Name: a manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos
Uploaded: 2014-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال تمويل للمختبر أبحاث Wingert مما يلي: المعاهد الوطنية للصحة منح K01 DK083512، DP2 OD008470، وR01 DK100237. مسيرة الدايمات باسل أوكونور كاتب الباحث جائزة منحة # 5 FY12-75. بدء الأموال من جامعة نوتردام كلية العلوم وقسم العلوم البيولوجية؛ وهدية سخية للجامعة نوتردام من إليزابيث ومايكل غالاغر نيابة عن غالاغر الأسرة لتعزيز أبحاث الخلايا الجذعية. كان للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر بول كروجر T. الابن لتوفير التغذية المرتدة حاسم على المخطوطة. نشكر موظفي قسم العلوم البيولوجية على دعمهم، ومركز للبحوث اسماك الزرد في نوتردام لتفانيهم المتميز في رعاية ورفاهية لدينا مستعمرة الزرد. أخيرا، نشكر أعضاء من الباحثين و لدينامختبر الفصل على تعليقاتهم والمناقشات والأفكار حول هذا العمل.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تحديد العقاقير العلاجية فعالة لعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان هو نهاية اللعبة بالنسبة لكثير من الباحثين الطبية الحيوية. في حين أن تحديد وتوصيف وكلاء الدوائية المحتملة للتطبيقات السريرية له قيمة واضحة للرعاية الصحية، إلا انه لا يزال يشكل تحديا كبيرا. في نهاية المطاف، وتطوير العديد من المركبات العلاجية تأتي من معرفة كيفية أنواع معينة من الخلايا إما تتطور أو وظيفة. الزرد، دانيو rerio، هو مكتملة العظام المياه العذبة من عائلة شبوطيات التي أصبحت كائن النموذج السائد في البيولوجيا التطورية 1. الزرد وراثيا الفقاريات الانقياد التي هي سهلة للحفاظ على والتلاعب للدراسات العلمية 2،3. الجنين الزرد شفافة، المخصبة خارجيا، ويمكن أن تنتج من قبل مئات من زوج واحد التزاوج الكبار في أسبوع واحد فقط 2،3. وعلاوة على ذلك، حصة أجهزة الجسم الرئيسية الزرد وتمتلك د كبيرegree التشابه الجيني مع الثدييات، بما في ذلك البشر 4. لافت للنظر، و 70٪ من الجينات البشرية لها orthologue الزرد 4. ونتيجة لهذا التشابه، كانت الزرد نظام التجريبية ذات أهمية كبيرة لدراسة آليات تطوير الفقاريات وعلم وظائف الأعضاء، و قد استخدمت لتلخيص العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان 5-7. هذه الأسباب وغيرها، جعلت الزرد مرشحا مثاليا لمواصلة التحقيقات الوراثية ونتج عنه زيادة مطردة التقدير لفائدة الزرد في أبحاث الطب الحيوي 6،7. على مدى العقود القليلة الماضية، وقد وضعت وفرة من الأدوات الوراثية في الزرد. الجينوم الزرد غير قابلة للالطفرات وtransgenesis 3. حتى الآن، تم تنفيذ عدد كبير من الأمام وعكس الدراسات الجينية، مما يؤدي إلى توليد أكثر من 9،000 المسوخ 3. وعلاوة على ذلك، العديد من خطوط المعدلة وراثيا لها أن تكونخلق أون، والتي مكنت من وضع العلامات وعزل أنواع معينة من الخلايا 3. فقد كانت هناك جهود كبيرة الجارية لتركيز وتوزيع هذه الموارد للمجتمع البحوث، والتي يمكن الوصول إليها عن المختبرات بتكلفة منخفضة نوعا ما من خلال المركز الدولي للاسماك الزرد الموارد (ZIRC) 8. وعلاوة على ذلك، مستودع واسعة من المعلومات البيولوجية والأدوات الجزيئية، بدءا من أنماط التعبير الجيني لmorpholino متواليات والبروتوكولات، وقد تم شرحها بشكل تدريجي على شبكة المعلومات الزرد (ZFIN) 9-11. وقد بذلت هذه البنية التحتية البحثية الزرد ممكن من خلال دعم NIH كبير والدعوة لهذا النموذج الحيواني 8. استمر هذا المخبأ من المسوخ الزرد، خطوط المعدلة وراثيا، والمعلومات ذات الصلة لتكون ذات قيمة استثنائية للمجتمع الأبحاث البيولوجية ككل. ومع ذلك، في حين الزرد الآن نموذج كائن راسخة والبارز، فإنها لا تمثلrgely غير مستغل لدراسة البيولوجيا التطورية والأمراض من خلال استخدام شاشات الوراثية الكيميائية. علم الوراثة الكيميائية هي استخدام الجزيئات الصغيرة، مثل المخدرات أو غيرها من المركبات، أن تؤثر عملية بيولوجية ضمن نظام المعيشة 12. يمكن تطبيق علم الوراثة الكيميائية لفهم الآليات الجزيئية وظيفة الجين، مثل التعرف على العوامل التي الإنقاذ أو تفاقم خلل جيني معين 12. وعلاوة على ذلك، وعلم الوراثة الكيميائية تمثل سبيلا رئيسيا واحدا لإجراء البحوث متعدية 12. بينما كانت شاشات الوراثية التقليدية إلى الأمام في النماذج الحيوانية قوية جدا في ربط جينات معينة للأمراض، فهي تفتقر إلى البعد الزماني، مما يجعل من الصعب أو من المستحيل أحيانا لمراقبة الظواهر التي قد تنشأ بعد مرحلة التطور الجنيني المبكر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التكرار الجيني يجعل النتائج لوحظ من علم الوراثة إلى الأمام يصعب تفسيرها. بدلا من ذلك، وشاشات جينية الكيميائيةالسماح للسيطرة الزمنية الدقيقة وتوفير وقت واحد نقطة انطلاق قيمة لاكتشاف المخدرات 12،13. علم الوراثة الكيميائية يمكن أن يؤديها في استخدام أنظمة الأنابيب (مثل خطوط الخلايا والبروتينات) أو باستخدام نظام في الجسم الحي، مثل الحي كله. يمكن استخدام النظام في المختبر لعلم الوراثة الكيميائية يكون مفيدا لأنه أبسط من نظام الحي كله، وأسهل للعمل مع على نطاق واسع، أقل تكلفة، وأقل استهلاكا للوقت. ونتيجة لذلك، في المختبر أنظمة تسمح لكلا الإنتاجية العالية الفرز (HTS) وفحص عالية المحتوى (HCS). هناك عدد من المزايا لاستخدام نظام في المختبر التي يجب أخذها في الاعتبار عند الاقتراب الوراثة الكيميائية، ولكن أيضا قيود كبيرة. أحد أوجه القصور الرئيسية لاستخدام خط الخلية هو أن جزيئات صغيرة يمكن أن يكون فعال وغير سامة في خط خلية معينة، ولكن عندما تصبح سامة أدخلت في الحي كله. وبالتالي، فإن جوهرالقضية هي أن في المختبر أنظمة لا تعبر عن السياق العام للكائن الحي، وبالتالي ليست قادرة على تقليد بدقة ما يحدث في الحي كله دائما. في حين أن الاختبار المركب في الكائنات كلها يمكن الالتفاف على هذه القضايا، واستخدام الثدييات نماذج الحي كله يطرح عددا من القيود المادية والأخلاقية. على سبيل المثال، فحص المخدرات في الماوس وأعاقت وجستيا من الفضاء والنفقات اللازمة لاختبار حجم العينة المناسب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من الصعب الأسئلة التنموية للدراسة، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن تطور الثدييات في الرحم. أخيرا، في حين أن إجراء البحوث الطبية الحيوية له قيمة اجتماعية كبيرة، ومع ذلك هناك احتياجات كبيرة لحماية الرفق بالحيوان عن طريق الحد من دراسات مكثفة وتخفيف الألم والمعاناة من الحيوانات المستخدمة في الأبحاث. الزرد توفر بديلا صالحا للعمل مع الفقاريات العليا مثل الثدييات، وعلاوة على ذلك، العديد من المواضيع يمكن دراستها باستخدام علم الوراثة الكيميائية فيالمراحل الجنينية واليرقات عند معالجة العصبية غائب أو المنطوق عند مستوى منخفض 12،13. حتى الآن، تم إجراء عدد لا يحصى من شاشات الوراثية الكيميائية باستخدام الأجنة الزرد على وجه الخصوص، وتسليم المجمع يمكن تحقيق ذلك عن طريق غمر الأجنة في وسائل الإعلام التي تحتوي على المخدرات من اهتمام 12-15. وعلاوة على ذلك، كانت هناك العديد من التطورات العلمية والتكنولوجية لجعل شاشات الوراثية الكيميائية ممكن ويمكن التحكم 16-20. وكان بيترسون وزملاؤه أول من استخدم الزرد في شاشة الوراثية الكيميائية في عام 2000، وفيما بعد في عام 2004 حددت مجمع أن قمعت طفرة تضيق الأبهر في الزرد 21،22. ومنذ ذلك الحين نفذت شاشات الكيميائية لدراسة عدة أنسجة نامية (مثل القلب والدم والأوعية) 23-25، الوظائف الفسيولوجية (على سبيل المثال، أساس العصبية للسلوك) 26، 27،28 تجديد الكبار، وامراض<html> النماذج الإلكترونية (مثل ضمور العضلات والسرطان) 29،30. من بين هذه الشاشات الكيميائية الزرد، اتخذت اكتشاف البروستاجلاندين التي تنظم الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى التجارب السريرية على البشر، مما يدل على القدرة على الانتقال من &quot;دبابات إلى السرير&quot; 23،31-33 (NIH، Trials.gov السريرية، NCT00890500. NCT01627314). وفي الآونة الأخيرة، ظهرت علاجات واعدة المرشح لأجهزة معقدة مثل الكلى وعلاجها علم الأمراض الخلوي الذي في مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD) 34 و قصور كلوي حاد 27،35، على الرغم من أن هذه لديها حتى الآن للانتقال إلى التجارب السريرية. تظهر هذه الشاشات الوراثية الكيميائية على نطاق واسع فائدة اختبار المركبات الصغيرة في الزرد النامية والقدرة على تطبيق علم الوراثة الكيميائية لاستجواب وظيفة الأنسجة الكبار. وعلاوة على ذلك، هناك قائمة متزايدة من مجموعات الأدوية المتاحة تجاريا التي تكون متاحة للدراسات الأكاديمية 19. ove_content &quot;&gt; وفي السنوات القليلة الماضية، كانت هناك تطورات بارزة في مجال تكنولوجيا الفحص الجيني الكيميائية، بما في ذلك استخدام النظم الآلية الروبوتات الاستغناء عن المخدرات والتعامل معها، جنبا إلى جنب مع أنظمة التصوير الآلي 36-38. هذه النظم تسمح بإمكانية اختبار عدة آلاف من المركبات على حد سواء لتحقيق HTS وHCS 36-38. وللأسف، فإن التعهد شاشات الوراثية الكيميائية مع هذه المؤسسات الروبوتية مبتكرة تتطلب عادة موارد كبيرة. هذه الأنواع من الموارد تشكل عائقا كبيرا للعديد من المؤسسات التي تفتقر إلى رؤوس الأموال للحصول على وتشغيل وصيانة هذه الأجهزة. ورغم تأسيس البنية التحتية للمعالجة الآلية للمكتبات الكيميائية، بما في ذلك نقل الأجنة إلى المحتشدة لوحات، لا تزال باهظة بالنسبة لكثير من المختبرات والتصوير الآلي وتحليل التكاليف عموما أكثر يمكن الوصول إليها 12. تمكن الآلي فحص الصورة الكمي من الفلورسنت إعادة المعدلة وراثياالحمالين ويسهل تحليل المظهري محدد 12،15. على الرغم من أن النظم الآلية تمثل التقدم التكنولوجي مفيدة، أسئلة كثيرة يمكن معالجتها من خلال شاشات اليدوي أكثر تركيزا، مثل الاستعلام من عدة آلاف من المركبات النشطة بيولوجيا في العملية التنموية مع كامل جبل الموقع التهجين (WISH) قراءات في 39. وعلاوة على ذلك، في حين أن عددا متزايدا من مختبرات والتذرع شاشات الكيميائية الزرد للتحقيق في مسألة بحثية، وعدد قليل التشبع (إن وجدت) وصلت الجهود والعديد من المواضيع حتى الآن لم يتم اختراقها باستخدام علم الوراثة الكيميائية. يمكن تنفيذها باستخدام شاشات الكيميائية الزرد مستعمرة صغيرة تتألف من عدد قليل فقط من النوع البري أو الدبابات المعدلة وراثيا. لذا، ينبغي أن يكون هذا الشكل من الاستجواب الجيني يمكن بلوغه من قبل معظم المجموعات البحثية الزرد المهتمة في توسيع / ​​تنويع في هذه الساحة. المكتبات الكيميائية متفاوتة الحجم يمكن شراؤها من الموزع التجاري و / أو عمودlaborators. لهذه الأسباب، يمكن أن الوراثة الكيميائية يكون مجديا اقتصاديا حتى في المناخات القاسية التمويل. ومع ذلك، هناك عقبات في بداية شاشة الوراثة الكيميائية، مثل كيفية تخطيط الجوانب اللوجستية للشاشة: على سبيل المثال، فإن عدد الموظفين اللازمين لشاشة ناجحة، وتخصيص وقت مخصص والتفكيك معا بروتوكول المادي لعينات العملية يدويا هذا العدد من بضع مئات إلى عدة آلاف. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول الإنتاجية العالية اليدوي لأداء الوراثة الكيميائية في الجنين الزرد مع WISH بمثابة قراءة المغادرة. يتضمن هذا الأسلوب العلاج من تعاطي المخدرات من الأجنة الزرد، تليها الكشف riboprobe النصوص مرنا. باستخدام هذا البروتوكول، فريق صغير أو حتى فرد واحد يمكن فحص وتحليل معقول مكتبة الكيميائية متواضعة حوالي 600 مركبات في غضون 9 أسابيع.

<table><tbody><tr><td>0.1 - 10 &amp;#956;l natural pipet tips</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>1x E3</td><td></td><td></td><td>Generate using 50x E3 and DI water.</td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>Generate 0.1% Tween-20 in 1x PBS.</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>12-well staining dish</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3226</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1x PBS</td><td></td><td></td><td>Generate 4% PFA (w/v) in 1x PBS - boil then freeze and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>48 well plate</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7548</td><td></td></tr><tr><td>50x E3</td><td></td><td></td><td>Generate 16.5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 16.5 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 250 mM NaCl, and 8.5 mM KCl in DI water.</td></tr><tr><td>96 deep well plate</td><td>VWR</td><td>100-11-940</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate sealing mat</td><td>VWR</td><td>10011-946</td><td></td></tr><tr><td>anti-digoxigenin antibody</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>BCIP stock</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>Generate 50 mg/ml using 100% DMF - freeze then store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>block solution</td><td></td><td></td><td>Generate 50 ml using 10 ml BSA (10%), 5 ml FCS, and 35 ml MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 &amp;deg;C.)</td></tr><tr><td>BSA (bovine serum albumin) stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00448</td><td>Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 &amp;deg;C. (Keep unused BSA flakes at 4 &amp;deg;C.)</td></tr><tr><td>DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>Consult the manufacturer procedure.</td></tr><tr><td>DMF (dimethylformaldehyde)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00450</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>embryo incubation dish</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S 20-300 &amp;#956;l</td><td>Eppendorf</td><td>22492284</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Generate 50 ml of 70% EtOH with molecular grade H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and 100% EtOH then store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>FCS (fetal calf serum) stock</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>filter sterilization unit</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>0.45 &amp;#956;m CA / 1 L volume</td></tr><tr><td>fine forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td></td></tr><tr><td>flat-bottom microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>glass basin 90 x 50</td><td>Kimax Kimble</td><td>23000</td><td></td></tr><tr><td>glass pipette</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>glass vial</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>glycogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml yeast torula RNA, and 50 &amp;#956;l/&amp;#956;l heparin</td></tr><tr><td>INT stock</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>Generate 55 mg/ml using 70% DMF and 30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O - freeze then store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 ml of 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Then fill with deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 2 L and autoclave.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>Generate 0.1% Tween-20 in MAB</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>mesh tea strainer</td><td>English Tea Store</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>molecular grade distilled water</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>multi 8-channel pipette 0.5 - 10 &amp;#956;l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.019</td><td></td></tr><tr><td>multi 8-channel pipette 30 - 300 &amp;#956;l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.051</td><td></td></tr><tr><td>nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>NBT stock</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>Generate 50 mg/ml using 70% DMF and 20% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O - freeze then store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Film adhesive</td><td>Eppendorf</td><td>30127.48</td><td></td></tr><tr><td>plate container (Pencil Box)</td><td>Sterilite</td><td>1722</td><td></td></tr><tr><td>pre-staining buffer</td><td></td><td></td><td>Generate 0.1% Tween-20, 50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.)</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>Generate 50 mg/ml using E3, freeze then store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>Generate 10 mg/ml in DI water then freeze and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>RNase 1 inhibitor</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>rubber bulb</td><td>Fisherbrand Fisher Scientific</td><td>03-448-22</td><td></td></tr><tr><td>staining solution-purple</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Generate using 45 &amp;#956;l of NBT and 35 &amp;#956;l of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer.</td></tr><tr><td>staining solution-red</td><td></td><td></td><td>Generate using 31.5 &amp;#956;l of INT and 35 &amp;#956;l of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer.</td></tr><tr><td>stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>transfer pipet</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>waterbath</td><td>Thermo</td><td>51221073</td><td>(Model # 2831)</td></tr></tbody></table>

a manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos

أصبحت الزرد نموذج كائن يستخدم على نطاق واسع للتحقيق في الآليات التي تقوم عليها البيولوجيا التطورية ودراسة علم الأمراض الأمراض التي تصيب البشر بسبب درجة كبيرة من المحافظة الجيني مع البشر. علم الوراثة الكيميائية يتطلب اجراء اختبارات مفادها أن الجزيئات الصغيرة لديها على عملية بيولوجية، وأصبحت وسيلة شعبية الأبحاث المترجمة للتعرف على المركبات العلاجية. الزرد جذابة خصيصا لاستخدامها في علم الوراثة الكيميائية بسبب قدرتها على إنتاج براثن كبيرة من أجنة شفافة، والتي يتم إخصابها خارجيا. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون بسهولة الأجنة الزرد المخدرات يعامل بإضافة بسيطة من مركب إلى وسائل الإعلام الجنين. باستخدام كله يشن الموقع التهجين (WISH) في، التعبير مرنا يمكن تصور واضح داخل الأجنة الزرد. معا، وذلك باستخدام علم الوراثة الكيميائية وWISH، يصبح الزرد سياق الحي كله قوي فيها لتحديد الخلوية والفسيولوجيةآثار جزيئات صغيرة. وقد تم إحراز تقدم في التقنيات المبتكرة التي تستخدم إجراءات الفرز القائم على الجهاز، ولكن للعديد من المختبرات مثل هذه الخيارات لا يمكن الوصول إليها أو لا تزال باهظة التكاليف. بروتوكول الموصوفة هنا يوضح كيفية تنفيذ شاشة عالية الإنتاجية اليدوية الكيميائية الوراثية التي تتطلب موارد الأساسية، ويمكن تحقيق ذلك عن طريق فريق فردي أو صغير واحد في فترة زمنية فعالة. وبالتالي، يوفر هذا البروتوكول استراتيجية مجدية والتي يمكن تنفيذها من قبل مجموعات بحثية لأداء الوراثة الكيميائية في الزرد، والتي يمكن أن تكون مفيدة لاكتساب الأفكار الأساسية في العمليات التنموية، وآليات المرض، والتعرف على مركبات جديدة ومسارات الإشارات التي لها تطبيقات ذات الصلة طبيا .

النهج اليدوي الموصوفة هنا يسمح للباحث واحد بكفاءة وبنجاح إجراء إنتاجية عالية شاشة الوراثة الكيميائية جزيء صغير باستخدام نموذج الجنين الزرد (الشكل 1). باستخدام هذه الطريقة، فمن العملي لشخص واحد لأداء شاشة الوراثة الكيميائية، بحيث على مدار 9 أسابيع شخص واحد (ملتزمة أسبوع العمل 40 ساعة) يمكن إجراء مسح لل~ 600 مركبات (الشكل 1) . وبالتالي، لا يمكن للوقت مقاعد البدلاء لشخص واحد تجاوز الحاجة إلى معدات مطالبين ذات الموارد المرتفعة، مثل النظم الآلية. المفاضلة هي أن الشاشة يدوية تتطلب عدة أسابيع من الجهد المتفاني. في المقابل، يمكن استخدام النظم الآلية ضغط الوقت تشارك في 1-2 أسابيع من الوقت الروبوتية، ويمكن أن يترتب على الحد الأدنى نسبيا جهد الباحث عموما. طريقة واحدة لزيادة كفاءة و / أو نطاق الشاشة الدليل هو حشد 2-3 الباحثين في المجموع، والتي من شأنها أن تمكن من فحص ممركبات خام، متفاوتة تركيز مركب، و / أو غربلة على مدى فترة زمنية أقصر. ويوضح الخطوات الأولية المشاركة في بروتوكول لإكمال الشاشة الوراثة الكيميائية في الأجنة الزرد مع قراءات WISH بمثابة مخطط (الشكل 2). ويمكن تقسيم المهام التجريبية إلى نوعين من أسابيع العمل: (1) التعرض للمواد الكيميائية ووضع البطاقات التعريفية الجنين، و (2) تحليل والتصوير. في أسبوع العمل التعرض للمواد الكيميائية، وهذه الخطوات تشمل اقامة البالغين الزرد (يوم 1)، وجمع الجنين والأجنة arraying والعلاج من تعاطي المخدرات (يوم 2)، وإعداد الأجنة لفي الموقع التهجين (يوم 3)، والتهجين في الموقع (اليوم 4 -6). في الأسبوع التحليل / التصوير، والباحث يحلل التعبير مرنا ليسجل الأجنة ويضرب صورة (يوم 11/07). جزء هام من أداء الشاشة الوراثة الكيميائية هو تسمية باستمرار وبدقة جيدا المواقع. كما الشاشة الوراثة الكيميائية صrocess مفصلة هنا ينطوي على نقل مجموعات من الأجنة من بئر في لوحة واحدة لبئر في لوحة مختلفة عدة مرات، والحاجة لوصفها دقيقا وواضحا أمر بالغ الأهمية، حتى أنه عندما سجل ضربة كيماوية يمكن أن يكون خطيا وسهولة ارجاعه لهويتها داخل المكتبة الكيميائية (الشكل 3). طريقة سهلة لضمان ذلك هي تسمية لوحات في مثل هذه الطريقة أنه في أي وقت ومكان جيد لمجموعة من الأجنة تعامل من قبل مجمع مباريات مباشرة المكتبة وحة المخدرات المكان جيدا الكيميائي للمركب يستخدم لعلاج هذه الأجنة (الشكل 3). هنا، يستخدم نظام مزدوج من الألوان الترميز والعلامات العددية لتنظيم العينات التي تمت إضافتها إلى لوحات الشاشة باستخدام علامات دائمة (الشكل 3). في حين أن تحليل نتائج شاشة عالية الإنتاجية، وهناك حاجة ماسة لتطوير طريقة لتنظيم بشكل صحيح، تعليم، وتحليل جزيء صغير محتملالزيارات. لذا، يجب أن يكون شاشة الوراثة الكيميائية نظام الدرجات دقيق وواضح التي تم تصميمها بعناية والتقيد التام بها. وينبغي لهذا النظام بسهولة وبشكل كامل تنقل ديناميكية هامة للمجمع وتوفر وسيلة مختصرة لعرض نتائج الشاشة النهائية. طريقة واحدة لبناء مثل هذا النظام هو أن الأجنة درجة الاستفادة من النظام الطبقي، وهذا ما يفسر شدة المورفولوجية العامة وثقة ضرب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يقترن فئات الطبقة مع (+) أو (-) لوصف أي تأثير توسعية أو التخفيض على المنطقة (ق) من الفائدة. هنا، تعرض الأجنة الزرد إلى مركبات فردية من مكتبة النشطة بيولوجيا (انزو الكيماويات) من 50٪ إلى 24 اكتفار HPF، ثم يعاير من قبل WISH باستخدام مزيج من ثلاثة riboprobes للكشف عن قطاعات كليون (الشكل 4A). باعتبارها نظام الدرجات سبيل المثال، بئر يحتوي على مجموعة من الأجنة التي لديها convolu القريبة الموسع بشكل كبيرتيد أنبوب صغير (PCT) من سليفة الكلوة، الكلى الجنينية الزرد، من شأنه أن يتسبب في مركب يستخدم لعلاج بشكل جيد يتم تصنيفها على أنها (الدرجة الأولى)، وهو في هذه الحالة من شأنه أن يمثل الطبقة المرتبطة عيب أشد وأعلى مستوى الثقة في النمط الظاهري لاحظ الشكل (4B). عندئذ المشروح المجمع مع (PCT) و (+)، ويجري تدوين كامل (الدرجة الأولى - PCT +) (الشكل 4B). هذا مفهوم التصنيف يوفر وسيلة بسيطة وسريعة لوصف مجموعة نفيسة من المعلومات المتعلقة جزيء صغير من اهتمام، بما في ذلك من شدة تأثير المركبات على الكائن الحي، المنطقة التي يتأثر المخدرات والطريقة التي كانت المنطقة تتأثر (الشكل 4B). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. &amp; #160؛ دليل الزرد استراتيجية شاشة الجنين الكيميائية ويمكن للباحث يختبر عمليا في 96 لوحة جيدا للمواد الكيميائية على الأجنة الزرد وتنفيذ معالجة WISH لاحق خلال أسبوع واحد. أداء أسبوعين من الاختبارات الكيميائية (1 أسبوع (يوم 06/01) و2 أسبوع (يوم 12/7)) يمكن إرفاقها مع الأسبوع الثالث مخصص لأخذ عينات التحليل. ما يقرب من 96 لوحات تستحق عينات من الشاشة ويمكن تصويرها وسجل 3 أسبوع (يوم 13-17). هذا السيناريو يصل إلى ما يقرب من 200 فحص المركبات في فترة زمنية 3 أسابيع، ما يعادل مكتبة صغيرة من حوالي 600 فحص المركبات بشكل كامل من قبل 9 أسابيع. يمكن تعديل هذه الاستراتيجية اليدوية اعتمادا على الموارد المتاحة. على سبيل المثال، يمكن أن تقلل من ثلاثة باحثين من الوقت لاستكمال شاشة حوالي 600 مركبات إلى 3 أسابيع مقارنة مع 9 أسابيع سيستغرق مع أحد الباحثين. استراتيجيات الفحص يمكن تكييفها عن طريق تعيين الباحثين لجوانب محددة من الشاشة، مثل علاج المخدراتمنة والموقع التهجين أو توجيه الباحثين في إجراء عملية الفرز بشكل مستقل بالكامل على أجزاء منفصلة من مكتبة الكيميائية. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. مخطط انسيابي: انهيار سير العمل الشاشة 6 أيام ويمكن تقسيم عملية الفرز الكيميائية بتحفظ وصولا إلى 6 أيام. يوم 1 ويتكون من إنشاء أزواج التزاوج الزرد (= /&gt; 25) لتزويد أجنة لكل 96 لوحة جيدا ليتم عرضه. يوم 2 يشمل جمع الأجنة من غرف التزاوج وarraying لهم في عمق 96 لوحة جيدا، تليها العلاج من تعاطي المخدرات. في يوم 3 أجنة مستعدة لWISH، بما في ذلك dechorionation، تثبيت الأنسجة والأجنة الجفاف. أخيرا، يتم تنفيذ WISH على الأجنة خلال 4-6 يوم. يرجى ملاحظة أن إجراءات بديلة تلطيخ على عينات ثابتة يمكن أن يكون بسهولة Substituted لWISH. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. لوحة توسيم نقل التخطيطي. والمحتشدة الأجنة الزرد والمخدرات يعامل في 96 لوحة جيدا ثم انتقلت إلى 24 لوحة جيدا لإزالة الأنقاض والتعرض pronase. ثم يتم نقل الأجنة إلى 48 لوحات جيدة لإعداد الجنين، WISH، وتثبيت الأنسجة. بعد ذلك، يتم نقل الأجنة إلى 12 لوحات جيدة للتسجيل والتصوير، والتخزين. ويتم إنجاز arraying الدقيق للأجنة من خلال استخدام نظام الترميز اللوني الذي يمكن للباحث لتتبع المواد الكيميائية المنشأ لكل عينة اختبار. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content العرض = &quot;5in&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 52063 / 52063fig4highres.jpg&quot; العرض = &quot;500&quot; /&gt; الرقم 4. مثال نظام الدرجات: تجزئة فحص الكلى تمكن تجربة WISH الباحث إلى وصمة عار أنواع معينة من الخلايا استنادا إلى هوية تحقيقات التي تم تحديدها، والسماح للتقييم التغيرات في الظواهر الجنين وفقا للتغيرات في موقع مرنا النسخ و/ أو المستويات. على سبيل المثال، ثلاثة قطاعات من الكلى الجنينية الزرد، وسليفة الكلوة، وقد وصفت باستخدام شاشة ميكس 1. شاشة ميكس 1 هو مزيج من تحقيقات تتكون من wt1b، الذي يموضع تحديدا في podocytes (P)، slc20a1a الذي يصادف القريبة الملتوية نبيب (PCT)، وslc12a1 التي تصف البعيدة في وقت مبكر (DE) شريحة 47. و(+) بجانب رمز تسمية المنطقة يستخدم لتعليم التوسع أو التحول الإيجابي في تلك المنطقة، في حين أن - يستخدم رمزا لإملاء التقليل من منطقة (). هنا، طب الطوارئbryos المخدرات تعامل مع رابطة الدول المستقلة 13-RA لها الداني الملتوية أنبوب صغير الموسع وخسارة كاملة من الجزء القاصي المبكر مع أي تأثير واضح على podocytes. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52063/52063fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

الزرد هو كائن حي تجريبي ممتاز لدراسة العمليات التنموية الفقاريات والأمراض التي تصيب البشر النموذج. هنا، نحن تصف بروتوكول بشأن كيفية تنفيذ اليدوية شاشة الكيميائية عالية الإنتاجية في الأجنة الزرد مع ككل جبل التهجين الموضعي (WISH) في القراءة خارج.

دليل جزيء صغير شاشة تقترب عالية الإنتاجية عن طريق الزرد الأجنة

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

a-manual-small-molecule-screen-approaching-high-throughput-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

17.5K Views.  University of Notre Dame.  الزرد هو كائن حي تجريبي ممتاز لدراسة العمليات التنموية الفقاريات والأمراض التي تصيب البشر النموذج. هنا، نحن تصف بروتوكول بشأن كيفية تنفيذ اليدوية شاشة الكيميائية عالية الإنتاجية في الأجنة الزرد مع ككل جبل التهجين الموضعي (WISH) في...

Video: A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Developmental Biology

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

3-الأبعاد (3D)--طباعة قالب للجنين الزرد الإنتاجية العالية أرايينج

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Environment

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em&gt; المكورات العنقودية البشروية</em&gt; و<em&gt; المتفطرة البحرية</em&gt; عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Immunology and Infection

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

الآلي التحليلات السلوكية عالية الإنتاجية في يرقات اسماك الزرد

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Neuroscience

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

تطوير التصوير والتحليل الآلي للشاشات الكيميائية الزرد.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

التقييم السريع لسمية المركبات الكيميائية باستخدام أجنة سمك الحمار الوحشي

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Medicine

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

مقايسة مفاجئة لتقييم السمية في جنين الزرد

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

تسليط الضوء على المؤلف: فحص السمية عالية الإنتاجية باستخدام مقايسة الاستجابة المفاجئة لجنين الزرد

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.

تقييم سمية المواد الكيميائية باستخدام نظام فحص الاستجابة المفاجئة لاهتزاز الزرد

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...

دليل جزيء صغير شاشة تقترب عالية الإنتاجية عن طريق الزرد الأجنة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Microbead زرع الأجنة الزرد

3-الأبعاد (3D)--طباعة قالب للجنين الزرد الإنتاجية العالية أرايينج

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة

الآلي التحليلات السلوكية عالية الإنتاجية في يرقات اسماك الزرد

تطوير التصوير والتحليل الآلي للشاشات الكيميائية الزرد.

اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

التقييم السريع لسمية المركبات الكيميائية باستخدام أجنة سمك الحمار الوحشي

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

تقييم سمية المواد الكيميائية باستخدام نظام فحص الاستجابة المفاجئة لاهتزاز الزرد

تقييم سمية المواد الكيميائية باستخدام نظام فحص الاستجابة المفاجئة لاهتزاز الزرد