Name: rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling at JoVE.com

الكتاب يعترف كثيرا بيير Bourdoncle، توماس غيلبير ولويز Rimbault مرفق كوشين التصوير. وأيد هذا العمل من قبل INSERM، CNRS والدوري الفرنسي الوطني مناهضة جنيه السرطان (إيكيب labellisée).

1. إعداد الخلايا اللمفاوية T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الماوس الأساسي أو خلايا T الإنسان كما هو موضح 10،11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا T الإنسان في كامل المتوسطة RPMI مع المصل البشري 10٪ AB في مناطق ذات كثافة من 2-3 × 10 6 خلية / مل. ملاحظة: استخدام مصل الجنين العجل (FCS) بدلا من المصل البشري يمكن أن تثير الاستقطاب عفوية لجزء كبير من الخلايا T الإنسان في الثقافة. تبقى هذه الخلايا في الثقافة لمدة 4 - 5 ايام وعملية أخرى لهم في أي وقت خلال هذه الفترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خلايا فأر T في كامل المتوسطة RPMI تستكمل مع 10٪ FCS في مناطق ذات كثافة خلية مماثلة. استخدام على الفور أو في اليوم التالي، وبعد O / N الثقافة عند 37 درجة مئوية في ظل وجود 10 نانوغرام / مل IL7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة T خط الخلية CEM الإنسان في استكمال كامل RPMI مع 10٪ FCS. </li></ol> 2. تحفيز Chemokine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 5 × 10 5 خلايا لكل حالة تجريبية في المتوسط ​​الدافئة HBSS تستكمل مع 10 ملي Hepeالصورة. وبالنسبة لبعض التجارب، وشارك في بالنقل خلايا T الإنسان الأساسي في اليوم السابق مع 2 ميكروغرام pmaxGFP و 8 ميكروغرام pcDNA3.1 + (ناقلات الفارغة، والسيطرة)، PKCζ كيناز الميتة، أو البلازميدات Par6 N-الطرفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في المتوسط ​​الدافئة HBSS-HEPES (استخدام 0.3 مل × عدد الظروف التجريبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع الخلايا في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. ملاحظة: ولذلك، فإن أنبوب واحد المقابلة لحالة تجريبية واحدة تحتوي على 5 × 10 5 الخلايا في 0.3 مل HBSS-HEPES المتوسطة. وبالنسبة لبعض التجارب، وإضافة 500 نانومتر Latrunculin A أو السيارة (DMSO)، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة قبل التحفيز chemokine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10-500 نانوغرام / مل CCL19 أو CXCL12 chemokine في كل أنبوب. ملاحظة: نحن عادة استخدام 10-200 نانوغرام chemokine مل / للخلايا T الإنسان. خلايا CEM لا تعبر عن مستقبلات CCR7 التي تربط CCL19. ولذلك، فإن خلايا CEM تكون قادرة على الاستجابة لتحفيز CXCL12 فقط. وعلاوة على ذلك، استخدام تركيزات أعلى chemokine (300-500 نز / مل) إلى استقطاب خلايا فأر T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه الأنابيب عدة مرات، واحتضان لهم في 37 ° C حمام الماء لمدة 8 أو 10 دقيقة للخلايا T الابتدائية أو CEM، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف عملية الاستقطاب عن طريق إضافة إلى كل أنبوب 0.3 مل من محلول دافئ يحتوي على 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) و10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني. الوجه الأنابيب واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li></ol> 3. Stainings <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا من أنابيب microcentrifuge في التدفق الخلوي الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنابيب تماما مع حل RT تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 460 x ج لمدة 4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من حل RT تحتوي على 5٪ FCS في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من FITC المضادة للHLA-ABC في كل أنبوب، دوامة لهم، واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في RT، بعيدا عن الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ FCS، وهوND مرة واحدة مع PBS فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في RT: إضافة 500 ميكرولتر 1٪ PFA، واحتضان لمدة 10 دقيقة، ثم يغسل الخلايا مع محلول يحتوي على 1٪ BSA، 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف، وملء أنابيب تماما بمحلول PBS تحتوي على 0.2٪ BSA، 0.1٪ سابونين، 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES (العازلة permeabilization). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين في هذه الوسيلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه الأنابيب لإزالة المتوسطة ودوامة لهم لفصل بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.25 ميكروغرام / مل TRITC-Phalloidin و / أو 1: 100 التخفيف من مكافحة P-ERM الأجسام المضادة لكل أنبوب، دوامة لهم واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع المخزن المؤقت permeabilization. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر PBS ونقلها إلى أنابيب microcentrifuge. ملاحظة: خلايا جاهزة للشراء. بدلا من ذلك، مع الحفاظ على حجم الحد الأقصى لمجموع 200 ميكرولتر في الأنبوب، إضافة المركزة PFA إلى النهائي 1٪تركيز من أجل الحفاظ على stainings إذا لم يتم استخدام خلايا في نفس اليوم لمزيد من المعالجة. </li></ol> 4. الصور اقتناء وتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على جهاز (انظر الجدول من الكواشف محددة / المعدات) والسماح لها معايرة نفسه وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: تم استخدام البرنامج INSPIRE مع الهدف 40X (0.75 NA). تم استخدام IDEAS 3.0 برامج لجميع quantifications المبلغ عنها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة من النوافذ الاستحواذ والتي يمكن حفظها في قالب للتجارب المستقبلية. رسم رسوم بيانية أن تحديد القيم التدرج RMS. من &quot;تحت المجهر&quot; السكان، واختيارهم على الرسم البياني RMS التدرج، delimitate &quot;خلية واحدة&quot; السكان على الرسم البياني للمنطقة. مرة واحدة وقد تم إدخال أنبوب microcentrifuge في الجهاز، وضبط قوة الليزر، بوابة على الخلايا الفردية واكتساب 5،000 اللمفاويات التائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الأفكار الناعمةوير، فتح ملف اقتناء وإنشاء الرسم البياني التي سوف تظهر قيمة قيمة RMS التدرج للصور المجال مشرق (القناة 1) التي تم الحصول عليها لكل خلية على حدة. رسم بوابة على الرسم البياني التدرج RMS التي تعتبر الخلايا العارضة RMS قيمة التدرج فوق 57. ملاحظة: التدرج RMS يسمح مع الأخذ بعين الاعتبار في التحليل فقط الخلايا الليمفاوية T التي هي في المستوى البؤري. لقد تحدد تجريبيا أن الخلايا الفردية واظهار قيمة التدرج RMS متفوقة على 57 هي في المستوى البؤري، ويمكن اعتبارها بشكل دقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في / القائمة أقنعة تحليل، وخلق قناع جديد، ودعا تآكل (M01،2) من قناع التشكل على الصور brightfield M01، تآكلت من 2 بكسل. ثم، في تحليل / ملامح القائمة، وخلق ميزة جديدة للمنطقة، وتحسب على تآكل (M01،2) قناع. من الخلايا المحددة في البوابة السابقة، فتح الرسم البياني يبين مجال الخلايا باستخدام هذا القناع تم إنشاؤه حديثا. أقنعة والتشكل التي تتوفر حسب: ملاحظةالافتراضية هي أكبر بكثير من الحجم الفعلي للخلية. وبالتالي، فمن أكثر دقة لتآكل ليصل إلى 2 بكسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم بوابة على خلايا T الفردية، باستثناء الخرز المعايرة والحطام (المنطقة الصغيرة) والحلل (المنطقة الكبيرة). ضبط هذه البوابة في كل الاستحواذ. ملاحظة: سوف الاختلافات في حجم الخلية يؤثر على موقف البوابة. كما خلايا فأر T هي أصغر من خلايا T الإنسان التي هي نفسها أصغر من خلايا CEM، فإن مساحة كل نوع من الخلايا تكون متناسبة مع حجمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النظر في واحدة، في تركيز الخلايا التي تم بوابات في الخطوات السابقة، فتح مؤامرة نقطة تتكون من الخام ماكس بكسل على تلطيخ HLA-ABC (القناة 2، محور س) بوصفها وظيفة من الخام ماكس بكسل على phalloidin تلطيخ (قناة 4، محور Y). إنشاء بوابة لاستبعاد الأحداث فلوري غير ملوثين أو المشبعة. فتح اثنين من رسوم بيانية تبين الخام ماكس بكسل لHLA-ABC (قناة 2) وphalloidin (قناة 4) stainings. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تحليل / القائمة أقنعة، يخلقعصام قناع جديد، ودعا تآكل (M02،2) من قناع مورفولوجيا الخلايا HLA-ABC الملون (قناة 2)، تآكلت من 2 بكسل. ثم، في تحليل / ملامح القائمة، وخلق ميزة جديدة تتألف من المعلمة الاستدارة، وتحسب على تآكل (M02،2). ملاحظة: يقيس هذا المعامل انحراف شكل خلية من دائرة. ولذلك، فإن خلية T مستديرة تماما يكون لها قيمة عالية دائرية في حين أن الخلايا الاستقطاب ممدود سوف يحمل الرقم القياسي دائرية منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي وقت لاحق، وخلق الرسم البياني آخر من شأنه أن يقدم تقريرا قيم ميزة الاستدارة من الخلايا المغلقة سابقا. استخدام هذا الرسم البياني لرسم مباشرة توزيع الفرد والسكان خلية في التركيز وفقا لقيمة الاستدارة لكل خلية على حدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعند النظر إلى شكل الرسم البياني للخلايا غير حفز، رسم بوابة للخلايا الاستقطاب، ابتداء من الساعة قيمة أدنى دائرية يصل إلى قيمة الحد دائرية، حيث ان معظم الخلايا غير حفزيتم رسم. نظرة على عرض إحصاءات عن النسبة المئوية للخلايا الاستقطاب بين السكان بوابات (٪ بوابات). ملاحظة: لقد حددت هذه البوابة للقيم مؤشر الاستدارة أقل من 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل أن ننظر إلى الاستقطاب من تلطيخ الأكتين في الخلايا، رسم بياني لتفاصيل مشرق قيمة التشابه R3، مقارنة تلطيخ HLA-ABC (قناة 2) وتلطيخ phalloidin (قناة 4). ملاحظة: أكبر قيمة من هذه الميزة، وأكثر فرضه stainings هما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام استراتيجية النابضة نفسها كما كان من قبل، رسم بوابة على الخلايا غير حفز لتلطيخ فصل يبين النسبة المئوية للخلايا مع المستقطب الأكتين تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء، وتظهر النسبة المئوية للخلايا واظهار الفصل في توزيع الدرجة الأولى MHC وstainings phalloidin، النسبة المئوية للخلايا الاستقطاب جنبا إلى جنب مع القيم المتوسطة من الاستدارة والتشابه مؤشرات جميع خلايا ± SD في الموافقوحات إحصاءات onding. </li></ol>

<ol>
	<li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chemokines+and+their+receptors.">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li><li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance.">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li><li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation.">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li><li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions.">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li><li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta:+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells.">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li><li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration.">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li><li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior.">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li><li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+T+cell+shape,+motility,+and+sensitivity+to+antigen.">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409 (2007).</li><li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen+specific+CD4++T+cells+using+MHC+class+II+tetramers.">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes.">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li></ol>

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

باستخدام تقنية حديثة من تدفق التصوير الخلوي، ووضع استراتيجية النابضة سريعة ومفيدة لتحليل الأحداث الخلوية والجزيئية الناجم عن التحفيز chemokine يرد. من تجربة واحدة، يمكن للمرء الحصول على نوعين رئيسيين من المعلومات: التغييرات في مورفولوجية الخلايا الناجم عن التحفيز chemokine وتوزيع التحت خلوية من البروتينات المختلفة أثناء عملية الاستقطاب. ومن المثير للاهتمام، وتقدم الأدلة أيضا على إمكانية تحليل عدد كبير من الخلايا، والذي يسمح متانة الإحصائية والتحليلات ذات الصلة لجزء صغير من السكان خلية كاملة. كما ذكرت، هذه التقنية يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل الأحداث إعادة توزيع الجزيئية في سياق المشبك المناعي (12). وبالإضافة إلى ذلك، فقد تم استخدام مجموعة مماثلة تصل للخلايا T-حفز SDF1 لكن لم يقدم أي تحليل لدرجة شارك في التعريب بين اثنين من علامات 13. رغم أنوبالتالي يمكن لهذه التقنية تكون مناسبة لكثير من أنواع الخلايا، والخلايا الملتصقة لا يمكن تحليلها بشكل مباشر والخلايا في تعليق تحتاج إلى أن تكون ثابتة قبل عملية الاستحواذ. وبالإضافة إلى هذه القيود الجوهرية للآلة، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية عند تحفيز لهم. درجة الحرارة هو في الواقع رئيسية لتحقيق السليم T خلية الاستقطاب منذ التغييرات هيكل الخلية، مثل البلمرة الأكتين الذي يدفع يتغير شكل، تعتمد جدا على درجة الحرارة. لدينا تجارب مع latrunculin والخلايا المعالجة تؤكد أن إعادة عرض الأكتين السليم الناجم عن التحفيز chemokine هو في الواقع حاسما لخلية لتحقيق دولته الاستقطاب بالكامل. وبالإضافة إلى البيانات المقدمة هنا مع هذا الدواء، كما اختبرنا التصوير تكنولوجيا التدفق الخلوي مع الخلايا الليمفاوية T الأساسي الإنسان transfected مع بروتينات متحولة التي تمنع يشير مسار Par6 / PKCζ. باستمرار مع شركائنا في النتائج المنشورة سابقا 7، فإنه يظهر هنا أن هذا قطبية مجمع وavors T خلية الاستقطاب. chemokine على التحفيز، وخلايا T يفقد مورفولوجيا جولة على اعتماد شكل الاستقطاب. لقد وجدنا المعلمة الاستدارة ليكون الأكثر دقة لتحديد تلك التعديلات الشكلية. ومع ذلك، يقترح غيرها من المعالم التي تصف التغيرات شكل من برامج التحليل، مثل نسبة الارتفاع أو استطالة. لذلك، يمكن للمرء بسهولة اختبار مساهمة مسار الإشارات معين أو بروتين معين في هذه العملية. في هذه الدراسة، لاحظنا دائما أن النسبة المئوية للخلايا واظهار الاستقطاب الصرفي أعلى من واحد لالاستقطاب الجزيئي. وهذا يدل على أن جزءا من الخلايا التي تبني تغيير في التشكل لا تقدم إعادة التوزيع الجزيئية كبيرة من علامات درس. هذا يمكن أن تنشأ من حقيقة أن بعض الخلايا تفقد شكلها مستدير بحيث تظهر مؤشر الاستدارة أقل على الرغم من أنها لا تظهر بوضوح الشجريةز حافة وقدم ذنبية. هذه الخلايا T الاستقطاب جزئيا يمكن أن لا تزال تقع في باب خلايا T الاستقطاب شكليا دون تقديم إعادة التوزيع الجزيئية واضحة من علامات نموذجية. وعلاوة على ذلك، فإن الاختلافات في عتبة يشير chemokine التي يمكن أن تكون أعلى لإعادة توزيع الثروة من علامات لإجراء تعديلات الشكل ويمكن أيضا تفسير هذه الاختلافات. فإنه يظهر هنا أيضا أن علامة HLA-ABC لا relocalized في الخلايا T الاستقطاب وليس هناك تغيير في شدة هذه تلطيخ على التحفيز CCL19. على العكس من ذلك، يتم توفير تأكيدا هنا أن الزيادات تلطيخ F-أكتين على العلاج CCL19 (الشكلان 1 و 2) كما هو معروف بالفعل، منذ التحفيز chemokine ينشط الأكتين البلمرة 5. وعلاوة على ذلك، فإنه يظهر أن خيوط الأكتين الحصول على relocalized في الجزء الأمامي من خلايا الاستقطاب. وبالتالي، فإن مؤشر التفاصيل مشرق التشابه الذي يقيس مدى شارك في التعريب بين كلا أماهrkers تميل إلى الانخفاض على التحفيز CCL19. وعلى سبيل المقارنة، يتم توفير مثل هذا التحليل هنا للحصول على درجة F-الأكتين شارك في التعريب مع البروتينات الفوسفات-ERM التي تحصل على استبعادها من أمام الزنزانة. النسبة المئوية للخلايا T-حفز chemokine العارضة F-الأكتين - MHC من الدرجة الأولى الفصل هي أقل بكثير من واحد لF-الأكتين - الفوسفات-ERM (14٪ مقابل 48٪، على التوالي) منذ relocalizes F-الأكتين في الجبهة و البروتينات الفوسفات-ERM في الجزء الخلفي من خلايا T الاستقطاب، بينما لا يتأثر إعادة تقسيم جزيئات MHC من الدرجة الأولى عن طريق تحفيز chemokine. ويمكن بالتالي هذا مؤشر تشابه التفاصيل مشرق استخدامها بشكل منتظم لمقارنة توزيع اثنين علامات في الخلايا T الاستقطاب. لذلك، هذا الأسلوب هو مناسبة جدا لقياس درجة شارك في التعريب أو زملاء استبعاد اثنين من علامات مختلفة على عدد كبير من الخلايا أو ربما على الأحداث النادرة الحالية في السكان الخلية واسع.

كيموكينات هي بروتينات قابلة للذوبان الصغيرة التي تجذب الخلايا لمواقع متخصصة 1. ولذلك، فإنها تشارك في الموضع الصحيح من الخلايا في الأنسجة، وهي وظيفة حاسمة في التنمية وعلم وظائف الأعضاء. الجهاز المناعي ليست استثناء لهذه القاعدة لأنها تعتمد على عمل العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي تعمل في تناسق لجبل استجابة مناعية فعالة. من خلال التحكم في موقع معين من نوع واحد الخلايا المناعية في حالة معينة، كيموكينات هي المطلوبة مسبقا قبل أن يتم الكشف عن المستضدات الأجنبية وتحييدها. في الخلايا الليمفاوية T على وجه الخصوص، كيموكينات تربط لمستقبلات محددة السطح والتي، على المشاركة، وانتزاع العديد من الإشارات بين الخلايا (ارتفاع الكالسيوم، ERK الفسفرة، وتفعيل رو GTPases، وزيادة في integrins تقارب وهيكل الخلية التعديلات) التي تفضل T خلية حركية 2،3. على المستوى الخلوي، ويمكن للمرء أن يلاحظ التغيرات المورفولوجية أثار chemokine على التحفيز.هذه التغيرات في الأشكال خلية مثيرة خصوصا في خلايا T: يستريح خلايا T لها مورفولوجيا مستديرة تشبه حبة عند السفر في مجرى الدم. ومع ذلك، فإن الاستشعار عن وجود كيموكينات في مواقع التهابات أو على القرب من الأجهزة اللمفاوية هو الذهاب الى تغيير شكل خلايا T التي تعتمد الآن على &quot;اليد مرآة&quot; مورفولوجيا نموذجية تتكون من شكل ثنائي القطب: حافة الرائدة في الجبهة وميزة زائدة، أو قدم ذنبية، في الجزء الخلفي 4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمكونات داخل الخلايا تفصل في هذه المناطق المعاكس اثنين من خلية T المستقطبة للحفاظ على الهجرة. على سبيل المثال، ويزيد من خيوط الأكتين البلمرة على chemokine التحفيز 5 و الأكتين بلمرة تتراكم في الجزء الأمامي من T خلية الاستقطاب 2. من ناحية أخرى، والعديد من البروتينات، مثل البروتينات فسفرته من Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) الأسرة التي تربط بين غشاء البلازما إلى القشرية الهيكل الخلوي F-الأكتين، وإعادة توطين في قدم ذنبية من الاستقطابخلايا T 6. ومن المثير للاهتمام، نحن وغيرنا قد أظهرت أن هناك حاجة لهذه العملية الاستقطاب T الهجرة الخلية. والواقع أن أي علاج الذي يتداخل مع الاستقطاب تمنع الحركة الخلوية. على سبيل المثال، وتثبيط لنشاط أعضاء من البروتين غير نمطية تحركات C (PKC) أسرة، وكتل PKCζ وPKCι T الاستقطاب الخلية ولها عملية المسح المهاجرة من الخلايا الجذعية 7. وينظم T خلية الاستقطاب أيضا رو GTPases. لقد أظهرنا أن تعديل النشاط RhoA من البروتين Fam65b وصف مؤخرا يتداخل مع التغيرات الخلايا التائية في التشكل وقدرتها على الهجرة في مقايسة Transwell 6. كما الاستقطاب هو خطوة شرط أساسي لحركية الخلوية، وبالتالي فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على تحديد بأنها قراءات الرئيسية من الردود chemokine. تم إجراء تعديلات شكل خلية قياس سابقا يدويا 8. ومع ذلك، هذا النوع من القياس الكمي هو جدا تستغرق وقتا طويلا، بحيث عادة سوى عدد قليلتؤخذ عشرات الخلايا في الاعتبار. هنا، يتم تقديم طريقة جديدة لقياس بسرعة درجة التعديلات شكل من الخلايا الليمفاوية T تتعرض لchemokine التحفيز. تدفق التصوير الخلوي التكنولوجيا (انظر الجدول من الكواشف محددة / معدات) يستخدم، والذي يجمع بين مزايا تدفق عداد الكريات والمجهر 9 لقياس كفاءة كمية من الخلايا الاستقطاب في ظروف مختلفة من التحفيز chemokine. بالإضافة إلى تقدير حجم التعديلات الشكلية التي يمكن للمرء أن قياس بقوة مع هذه التكنولوجيا، فمن الممكن أيضا لتقييم التغيرات في توطين التحت خلوية من بعض البروتينات على chemokine الإشارات.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Human serum AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Human T cell nucleofactor kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC antibody</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream&lt;sup&gt;x&lt;/sup&gt; Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling

خلايا تستجيب لchemokine التحفيز عن طريق فقدان شكلها جولة في عملية تسمى الاستقطاب، وعن طريق تغيير توطين التحت خلوية من العديد من البروتينات. وقد استخدمت تقنيات التصوير الكلاسيكية لدراسة هذه الظواهر. ومع ذلك، أنها تتطلب اكتساب اليدوي من العديد من الخلايا تليها تستغرق وقتا طويلا الكمي من التشكل وشارك في توطين تلطيخ عشرات الخلايا. هنا، يتم وصف طريقة سريعة وقوية لدراسة هذه الظواهر على عينات تتكون من عدة آلاف من الخلايا باستخدام التدفق الخلوي التصوير التكنولوجيا التي تجمع بين مزايا المجهر مع تلك من عداد الكريات. استخدام الخلايا الليمفاوية T حفز مع CCL19 وتلطيخ لجزيئات MHC من الدرجة الأولى والأكتين الخيطية، وتقدم استراتيجية النابضة لقياس في وقت واحد درجة التعديلات شكل ومدى التعاون توطين علامات التي تتأثر CCL19 الإشارات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الاستراتيجية النابضة سمحت لنا observه الفصل بين الأكتين الخيطية (في الجبهة) وفسفرته Ezrin-Radixin-Moesin (الفوسفات-ERM) البروتينات (في العمق) في خلايا T الاستقطاب بعد التحفيز CXCL12. وكانت هذه التقنية مفيدة لمراقبة تأثير حظر على الاستقطاب من عنصرين مختلفين أيضا: تثبيط الأكتين البلمرة التي كتبها مثبط الدوائية والتعبير عن المسوخ من Par6 / شاذة PKC يشير المسار. وهكذا، يظهر دليل على أن هذه التقنية مفيدة لتحليل كل التعديلات الشكلية وإعادة التوزيع البروتين.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling at JoVE.com

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

تحليل سريع وقوي من الخلوية والجزيئية الاستقطاب المستحث بواسطة Chemokine اشارة

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

8.0K Views.  Institut Cochin. Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Video: Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

التحقيق في الاستقطاب البلاعم عن طريق نخاع العظم الضامة المشتقة

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Bioengineering

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان البولي أجهزة ميكروفلويديك لخلية دراسات الهجرة تحت عمودي الكيميائية والتدرجات الأوكسجين

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

تحليل ثلاثي الابعاد للاستجابات متعددة الخلايا لتدرجات تشيمواتراكتانت

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Biology

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

قياس من الانجذاب الكيميائي الخلوي مع ECIS / سيارات الأجرة

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

تقييم هجرة الخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة فيفو السابقين

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

الوقت الفاصل تصوير الماوس ماكروفاج Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...