hemodynamic+response+to+acute+hyperoxia+in+awake+mice.">Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice.</a> Brain Res. 1557, 155-163 (2014).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80, 900-913 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+behavior+activates+Bergmann+glial+networks.">Motor behavior activates Bergmann glial networks.</a> Neuron. 62, 400-412 (2009).</li><li>Tsutsui, S., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+injury+to+axons+and+myelin.">Metabolic injury to axons and myelin.</a> Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).</li><li>Matute, C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+white+matter+in+central+nervous+system+pathophysiologies.">Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies.</a> ASN Neuro. 4, (2012).</li><li>Matute, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dyshomeostasis+in+white+matter+pathology.">Calcium dyshomeostasis in white matter pathology.</a> Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).</li><li>Stys, P. K., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+matter+NMDA+receptors:+an+unexpected+new+therapeutic+target.">White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target.</a> Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).</li><li>Baltan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+anoxia:+a+tale+of+two+white+matter+tracts.">Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts.</a> Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).</li><li>Stirling, D. P., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+injury:+internodal+nanocomplexes+and+calcium+deregulation.">Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation.</a> Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues.">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys J. 89, 581-591 (2005).</li><li>Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration.">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li><li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons.">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li><li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

نحن تصف طريقة التصوير خارج الحي الحبل الشوكي محاور العصبي (أي الحزمة النواة الناحلة) جنبا إلى جنب مع إصابة الحبل الشوكي التي يسببها الليزر لدراسة تطور ديناميكي كل من انحطاط محور عصبي مياليني الابتدائي والثانوي مع مرور الوقت. خارج الحي التصوير من سطح الحبل الشوكي يتغلب على العديد من المضاعفات المرتبطة التصوير في الجسم الحي مثل الحركة الفنية والإمكانات التي يسببها نقص الأكسجة المجرب خلال جلسات التصوير لفترات طويلة. هذا البروتوكول يعزل قطاع عنق الرحم بأكمله من الحبل الشوكي باستخدام perfusates المؤكسج التي تحتوي على الكالسيوم منخفض 2+ والابتعاد عن الضرر من الألياف محور عصبي المغطي، نكسة شيوعا التي تواجهها خلال العمود الظهري البطني أو البيضاء الاستعدادات قطاع المسألة. بالإضافة إلى ذلك فإنه يمكن للباحث للتلاعب المكروية الحبل الشوكي معزولة في قبل أو بعد إصابة الحبل الشوكي (على سبيل المثال، وتعديل الكالسيوم 2+تركيز و / أو إضافة الكواشف الدوائية). وعلى النقيض من transection، كدمة، أو سحق نماذج اصابات النخاع الشوكي التي تؤثر على مساحة واسعة من محاور عصبية، وطبيعة مركزة للغاية من LiSCI تسمح الدراسة في وقت واحد من الإصابة الأولية (محاور مقطوع) والضرر المحاور الثانوية التي تحدث في وقت لاحق. وخارج الحي التصوير وصفها وبروتوكول LiSCI يمكن استخدامها لتحقيق المكونات الأخرى للإصابة المادة البيضاء بما في ذلك إزالة الميالين، neuroinflammation الناجمة عن CNS المقيمين الخلايا المناعية بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة، وآليات الإصابة الدماغية / نقص الأكسجين. هذه الدراسات يمكن أن تركز أيضا على محاور العمود الظهري كما في بروتوكول أو تعديلات الحالي يمكن إدخالها على صورة أخرى في العمود الفقري مساحات المادة البيضاء الموجودة بشكل سطحي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام غيرها من سلالات الفئران المعدلة وراثيا المعدلة وراثيا أو مزدوجة مع هذا البروتوكول لدراسة تفعيل / أنشطة خلايا الجهاز العصبي المركزي المقيمين. هناك العديد من يخدع الحرجsiderations لعزل ناجحة والتصوير من الفئران خارج الحي الحبل الشوكي. أولا، تحتاج إلى مخازن ACSF أن تبقى المؤكسج لمنع نقص الأكسجة. يجب أن تبقى الحبل الشوكي رطبة من الغرق في ACSF الاوكسيجين أثناء وبعد العزلة. أثناء تشريح، فمن الأفضل لتقليل إجهاد ميكانيكي على الحبل الشوكي مثل الضغط المفرط من الانسحاب النسيج المغطي بحزم جدا وتمتد / ثني الحبل الشوكي عند التخليص الأنسجة تحت شريحة العمود الفقري. وعلاوة على ذلك فمن الأهمية بمكان أن لا تلمس / ضغط الأعمدة الظهرية الحبل الشوكي. الحفاظ على درجة الحرارة المثلى سائل الإرواء ACSF في غرفة التصوير المهم أيضا منذ بيئة حموي قد يشدد أنسجة الحبل الشوكي. للتأكد من أن محاور ومقطوع تماما خلال LiSCI، من المهم لشل حركة قطاع النسيج في غرفة خارج الحي للحد من حركة الأنسجة المحتملة خلال ablat الليزرأيون. بالإضافة إلى ذلك الأنسجة في موقع الاجتثاث المطلوب يجب أن شقة تقع في غرفة التصوير (عمودي على عدسة الهدف). يقوم LiSCI على الأنسجة التي ليس مستوى يؤدي إلى الاجتثاث يميل مما يعقد تحليل الصور اللاحقة، ويقلل من وضوح الصورة بشكل عام. وأخيرا، وعمق الأنسجة من الاستئصال بالليزر قد يؤثر على النتائج LiSCI. نقترح تحديد نقطة اتصال للالاجتثاث الى نحو 12-15 ميكرومتر تحت الأم الحنون. وهناك أوجه القصور الرئيسية لاستخدام هذا النموذج التصوير خارج الحي لدراسة آليات محور عصبي وإصابة المايلين هو أن آثار الخلايا المشتقة من الدم الطرفية التالية LiSCI لا يمكن تحديدها. وعلاوة على ذلك، لأن هذا هو نموذج المحطة، والنتائج السلوكية وتجديد بعد الإصابة لا يمكن تقييمها. ومن المعوقات في هذا فيفو السابقين LiSCI نموذج التصوير التي يتم مشاركتها مع التصوير في الجسم الحي هو عمق قادرة على أن تحل بسبب ضوء قوي الشوريattering خصائص المادة البيضاء الحبل الشوكي. وهكذا، وهذا خارج الحي الحبل الشوكي نموذج التصوير يركز في المقام الأول على التوقعات المركزية تصاعدي من العقدة الجذرية الظهرية الخلايا العصبية الحسية التي هي الألياف التي يمكن الوصول إليها لتصور لأنها تقع على طول السطح الظهري للحبل الشوكي. مساحات مياليني أخرى محور عصبي مثل تنازلي المحاور الحركية قد تتفاعل بشكل مختلف بعد الإصابة مقارنة مع محاور عصبية حسية تصاعدي الموثقة في هذا البروتوكول. آخر القيد المشتركة لكلا التصوير في الجسم الحي ومع شركائنا في بروتوكول التصوير المجراة سابقا هي مدة التصوير. في حين أن هذا الأسلوب خارج الحي هو وسيلة ممتازة لدراسة آليات الإصابة الحادة، والتغيرات محواري طولية التصوير على المدى الطويل في نفس السابقين قطاع الأنسجة الحية قد يكون قابل للتطبيق. نحن عادة صورة النسيج الحبل الشوكي معزولة عن 6-10 ساعة بعد LiSCI دون أي تلف الأنسجة LiSCI مستقل ملحوظ. ومع ذلك، لدينا تصوير شريحة الحبل الشوكيما يصل إلى 24 ساعة بعد LiSCI فقط مع تدهور الأنسجة المعتدل لا صلة له بالضرر الناجم. ومع ذلك، إذا تم تصوير جزء الحبل الشوكي لفترات أطول من الوقت، سيكون هناك حتما بعض انهيار الأنسجة التي هي مستقلة عن الاستئصال بالليزر. وعلى الرغم من هذه القيود في منطقتنا خارج الحي الحبل الشوكي LiSCI النموذج المقترح، والمعرفة التي يمكن الحصول عليها من هذا فيفو السابقين التصوير الحبل الشوكي وLiSCI نموذج -من القدرة رواية للتمييز بين الإصابة الأولية وإصابة ثانوية في الوقت الحقيقي لتقييم فعالية الكواشف الدوائية والتلاعب البيئية بعد injury- قد تسفر عن بصيرة لا تقدر بثمن إلى آليات لمحواري دينامية والردود المايلين التالية الإصابة.

انحطاط المحاور هو سبب بارز للمراضة والتي تمتد عدة شروط العصبية بما في ذلك رضح عصبي والسكتة الدماغية وأمراض المناعة الذاتية، والأمراض العصبية. وخلافا للنظام العصبي المحيطي (السندات الإذنية)، والجهاز العصبي المركزي (CNS) محاور لديها قدرة محدودة على التجدد أصيب مرة واحدة على حد سواء بسبب الحواجز الجوهرية وخارجي (أي الجزيئات المثبطة لنمو محور عصبي أنتجت خلال تشكيل ندبة وحررت خلال انحطاط المايلين) 1 -7. على الرغم من أن العديد من هذه الحواجز قد تم استكشافها على نطاق واسع، والتدخلات العلاجية التي تهدف لمنع CNS انحطاط محور عصبي، وتعزيز تجدد المحاور قوي، واستعادة connectively وظيفية، تظل محدودة. محاور مرة واحدة وفصلها عن سوما على الخضوع لعملية النمطية للانحطاط المعروفة باسم ولري انحطاط التي تتميز تورم محور عصبي، وتشكيل كروي والتفتت في نهاية المطاف (استعراضها في 8). فيالنقيض من ذلك، الجدعة الداني أن يبقى في الاستمرارية مع سوما من محور عصبي محيطي مقطوع، يشكل تورم في نهايته، يموت العودة إلى أقرب عقدة رانفييه، ومن ثم يمكن بدء تشكيل مخروط النمو، وهو شرط أساسي حيوي ضروري لتجدد المحاور لاحق 9-11. في المقابل، فإن النهايات محور عصبي القريبة من العديد من المحاور المركزية تشكل &quot;endbulbs&quot; سمة أو المصابيح التراجع، تفشل في تشكيل مخاريط النمو، وبدلا من التراجع بعيدا عن موقع الإصابة حيث تبقى لأشهر بعد الإصابة 12-15. بالإضافة إلى إصابة محور عصبي الأولية، قد تحدث إضافية محور عصبي الضرر / الخسارة أيضا إلى المحاور التي نجت إلى حد كبير من الإصابة الأولية. ويشار إلى هذا تأخر فقدان محور عصبي من المحاور يدخر في البداية إلى انحطاط محور عصبي الثانوي. هذا الرد المتأصلة من المحاور CNS إلى إصابة يجعل تجدد المحاور وظيفية هدفا أكثر صعوبة لتحقيق في الدماغ والحبل الشوكي. وعلى الرغم من هكتارllmarks الإصابة محور عصبي (على سبيل المثال، وتشكيل كروي، والمصابيح تراجع) اتسمت جيدا من الأنسجة بعد الوفاة ونماذج تجريبية من انحطاط محور عصبي، وقد تم تقييد توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات الديناميكية. تعتمد معظم هذه الدراسات على الملاحظات نقطة النهاية الثابتة التي فشلت بطبيعتها لالتقاط الردود محور عصبي الفردية مع مرور الوقت. على الرغم من تطبيقها خارجيا كانت استشفاف محور عصبي مفيد لتوضيح الردود محواري من أقسام ثابتة وخلال التصوير الحي، وتوافر علامات محور عصبي المشفرة وراثيا قد تحسنت كثيرا قدرتنا على تصور محاور في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر مضان. في الواقع، قدمت تقريرا المنوي من Kerschensteiner وزملاؤه أول دليل مباشر على انحطاط محور عصبي والتجديد في الجسم الحي باستخدام Thy1 -GFP-S الفئران التي تكود البروتين الفلوري الأخضر في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية التي ترسل توقعاتهم في الأعمدة الظهرية من العمود الفقريالحبل 16. تصوير حي النهج باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (TPLSM) ويستمر الجيني وضع العلامات بروتين فلوري الخلايا التي تهم تقديم أدلة مباشرة والبصيرة الميكانيكية في العديد من العمليات الحيوية المختلفة مثل التنكس محور عصبي، كاليفورنيا 2+ الإشارات، تجدد المحاور، نجمية علم وظائف الأعضاء، علم وظائف الأعضاء دبقية، واستجابة لإصابات 17-25. وعلى النقيض من محاور عصبية، لا يعرف إلا القليل جدا من الردود المايلين الاصابة في الوقت الحقيقي. المايلين هو مكون أساسي من مكونات المادة البيضاء المنتجة والتي تحتفظ بها قليلة التغصن في خلايا الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي شوان في. المايلين يعزل 99٪ من سطح محاور وبذلك يوفر عالية المقاومة ومنخفضة السعة أغطية واقية التي تدعم نشر دفعة قفزي السريع والفعال، استعرض مؤخرا من قبل Buttermore وآخرون. 26. للقبض على الاستجابة الديناميكية المايلين إلى إصابة نستخدم solvatochromic، محبة للدهونصبغة الفلورسنت النيل الأحمر 27. خصائص solvatochromic هذا وصمة عار الحيوية تسمح التحولات الطيفية من الطيف الانبعاثات التي تعتمد على البيئة الفيزيائية والكيميائية 28،29. هذه الخصائص هي مفيدة لاكتساب نظرة ثاقبة آليات الإصابة axomyelinic ويمكن تصور استخدام dichroics اختيار مناسب والمرشحات الانبعاثات أو حلها باستخدام المجهر الطيفي 27. على سبيل المثال، النيل الأحمر طيف الانبعاث هو الأزرق تحول في بيئات غنية بالدهون أقل القطبية مثل تلك الموجودة في الخلايا الشحمية وطبيعية CNS المايلين (الانبعاثات ذروة ~ 580-590 نانومتر) 27. في المقابل، قمم طيف الانبعاث هذه الصبغة الحيوية في في ~ 625 نانومتر في endbulbs كما شكلت محاور تخضع السقم محور عصبي 27. على الرغم من أن الآليات الدقيقة الكامنة وراء هذه التحولات الطيفية تحديدا في endbulbs مقابل المايلين طبيعيا لا تزال غير واضحة، قد مثل هذه التغييرات الطيفية تكشف عن التعديلات الأساسية في تراكم البروتين أو الفوضى مما أدى إلىتعرض مواقع الربط مسعور 27. بينما التصوير في الجسم الحي هو المقياس النهائي لمراقبة الحبل الشوكي ديناميات إصابة محور عصبي في بيئتهم المحلية، فمن الصعب فنيا ويتطلب خبرة جراحية كبيرة، وغالبا ما يكرر عملية جراحية لفضح العمود الظهري التي قد يعرض القطع الأثرية التجريبية (على سبيل المثال، والتهاب وندبة التأسيس). وبالإضافة إلى ذلك، في كثير من الأحيان هناك حاجة إلى معدات مكلفة للسماح للتعليق وتحديد المواقع حيوان سليمة تحت المجهر عدسة موضوعية. تحتاج الحيوانات التي يتعين رصدها بعناية وكذلك لضمان أنها لا تزال دافئة، لضمان تجديد السوائل، وضمان عدم وجود علامات نقص الأكسجين بسبب جلسات التصوير تخدير لفترة طويلة. وهذا الأخير هو في غاية الأهمية كما المحاور والمايلين تتطلب تماما نضح المستمر ومستويات الأكسجين الكافية لتبقى قابلة للحياة. ومع ذلك، وهذا هو في كثير من الأحيان لم يبلغ عنها أو رصدها في معظم الدراسات المجراة لالتاريخ. وبالإضافة إلى ذلك، والتحف الحركة نظرا لمعدل ضربات القلب والتنفس (الأيزوفلورين تخدير الماوس الكبار: ~ 300-450 نبضة في الدقيقة (BPM) هو الأمثل للحفاظ على 97-98٪ تشبع الأكسجين (المعدل الطبيعي ~ 632 BPM) و ~ 55-65 الأنفاس لكل دقيقة (المعدل الطبيعي هو ~ 163 نفسا في الدقيقة)، على التوالي)) 30 واجهتها خلال المجراة الشوكي جعل التصوير الحبل التفريق الردود إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية باستخدام عالية الدقة مضان المجهر تحدي حتى أسرع المسح الضوئي الليزر هي حتما تخضع لهذه الحركة التحف. التقدم في فائق السرعة الماسحات الضوئية الرنانة جنبا إلى جنب مع جامدة الفقري نافذة زرع مؤطرة قد يسمح التصوير من الحبل الشوكي الفئران في الحيوانات المستيقظة، ولكن مرات أسرع المسح الضوئي حتما يقلل من إشارة إلى نسبة الضوضاء جودة الصورة المهينة. المزيد من التحسينات في تقنيات التصوير الحبل الشوكي تستخدم حاليا لتصوير الدماغ قد التغلب على كثير من هذه العقبات وتحد يفند المحتملة التي أدخلتها ماننضح الأنسجة dequate، على سبيل المثال، 31-33. وقد تم تحديد معظم ما هو معروف عن البيض علم وظائف الأعضاء وآليات الإصابة المادة البيضاء مسألة استخدام في المختبر أو خارج الحي الاستعدادات من المادة البيضاء من العصب البصري، الأعصاب الطرفية، وشرائح من الحبل الشوكي المادة البيضاء 34-41. استمرت هذه التحضيرات لدفع معرفتنا آليات إصابة المادة البيضاء، التي تسمح تسيطر التغيرات في العوامل البيئية، وتطبيق رقابة من الأدوية والكواشف، وتقييمات الوظيفية باستخدام الكهربية، والملاحظات مضان المجهر مباشرة من المحاور والميلين في الأنسجة الحية. ومع ذلك، وبعض الأساليب السابقة لمراقبة محاور عصبية من الحبل الشوكي شرائط العمود الظهري البطني أو شرائط المادة البيضاء حتما تجرح محاور السطح خلال مرحلة إزالة التي قد تؤثر على استجابة من المحاور تعارض بشكل وثيق. للاستفادة من التلاعب التجريبية أعلاه وتجنب الأضرار التي لحقت هاءالألياف راي قيد التحقيق، ونحن نستخدم نموذج الحبل الشوكي العنقي خارج الحي كما أنه يمنع الاتصال المباشر من الجانب الظهري للحبل. وهكذا، فإن بنية الأم الحنون والمجاورة محاور العمود الظهري سطحية لا تزال قابلة للحياة ورابط الجأش أثناء العزلة. نحن هنا وصف نهج بسيط نسبيا التي تسمح التصور المباشر لmyelinated محاور عصبية مركزية كما أنها تستجيب بشكل ديناميكي لإصابة تنسيق في الوقت الحقيقي يصل إلى 8 - 10+ ساعة بعد الإصابة. إصابة الحبل الشوكي (LiSCI) نموذج الليزر التي يسببها يسمح التفريق بين آليات إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية والآفة الأولية (الموقع الاجتثاث) ما زال مقيدا مكانيا مع مرور الوقت. غرفة التصوير حمام مفتوح يمكن الوصول إلى التدخل العلاجي، والتسليم الكاشف، والتلاعب البيئية. وكلاء واقية axomyelinic المفترضة يمكن تقييم بسرعة في الوقت الحقيقي من خلال الملاحظات المباشرة مقابل تجارب طويلة ومكلفة تنطوي عملية النسيججي، باجتزاء، المناعية، والتقاط الصور، والتحليل، وبالتالي تقدم نموذجا بديل مفيد لتقييم الردود الحادة والتلاعب وقائية قبل اختبار وكلاء التجريبية في الحيوانات الحية.

<table><tbody><tr><td>Large bath chamber with slice supports</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Standard Slice Supports</td><td>Warner Instruments</td><td>SS-3</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-27LP/10</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-1L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Solution In-line heater/cooler</td><td>Warner Instruments</td><td>SC-20</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Liquid Cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Cable assembly for heater controllers</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td><td>Warner Instruments</td><td>TS-70B</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Magnetic holder with suction tubing</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH-S</td><td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adjustable holder</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH</td><td>To hold the temperature probe</td></tr><tr><td>clear silicone sealant</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>superglue</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>thin plexiglass strips</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>nile red</td><td>Life Technologies</td><td>N-1142</td><td>For labeling myelin</td></tr></tbody></table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

فشلت محاور CNS المصابين إلى تجديد وغالبا ما تتراجع بعيدا عن موقع الإصابة. محاور تنج من الإصابة الأولية قد يخضع لاحقا انحطاط محواري الثانوي. عدم تشكيل مخروط النمو، والتجديد، وفقدان التوقعات محور عصبي مياليني إضافية داخل الحبل الشوكي يحد بشكل كبير الانتعاش العصبية التالية الإصابة. لتقييم مدى أهمية myelinated محاور عصبية من الحبل الشوكي تستجيب للإصابة، وضعنا على فيفو السابقين الذين يعيشون نموذج الحبل الشوكي باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتين أصفر فلوري في المحاور والوصل واستنساخه للغاية إصابات الحبل الشوكي التي يسببها الليزر لتوثيق مصير محاور والمايلين (محبة للدهون صبغة الفلورسنت النيل الأحمر) مع مرور الوقت باستخدام اثنين من الفوتون الإثارة الوقت الفاصل بين المجهري. العمليات الديناميكية مثل الإصابة الحادة محور عصبي، تراجع محور عصبي، وانحطاط المايلين هي أفضل درس في الوقت الحقيقي. ومع ذلك، فإن الطبيعة غير المحورية لإصابات القائم على كدمة والتحف واجهت الحركةخلال المجراة الشوكي جعل التصوير الحبل التفريق الردود إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية باستخدام عالية الدقة المجهر تحديا. وفيفو السابقين نموذج الحبل الشوكي هو موضح هنا يحاكي جوانب عديدة من كدمة / التي يسببها ضغط الأمراض محور عصبي ذات الصلة سريريا بما في ذلك تورم محور عصبي، وتشكيل كروي، transection محور عصبي، وشبه محواري تورم تقديم نموذجا مفيدا لدراسة هذه العمليات الدينامية في الوقت الحقيقي. المزايا الرئيسية لهذا النموذج هي قرار الزماني المكاني الممتاز الذي يسمح التمايز بين إهانة الأولية أن يجرح مباشرة محاور وآليات الإصابة الثانوية؛ ضخ تسيطر عليها من الكواشف مباشرة إلى الاستحمام سائل الإرواء الحبل. التعديلات دقيقة من الوسط البيئي (على سبيل المثال، والكالسيوم، أيونات الصوديوم، والمساهمين المعروف أن الإصابة محور عصبي، ولكن بالقرب من المستحيل التلاعب في الجسم الحي)؛ ونماذج الفئران كما تقدم ميزة لأنها توفر فرصة لتصور والتلاعب السكان الخلية التي تم تحديدها وراثيا والهياكل التحت خلوية. هنا، نحن تصف كيفية عزل وصورة الحبل الشوكي الحية من الفئران لالتقاط ديناميات إصابة محور عصبي حاد.

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time at JoVE.com

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K Views.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

Video: An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

يعيش بين محاور التصوير الجذر الظهرية بعد بضع الجذور

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

الليزر Nanosurgery من مخيخي محاور عصبية<em&gt; في فيفو</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

إجراء لغرس الدائرة العمود الفقري للالطولية<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من الحبل الشوكي ماوس

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

التصوير حيوي داخلي من محور عصبي التفاعل مع الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة في ماوس الظهرية الإصابات سحق العمود

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Photothrombosis الناجم عن نقص التروية التنسيق نموذجا من اصابات الحبل الشوكي في الفئران

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Medicine

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

فيفو في الأسلوب الثنائي-اللون لتصوير الأوعية الدموية ديناميات بعد إصابة الحبل الشوكي كونتوسيفي

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

نموذج إصابة المورفولوجية في فيفو لدراسة نيوروريجينيريشن في الطرفية والجهاز العصبي المركزي

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

في الوقت الحقيقي تقييم النخاع الشوكي Microperfusion في نموذج Porcine من الإقفارية / Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes this animal model very useful for studying spinal cord injury and regeneration. The standard protocol for inducing such lesions is to transect the dorsal part of the trunk manually. However, this technique requires extensive training and damages additional tissues. A protocol was developed for laser-induced lesions to circumvent these limitations, allowing for high reproducibility and completeness of spinal cord transection over many animals and between different sessions, even for an untrained operator. Furthermore, tissue damage is mainly limited to the spinal cord itself, reducing confounding effects from injuring different tissues, e.g., skin, muscle, and CNS. Moreover, hemi-lesions of the spinal cord are possible. Improved preservation of tissue integrity after laser injury facilitates further dissections needed for additional analyses, such as electrophysiology. Hence, this method offers precise control of the injury extent that is unachievable manually. This allows for new experimental paradigms in this powerful model in the future.

The present protocol describes a method to induce tissue-specific and highly reproducible injuries in zebrafish larvae using a laser lesion system combined with an automated microfluidic platform for larvae handling.

الإصابات شبه الآلية التي يسببها الليزر لدراسة تجديد الحبل الشوكي في يرقات أسماك الزرد

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

ل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video