Name: preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient
Uploaded: 2014-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient at JoVE.com

The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).

بروتوكول التالية يتوافق مع المبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان وتمت الموافقة من قبل كلية الطب والصيدلة جنة رعاية الحيوان في جامعة تورونتو. 1. إعداد الكواشف المطلوبة كما هو موضح في الجدول 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة البروتيني والفوسفاتيز (إذا لزم الأمر) مثبطات لجميع الحلول السكروز، ومخازن وDDH 2 O بتركيزات المبينة في الجدول 1. هام: إجراء كافة الخطوات في 4 درجات مئوية وباردة قبل كل من الكواشف والمعدات قبل بدء التجربة. تسمية جميع الأنابيب، بما في ذلك أنابيب نابذة فائقة السرعة، مع علامة دائمة. </li></ol> 2. تشريح منطقة الدماغ المناسبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الحيوانية خلع عنق الرحم أو قطع الرأس. المنزل والموت ببطء الحيوانات وفقا للسياسات المؤسسية والحكومية في رعاية الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة إزالة عشرالبريد الدماغ من الجمجمة ومكان على كتلة تشريح المبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الدماغ المنطقة المناسبة من الأنسجة الطازجة والمضي قدما إلى الخطوة 3. </li></ol> 3. الأنسجة التجانس مع بالمواتير الزجاج تفلون الخالط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 50-100 ملغ (للSPM)، أو 100-200 ملغ (للPSD) من الأنسجة تشريح في صفت 13 مل أنبوب البولي بروبلين التي تحتوي على 4 مل من محلول السكروز 0.32 M HEPES مخزنة. نقل العينة إلى 15 مل مدبب الأنسجة الزجاجية تفلون طاحونة / الخالط، تعيين محرك السيارات إلى 900 دورة في الدقيقة (وضع 7) والتجانس العينة مع 12 السكتات الدماغية على مدى فترة 30 ثانية. استخدام مختلف الخالط الزجاج تفلون بين العينات، أو شطف الخالط بالماء البارد المقطر بين العينات ويمسح الجافة مع Kimwipe. ملاحظة: ما يصل إلى 4 غرام من الأنسجة يمكن المتجانس في 4 مل من محلول السكروز 0.32 M HEPES مخزنة، ومع ذلك فإنه من المستحسن استخدام الأنسجة أقل لضمان تجزئة المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينة المتجانس الظهر ريا نفس 13 مل أنبوب البولي بروبلين. الاحتياطي 100 ميكرولتر من جناسة وتخزينها في -80 درجة مئوية لاحق الكمي البروتين وتحليل لطخة الغربي من إجمالي نسبة البروتين. </li></ol> 4. انخفاض سرعة الطرد المركزي لإزالة جزء النووي (العائد طاف S1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي جناسة في الدوار زاوية ثابتة عند 900 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل طاف (S1) الى مستوى جديد، وصفت أنبوب 13 مل و resuspend بيليه جزء النووي (P1) في 500 ميكرولتر من السكروز 0.32 M HEPES مخزنة. ملاحظة: يمكن تخزين (P1) جزء في -80 درجة مئوية وتستخدم في تحليل لطخة الغربي من جزء النووي. </li></ol> 5. تخصيب جزء من الخام Synaptosomal (العائد بيليه P2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لطاف (S1) في 10،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف (S2) واحتياطي 500 ميكرولتر في أنبوب microcentrifuge لتخزين في -80 درجة مئوية لاحقة البروتين ضليع في الرياضياتification وتحليل لطخة الغربي من عصاري خلوي / ضوء جزء الغشاء. Resuspend والمتبقية synaptosomal الخام جزء بيليه (P2) في 1 مل من محلول السكروز 0.32 M HEPES مخزنة ثم قم بإضافة حل آخر 3 مل من السكروز 0.32 M HEPES مخزنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 10،000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف (S2 &quot;) واحتياطي 500 ميكرولتر في أنبوب microcentrifuge لتخزين في -80 درجة مئوية لاحق الكمي البروتين وتحليل لطخة الغربي من عصاري خلوي / ضوء جزء الغشاء. حفظ غسلها synaptosomal الخام بيليه (P2 &#39;) في أنبوب البولي بروبلين. </li></ol> 6. Lysing (Hypoosmotic صدمة) من الكسر الخام Synaptosomal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز بيليه synaptosomal الخام (P2 &#39;) في أنبوب البولي بروبلين عن طريق إعادة التعليق في 1 مل من DDH 2 O. إضافة 3 مل أخرى من DDH 2 O، ونقل إلى الأنسجة الخالط الزجاج تفلون، والتجانس باليد مع 3 السكتات الدماغية. ملاحظة: من المهملتنفيذ هذه الخطوة بأسرع وقت ممكن وبسرعة انتقل إلى الخطوة 6.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينات من الخالط مرة أخرى في نفس 13 مل أنبوب البولي بروبلين وبسرعة ضبط العينة إلى 4 ملي HEPES مع 16 ميكرولتر من 1 M HEPES الحل، عكس إلى المزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لضمان lysing كاملة. </li></ol> 7. تخصيب جزء من غشاء Synaptosomal (P3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 25،000 ز س لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة وطاف جزء الحويصلي الخام (S3) نحتفظ في أنبوب 5 مل لتخزين في -80 درجة مئوية لاحق الكمي البروتين وتحليل لطخة الغربي. Resuspend وجزء الغشاء synaptosomal (P3) في 1 مل من محلول السكروز 0.32 M HEPES مخزنة. </li></ol> 8. إعداد متقطع التدرج السكروز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة بالضبط 3.5 مل من محلول السكروز 1.2 M HEPES مخزنة وبالضبط 3.0 مل كل من 1.0 و 0.8 M M HEPEمخزنة S حل السكروز منفصلة في 6 مل المفاجئة أنابيب الغطاء. ملاحظة: يتم ذلك إلى ما قبل قياس حجم المخازن المؤقتة التي تستخدم لجعل التدرج السكروز. القياس الدقيق لحجم مهم لضمان التدرجات الناتجة سوف تكون متوازنة لتنبيذ فائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الزجاج باستور الماصة ومصباح، ونقل 1.2 M-مخزنة HEPES حل السكروز إلى 12 مل أنبوب polyallomer نابذة فائقة السرعة. طبقة بعناية الحل السكروز 1.0 M HEPES مخزنة على رأس من الحل السكروز 1.2 M HEPES مخزنة. أخيرا، طبقة الحل السكروز 0.8 M HEPES مخزنة على رأس من الحل السكروز 1.0 M HEPES مخزنة. استخدام الماصة باستور جديدة لكل حل السكروز والحرص على عدم تعكير صفو التدرج السكروز. سوف الاهتزازات من دوامة مقاعد البدلاء أو ميكروسنتريفوج تخل سلامة التدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الماصة باستور، طبقة كسر الغشاء synaptosomal معلق (P3) على رأس التدرج السكروز متقطع استعداد.تأكد من أن التدرجات ومتوازنة من وزنها لهم داخل دلو من الدوار الدلو المتأرجح. إذا الدلاء ليست متوازنة، واستخدام الماصة P200 لإضافة بعناية السكروز 0.32 M HEPES مخزنة إلى الجزء العلوي من التدرج وتحقيق التوازن بين الدلاء الدوار. </li></ol> 9. تجزئة من غشاء البلازما متشابك (SPM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نابذة فائقة السرعة في دلو الدوار يتأرجح في 150،000 x ج لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية. إزالة بعناية التدرجات السكروز من الدلاء نابذة فائقة السرعة. باستخدام إبرة 18 G وحقنة 1 مل، ثقب أنبوب في الجزء السفلي من 1.0 م / 1.2 M HEPES مخزنة محلول السكروز البيني وسحب طبقة غشاء البلازما متشابك (SPM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل علما وحدة التخزين التي تحتل كل عينة SPM في حقنة 1 مل. وضع طبقة SPM جمعها في 3.5 مل سميكة الجدران أنابيب نابذة فائقة السرعة، إضافة بالضبط حجم 2.5 من 4 ملي HEPES لضبط تركيز السكروز من 1.2 متر إلى 0.32 م مرة واحدة وقد تم ضبط كل عينةإد إلى 0.32 M السكروز، وتوازن الأنابيب مع حل السكروز 0.32 M HEPES مخزنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نابذة فائقة السرعة في الدوار زاوية ثابتة في 200،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه متشابك غشاء البلازما (SPM) في 300 ميكرولتر من 50 ملي HEPES / 2 ملي EDTA الحل. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى استخدامها لالنشاف الغربي. </li></ol> 10. إعداد جزء الكثافة بعد المشبكي (PSD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد عينات SPM على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل محلول 0.54٪ تريتون X-100 في 50 ملي HEPES / 2 ملي EDTA الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 5 مل البوليسترين، والجمع بين 2.7 مل من تريتون X-100 / HEPES / حل EDTA و 300 ميكرولتر SPM جزء وتدوير العينة لمدة 15 دقيقة على 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات إلى 3.5 مل أنابيب نابذة فائقة السرعة سميكة الجدار وعينات الطرد المركزي في 32،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حجز طاف (تريتون X-100 للذوبان جزء [TS]) وتخزينها في -80، ° C. ملاحظة: في هذه المرحلة، يمثل بيليه في &quot;PSD-1T&quot; الكسر. وهناك العلاج الثانية مع المنظفات إنتاج &quot;PSD-2T&quot; الكسر. إذا كان المطلوب جزء PSD-1T، انتقل إلى الخطوة 10.6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنتاج جزء PSD-2T، resuspend الكرية في 3 مل من 0.5٪ تريتون X-100 في 50 ملي HEPES / 2 الحل ملي EDTA. تدوير عينات لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 32،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية، وانتقل إلى الخطوة 10.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend بعد المشبكي (PSD) بيليه في 50 ملي HEPES / 2 ملي EDTA الحل. ملاحظة: قد يتوقف حجم إعادة تعليق على حجم الكرية. ويوصى حجم 50-75 ميكرولتر. لأن جزء مديرية الأمن العام هو جزء المنظفات غير قابلة للذوبان، فمن الضروري في كثير من الأحيان لإضافة 1-2 ميكرولتر من 0.5٪ SDS لتمكين إعادة تعليق كامل للبروتين. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى استخدامها لالنشاف الغربي. </li></ol>

<ol>
	<li>Delint-Ramirez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+composition+of+NMDA+receptor+signaling+complexes+differs+between+membrane+subdomains+and+is+modulated+by+PSD-95+and+PSD-93.">In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+psychiatric+disease+risk+factors+DISC1+and+TNIK+interact+to+regulate+synapse+composition+and+function.">The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function.</a> Mol Psychiatry. 16, (2010).</li><li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinsertion+or+degradation+of+AMPA+receptors+determined+by+activity-dependent+endocytic+sorting.">Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting.</a> Neuron. 28, 511-525 (2000).</li><li>Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+interaction+of+stargazin-like+TARPs+with+cycling+AMPA+receptors+at+synapses.">Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses.</a> Science. 303, 1508-1511 (2004).</li><li>Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusional+trapping+of+GluR1+AMPA+receptors+by+input-specific+synaptic+activity.">Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity.</a> Neuron. 54, 447-460 (2007).</li><li>Bats, C., Groc, L., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Stargazin+and+PSD-95+regulates+AMPA+receptor+surface+trafficking.">The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking.</a> Neuron. 53, 719-734 (2007).</li><li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+level+controls+postsynaptic+composition+and+signaling+via+the+ubiquitin-proteasome+system.">Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system.</a> Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).</li><li>Cartier, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+and+functional+protein+complex+involving+dopamine+synthesis+and+transport+into+synaptic+vesicles.">A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles.</a> J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).</li><li>Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+enzymic+studies+of+cholinergic+and+non-cholinergic+synaptic+membranes+isolated+from+brain+cortex.">Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex.</a> Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).</li><li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+nerve+endings+from+brain:+an+electron-microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation.">The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J Anat. 96, 79-88 (1962).</li><li>Cotman, C. W., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structural+studies+on+synaptic+complexes+from+rat+brain.">Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain.</a> J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).</li><li>Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+postsynaptic+densities+from+rat+brain.">Isolation of postsynaptic densities from rat brain.</a> The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).</li><li>Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+postsynaptic+densities+from+various+brain+regions:+enrichment+of+different+types+of+postsynaptic+densities.">Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities.</a> The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).</li><li>Jones, D. H., Matus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+synaptic+plasma+membrane+from+brain+by+combined+flotation-sedimentation+density+gradient+centrifugation.">Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation.</a> Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).</li><li>Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+immunochemical+evidence+that+the+"major+postsynaptic+density+protein"+is+a+subunit+of+a+calmodulin-dependent+protein+kinase.">Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).</li><li>Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+tyrosine-phosphorylated+protein+in+the+postsynaptic+density+fraction+is+N-methyl-D-aspartate+receptor+subunit+2B.">The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).</li><li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein.">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter.">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).</li><li>Ma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-induced+Gadd45b+promotes+epigenetic+DNA+demethylation+and+adult+neurogenesis.">Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis.</a> Science. 323, 1074-1077 (2009).</li><li>Budreck, E. C., Scheiffele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin-3+is+a+neuronal+adhesion+protein+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arc/Arg3.1+regulates+an+endosomal+pathway+essential+for+activity-dependent+beta-amyloid+generation.">Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation.</a> Cell. 147, 615-628 (2011).</li><li>Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapsin+I+(protein+I),+a+nerve+terminal-specific+phosphoprotein.+III.+Its+association+with+synaptic+vesicles+studied+in+a+highly+purified+synaptic+vesicle+preparation.">Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation.</a> J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).</li><li>Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+characterization+of+synaptic+vesicles+of+high+purity.">The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity.</a> Brain Res. 109, 285-309 (1976).</li><li>Cheng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+and+absolute+quantification+of+postsynaptic+density+proteome+isolated+from+rat+forebrain+and+cerebellum.">Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).</li><li>Sheng, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postsynaptic+architecture+of+excitatory+synapses:+a+more+quantitative+view.">The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view.</a> Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Eggena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+histone+H1+as+a+cognate+antigen+of+the+ulcerative+colitis-associated+marker+antibody+pANCA.">Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA.</a> J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homodimerization+of+the+beta2-adrenergic+receptor+as+a+prerequisite+for+cell+surface+targeting.">Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting.</a> J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).</li><li>Bernocco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+detergent+fractionation+of+primary+neurons+for+proteomics+studies.">Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies.</a> Proteomics. 8, 930-938 (2008).</li><li>Grunewald, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+and+cytosolic+overexpression+of+LASP-1+correlates+with+tumor+size+and+nodal-positivity+of+human+breast+carcinoma.">Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma.</a> BMC Cancer. 7, 198 (2007).</li><li>Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+isoforms+of+actin-binding+proteins+on+distinct+populations+of+Golgi-derived+vesicles.">Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles.</a> J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).</li><li>Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+scaffolds+for+nicotinic+receptors+on+neurons.">Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons.</a> Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).</li><li>Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal-associated+membrane+protein+LAMP-1+is+a+novel+differentiation+marker+for+HC11+mouse+mammary+epithelial+cells.">The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells.</a> Differentiation. 61, 113-120 (1996).</li><li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner:+conserved+Pex5p+WXXXF/Y+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import.">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li><li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis.">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li><li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-100B,+neuron-specific+enolase+(NSE),+myelin+basic+protein+(MBP)+and+glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+in+cerebrospinal+fluid+(CSF)+and+blood+of+neurological+patients.">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li><li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells.">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li><li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina.">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

هناك العديد من الخطوات في الإجراء التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق نتيجة ناجحة. في الخطوة 3، فمن المهم أن يتم التوصل إلى درجة من التجانس متسقة لكل عينة. عندما المجانسة الأنسجة مع بالمواتير الخالط، ويستخدم بسرعة ثابتة ليس فقط بالنسبة للدوران مدقة، ولكن أيضا مع عدد من السكتات الدماغية. فترة حضانة خلال صدمة التناضحي يجب أن يكون دقيقا، لأن التجانس الموسعة أو الحضانة في محلول ناقص التوتر وليز الميتوكوندريا وتلوث العينة SPM. خطوة حاسمة أخرى هي في إعداد الكواشف، وخاصة حلول السكروز. إذا كان المولية من الحل السكروز غير صحيح فإن الإجراء لا تعمل. ولذلك، ينبغي عن طريق وزن السكروز، حل في 4 ملي HEPES حل ثم إضافة 4 ملي HEPES إلى الحجم النهائي الدقيق إعداد حلول السكروز. استكشاف الأخطاء وإصلاحها نصيحة: بناء الانحدار اختبار مع حلول السكروز مستعدة لENتأكد أن التدرج يتم تجميعها بشكل صحيح. إضافة تركيزات مختلفة من برموفينول الأزرق (على سبيل المثال، تركيز النهائي من 0.005٪ -0.02٪ ث / ت) لاثنين من السكروز ثلاثة حلول للمساعدة في التصور من ثلاث طبقات متميزة. من المهم للحد من مقدار الوقت بين عندما يتم تجميع التدرج وعندما يتم طرد الأنابيب. سيتم نشر العادي تدمير التدرج مع مرور الوقت، وهذا هو تسارع إذا كان هناك اهتزاز على مقاعد البدلاء حيث يتم تخزين التدرج. قبل pipetting لمن الحلول الفردية إلى مأخوذة يسمح لكميات دقيقة إلى أن pipetted مع الماصة الزجاج باستور. هذا أيضا يقلل من الوقت بين التجمع وتنبيذ فائق التدرج. استكشاف الأخطاء وإصلاحها نصيحة: بناء &quot;اختبار التدرج&quot; مع برموفينول صبغة زرقاء كما هو موضح أعلاه في نفس الوقت التدرجات السكروز للتجربة. وهكذا يمكن رصد سلامة التدرج مع مرور الوقت. سوف التدرج الاختبار بمثابةمؤشر الانتشار إذا يتم تجميع التدرجات بعيدا جدا مقدما أو يتعرضون للاهتزاز. أخيرا، من المهم لجمع العينة في SPM صغير كوحدة تخزين ممكن، لأنه من الضروري في وقت لاحق لتمييع العينة مع 2.5 كميات من الماء. من الناحية المثالية ينبغي جمع عينة في حجم 0.4-0.7 مل باستخدام حقنة سم مكعب 1. فإنه من المستحسن لبناء التدرجات متقطعة خلال المباراة النهائية 20 دقيقة تدور في الخطوة 7 للحد من الوقت بين التجمع وتنبيذ فائق التدرج. ويشمل البروتوكول على توصية لحجز كل من كسور مختلفة وتخزين هذه في -80 درجة مئوية لتحليلها لاحقا. لقد أثبتنا في إثراء البروتينات آخر متشابك في الشكل 2 فقط في عدد قليل من هذه الكسور. ومع ذلك، فإنه من المستحسن لقياس مستويات من البروتين من الفائدة في كل من الكسور لفهم التوزيع. مقارنة DISTRIBسوف ution من البروتين في الكسور مع غيرها من البروتينات علامة التحت خلوية تساعد أيضا للتأكد من أن الظروف التجريبية حققت تجزئة المطلوب. يلخص الجدول 2 علامات البروتين شائعة الاستخدام التي يمكن استخدامها كمؤشرات لمراحل تجزئة 8،27- 38. ويستخدم على نطاق واسع استخدام التدرج السكروز متقطع لإثراء أغشية البلازما متشابك. هذا الأسلوب له ميزة على التدرجات Percoll مستمرة في هذا التدرجات السكروز متقطعة هي أسهل لجعل ولا تتطلب معدات متخصصة. ومع ذلك، وهذه الطريقة قد لا تكون كافية لتوطين بالضبط بروتين من الفائدة، وهذه التطبيقات قد يفضل التدرج Percoll.

الخلايا العصبية التواصل من خلال نقاط الاشتباك العصبي، وينظم نوعية هذا التواصل إلى حد كبير تغييرات في تكوين البروتينات في المشبك. على وجه الخصوص، والبروتينات الموجودة في كثافة بعد متشابك تشارك في الاتصالات العصبية من مستقبلات الناقل العصبي السقالات وثيق مع أنظمة نقل الإشارة الخاصة بهم 1. وعلاوة على ذلك، يتم التحكم التغييرات دائمة في قوة فعالية متشابك من خلال إضافة أو إزالة مستقبلات في كثافة بعد متشابك 1-6. ولذلك، فإن العزلة والكمي للبروتينات متشابك هي تقنية ضرورية ومفيدة لاكتساب نظرة ثاقبة الطرق أن الخلايا العصبية تستجيب للمنبهات وتغيير فعالية متشابك 7. توضح هذه المقالة تقنية شائعة لعزل البروتينات متشابك من أنسجة الدماغ عن طريق القوارض تنبيذ فائق على التدرجات السكروز متقطع. في جزء متشابك غشاء البلازما يمكن إثراء والمعزولة على أساسكثافته في السكروز، والتي تم تحديدها تجريبيا لتكون مشابهة إلى 1.2 M السكروز. اعتمادا على هذه المسألة البيولوجية، والكسور التحت خلوية يمكن فصلها عن طريق التدرجات مستمرة أو متقطعة إما السكروز أو Percoll. التدرجات مستمرة تسمح لفصل البروتينات إلى كسور متعددة؛ هذا يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص للتدليل على المشاركة في توطين البروتينات داخل جزء معين 8. ومع ذلك، فإن إعداد التدرجات مستمرة أكثر شاقة وغير ضروري للعديد من التطبيقات. التدرجات متقطعة هي أسهل نسبيا للتحضير، ويمكن استخدامها لفصل البروتينات إلى بضع، والكسور يعرف عموما. التدرجات المتقطعة التي تتألف من ثلاث طبقات السكروز زيادة المولية وقد استخدمت على نطاق واسع لعزل البروتينات المرتبطة متشابك غشاء البلازما (SPM). هذا جزء متشابك غشاء البلازما يمكن معالجتها إلى مزيد من fractio كثافة بعد متشابكن (PSD) عن طريق العلاج المنظفات وعزل جزء المنظفات غير قابلة للذوبان. عندما كان أول وصف هذه العملية في 9،10 في عام 1960، تم استخدام المجهر الإلكتروني لإثبات عضيات والأغشية التي تحدد تقريبا غشاء البلازما متشابك والكسور كثافة بعد متشابك 9-14. وأظهرت هذه الدراسات إدراج الأغشية قبل وبعد متشابك والحويصلات المشبكية في جزء SPM. بعد العلاج المنظفات في المقام الأول على الإلكترون الكثيفة، كانت كثافة بعد متشابك مرئية. في الإجراء، يتم استخدام صدمة ناقص التوتر لقرصة قبالة عمليات متشابك من خلايا الجسم 10. هذه الخطوة يستفيد من حقيقة أن الميتوكوندريا هي أكثر مقاومة للصدمة التناضحي وتبقى سليمة، وحتى الرواسب في قاع التدرج السكروز (الشكل 1). باستخدام هذه التقنية نفس تخصيب، كانت SPM وPSD الكسور أولا كيميائيايحددها الكهربائي هلام بولي أكريلاميد وتسلسل مكونات البروتين الرئيسية 15-17. وقد استخدم تحليل لطخة الغربي في وقت لاحق لكشف وقياس مستويات البروتينات متشابك وتحديد هذه الكسور أكثر (الشكل 2). وقد استخدمنا هذه التقنية في مختبراتنا لقياس التغيرات في مستويات متشابك من نقل الدوبامين التي تحدث عند تكرار موضع Slc6a3 في الفئران 18. وقد استخدمنا هذه التقنية أيضا في NMDA مستقبلات الفئران ناقصة لكشف المشبك تخفيضات محددة في البروتينات التي هي جزء من interactome DISC1 19. ويتضح من تحليل لطخة غربية أن الكسور SPM تحتوي على البروتينات متشابك غشاء الحويصلة، وعلامات دخلول؛ جسيم داخلي، بروتينات الميتوكوندريا، غشاء المرتبطة الاصطناعية الانزيمات والجزيئات نقل الإشارة، فضلا عن عناصر لا تتجزأ من كثافة بعد متشابك والأغشية البلازما متشابك 20-23. Eيمكن الكسور PSD فين يكون التلوث مع بروتينات الميتوكوندريا وفيرة، وأنه قد يكون من الضروري إجراء الترسيب التدرج الثاني أو خطوات تنقية إضافية لإزالتها 13. مؤخرا، قدمت الطيف الكتلي الكمي قائمة تضم أكثر من 100 البروتينات في كثافة بعد متشابك وحدها، وكذلك مؤشرا على الوفرة النسبية لهذه المكونات 24،25.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES, pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>BioShop</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &amp;frac12;&amp;rdquo; needle</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 cc syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA Model RW 16 basic stirrer</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 fixed angle rotor</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor swinging bucket</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L-80 floor ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 fixed angle rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient

تقنيات تجزئة التحت خلوية العصبية تسمح الكمي من البروتينات التي يتم الاتجار من وإلى المشبك. كما هو موضح في الأصل في أواخر عام 1960، البروتينات المرتبطة متشابك غشاء البلازما يمكن عزلها بواسطة تنبيذ فائق على التدرج كثافة السكروز. مرة واحدة يتم عزل الأغشية متشابك، مجمع الجزيئات المعروفة باسم الكثافة آخر متشابك يمكن عزل لاحقا بسبب إينسولوبيليتي المنظفات لها. لا تزال التقنيات المستخدمة لعزل أغشية البلازما والبروتينات متشابك كثافة بعد متشابك في الأساس نفسه بعد 40 عاما، وتستخدم على نطاق واسع في أبحاث علم الأعصاب الحالي. تفاصيل هذه المقالة تجزئة البروتينات المرتبطة متشابك غشاء البلازما وكثافة بعد متشابك يستخدم التدرج السكروز متقطع. مما أدى الاستعدادات البروتين هي مناسبة لالنشاف الغربي أو تحليل 2D DIGE.

إعداد التدرج كثافة السكروز ينبغي أن يؤدي إلى فصل واضح من الحلول الثلاثة المولي من السكروز (0.8، 1.0، و 1.2 M السكروز). انظر الشكل 3A للحصول على مثال التدرج قبل إضافة عينة البروتين. إذا تم إعداد التدرج كثيرا مقدما، أو إذا تم إعداده على سطح مقاعد البدلاء مع الاهتزاز من المعدات الأخرى، سوف يثير الشبهة ولن يتحقق الفصل السليم التدرج. إذا فصل واضح من الحلول الثلاثة غير مرئي، فإنه من المستحسن لجعل التدرج الجديد قبل إضافة عينة البروتين. انظر الشكل 3B للحصول على مثال التدرج السكروز عند إضافة العينة البروتين (السهم الأسود). بعد الطرد المركزي، ينبغي أن يكون هناك فرق واضح من الكسور البروتين في كل البيني (0.32 / 0.8، 0.8 / 1.0، 1.0 / 1.2). وبالإضافة إلى ذلك ينبغي أن يكون بيليه مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب. انظر الشكل 3C للحصول على مثالجزء من العصابات بعد تنبيذ فائق. إذا الكسور موجودة منتشرة في الطور البيني فقط، فمن المرجح أن التدرج تعرض للخطر وليس ينصح مزيد من المعالجة. ويتجلى النشاف الغربي من الكل، SPM والبروتين PSD1T عينات من الماوس المخطط في الشكل 2. وإثراء البروتينات متشابك مثل GluR1، PSD95، وكمكي، يمكن تصور عن طريق تحميل كمية ثابتة من البروتين (10 ميكروغرام) من المجموع، SPM ، والكسور مديرية الأمن العام. يتم إثراء البروتينات Perisynaptic مثل نقل الدوبامين (DAT) في جزء SPM، ولكن خرج من المنظفات الخطوات اللاحقة في عملية تخصيب مديرية الأمن العام. لضمان تحميل ما يعادلها، ومستويات البروتين يمكن تصور على الغشاء طخة الغربي من تلطيخ مع الشقائقية الأحمر 26. وكثيرا ما ذكرت &quot;الضوابط تحميل&quot; القائم على الأجسام المضادة في الأدب، ولكن هذا قد يكون تسمية خاطئة منذ البروتينات متشابك قد يكون فرقينظم erentially في مجموعات العلاج التجريبي. إذا كان المطلوب على &quot;السيطرة تحميل&quot; القائم على الأجسام المضادة، فإنه من المستحسن أن أولا تحديد ما يعادل البروتين تحميل بواسطة الشقائقية تلطيخ، ومن ثم اختبار عدة بروتينات إشارة إلى تحديد تلك التي لا تتغير في المجموعات التجريبية المختلفة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig1highres.jpg" width="500" /> الرقم 1. سير العمل من تجزئة التحت خلوية لإثراء SPM وكسور البروتين مديرية الأمن العام. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. صمة عار التمثيلية الغربية من الكل، SPM، والبروتين PSD1T من الماوس المخطط. تم حل 10 ميكروغرام من استخراج البروتين في SDS-تغيير طبيعة، 10٪ الاكريليكالأميد المواد الهلامية، ونقل إلى الأغشية PVDF. بعد ذلك حضنت هذه البقع مع الأجسام المضادة الأولية لαCaMKII، GluR1، PSD-93، وPSD-95، وهي كلها مكونات كثافة بعد متشابك. وفقا لذلك، يتم إثراء هذه البروتينات في SPM والكسور مديرية الأمن العام. بالتناوب، وحضنت البقع مع الأجسام المضادة الأولية لDAT، الذي يقع في أغشية قبل المشبكي في المخطط. في حين تم تخصيب DAT في جزء SPM، فإنه ليس جزءا من مجمع PSD، وليس لوحظ مناعية في جزء مديرية الأمن العام. الأجسام المضادة ضد الأكتين أو الصوديوم / البوتاسيوم أتباز (نا / K مضخة) يمكن استخدام الضوابط تحميل، على الرغم من بعض الظروف التجريبية قد تؤثر على مستويات هذه البروتينات وكذلك ولذا يجب أن تحدد السيطرة تحميل المناسبة تجريبيا. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. </stرونغ&gt; أمثلة التمثيلية للالتدرج السكروز قبل وبعد تنبيذ فائق. A. بعد إعداد التدرج، ينبغي أن يكون هناك ثلاث مراحل التي هي واضحة عند عقد أنبوب يصل إلى النور. الأسهم البيضاء تشير إلى الطور البيني بين 0.8 / 1.0 M حلول السكروز و1.0 / 1.2 M حلول السكروز. B. عندما يتم تحميل العينة على رأس التدرج، هو في حل السكروز 0.32 M وستقع على رأس 0.8 M طبقة السكروز. C. بعد الطرد المركزي، فإن جناسة فصل إلى عدة كسور. سيتم إثراء جزء عائم في الطور البيني من 0.8 / 1.0 M حلول السكروز في الأغشية المايلين. الكسر في الطور البيني من 1.0 / 1.2 M حلول السكروز يمثل جزء SPM التي يتم تجميعها مع إبرة وحقنة. وأثرى بيليه في أسفل الأنبوب للبروتينات الميتوكوندريا. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> SOLUستعقد </td><td> السكروز HEPES مخزنة </td><td> مثبطات الأنزيم البروتيني </td><td> * مثبطات Phophatase </td></tr><tr><td> 1 M HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4 </td><td> 0.32 M السكروز في 4 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) </td><td> 0.25 ملي PMSF (250 ملي الأسهم في الإيثانول، 1،000x) </td><td> 10 ملي فلوريد الصوديوم (الأسهم 500 ملم، 50X) </td></tr><tr><td> 4 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4 </td><td> 0.8 M السكروز في 4 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) </td><td> 1.5 ميكروغرام / مل أبروتينين (الأسهم 1.5 ملغ / مل، 1،000x) </td><td> 2.5 ملي الصوديوم بيروفوسفيت (الأسهم 250 ملم، 100X) </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 1.0 M السكروز في 4 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) </td><td> 10 ميكروغرام / مل Leupeptin (الأسهم 10 ملغ / مل، 1،000x) </td><td> 1.0 ملي ب-غليسروفسفات (الأسهم 200 ملم، 200X) </td></tr><tr><td> 50 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4) 2 ملي EDTA </td><td> 1.2 M السكروز في 4 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) </td><td> 0.1 ملغ / مل Benzamidine (الأسهم 100 ملغ / مل، 1،000x) </td><td> 5.0ملي الصوديوم Orthovanadate (الأسهم 500 ملم، 100X) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10 ميكروغرام / مل Pepstatin (الأسهم 5 ملغ / مل في الإيثانول، 500X) </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. المطلوبة الكواشف <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="614" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:88px;"> جزء </td><td style="width:191px;"> نسبة البروتين </td><td style="width:335px;"> علامة البروتين </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> P1 </td><td> النووية </td><td> هيستون H1 27 </td></tr><tr height="72"><td height="72" style="height:72px;"> S1 </td><td> العصارة الخلوية / الأغشية </td><td style="width:335px;"> calnexin 28 (شبكية هيولي باطني)، وتويولين 29 (الهيكل الخلوي)، GAPDH 30 (العصارة الخلوية)، 58K جولجي المواليةبروتين 31 (جهاز جولجي) </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> P2 وP2 &quot; </td><td> synaptosomes الخام </td><td style="width:335px;"> أمبا ومستقبلات NMDA مفارز 32 </td></tr><tr height="48"><td height="48" style="height:48px;"> S2 و S2 &quot; </td><td> العصارة الخلوية / الأغشية الخفيفة </td><td style="width:335px;"> nNOS1 29 (العصارة الخلوية)، GAPDH (العصارة الخلوية)، LAMP1 33 (يحلول)، PEX14 34 (تاكسدي) </td></tr><tr height="45"><td height="45" style="height:45px;"> P3 </td><td> جسيم مشبكي / الميتوكوندريا </td><td style="width:335px;"> VDAC 35 (الميتوكوندريا)، أمبا وNMDA مفارز مستقبلات (جسيم مشبكي) </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> S3 </td><td> حويصلة متشابك </td><td style="width:335px;"> SV2 8، 8 synaptophysin </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> 0.8 M / M 1.0 </td><td> م<html> يلين </td><td style="width:335px;"> البروتين الأساسي المايلين 36 </td></tr><tr height="45"><td height="45" style="height:45px;"> 1.0 M / M 1.2 </td><td> SPM </td><td style="width:335px;"> أمبا ومستقبلات NMDA مفارز، علامة قبل المشبكي (SNAP25 8)، neurexin 32، neuroligin 32 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> 1.2 MP </td><td> الميتوكوندريا </td><td style="width:335px;"> VDAC 35 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;"> PSD (1T) </td><td> PSD </td><td style="width:335px;"> PSD93 32، PSD95 32، أمبا ومستقبلات NMDA مفارز، neuroligin، PICK1 32، كمكي 32 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> TS </td><td> أغشية قبل المشبكي </td><td style="width:335px;"> SNAP25، Munc18 37، الباسون 38، neurexin </td></tr><tr height="43">آيت: 43px؛ &quot;&gt; PSD-2T </td><td> PSD المخصب </td><td style="width:335px;"> PSD95، أمبا ومستقبلات NMDA مفارز، PICK1، كمكي </td></tr></tbody></table> الجدول 2. قائمة من علامات البروتين للتمييز الكسور التحت خلوية

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient at JoVE.com

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

تفاصيل هذه المادة في إثراء البروتينات المرتبطة متشابك غشاء البلازما بواسطة تنبيذ فائق على التدرج السكروز متقطع. كما يوصف إعداد لاحق من البروتينات كثافة بعد متشابك. الاستعدادات البروتين هي مناسبة لالنشاف الغربي أو تحليل 2D DIGE.

إعداد متشابك غشاء البلازما والبروتينات الكثافة بعد المشبكي باستخدام التدرج السكروز متقطع

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

preparation-synaptic-plasma-membrane-postsynaptic-density-proteins

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.1K Views.  University of Toronto.  تفاصيل هذه المادة في إثراء البروتينات المرتبطة متشابك غشاء البلازما بواسطة تنبيذ فائق على التدرج السكروز متقطع. كما يوصف إعداد لاحق من البروتينات كثافة بعد متشابك. الاستعدادات البروتين هي مناسبة لالنشاف الغربي أو تحليل 2D DIGE. 

Video: Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

غشاء الدماغ تجزئة: أ<em&gt; إكس فيفو</em&gt; نهج لتقييم توطين البروتين سوبسينابتيك

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Biochemistry

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

إعداد Synaptoneurosomes من اللحاء باستخدام الماوس متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma membrane and then transported to the early endosomes. The internalized proteins could be transited to the lysosome for degradation or recycled back to the plasma membrane. A robust endocytic recycling pathway is required to balance the removal of membrane materials from endocytosis. Various proteins are reported to regulate the pathway, including ADP-ribosylation factor 6 (ARF6). Density gradient ultracentrifugation is a classical method for cell fractionation. After the centrifugation, organelles are sedimented at their isopycnic surface. The fractions are collected and used for other downstream applications. Described here is a protocol to obtain a recycling endosome-containing fraction from transfected mammalian cells using density gradient ultracentrifugation. The isolated fractions were subjected to standard Western blotting for analyzing their protein contents. By employing this method, we identified that the plasma membrane targeting of engulfment and cell motility 1 (ELMO1), a Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) guanine nucleotide exchange factor, is through ARF6-mediated endocytic recycling.

This paper aims to present a protocol for preparing recycling endosomes from mammalian cells using sucrose density gradient ultracentrifugation.

كثافة التدرج الطرد الفائق للتحقيق في إعادة تدوير الغدد الصماء في خلايا الثدييات

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

التنميط المتعدد بدون صانعي التدرج أو أنظمة التجزئة

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

عزل مواقع الاتصال بالميتوكوندريا

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

تسليط الضوء على المؤلف: الكشف عن مواقع الاتصال بالميتوكوندريا والرؤى المعمارية 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

عالية الدقة الكمية متشابك بروتيوم من التنميط ماوس مناطق الدماغ بعد السمعية التمييز التعلم

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

إعداد متشابك غشاء البلازما والبروتينات الكثافة بعد المشبكي باستخدام التدرج السكروز متقطع

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

غشاء الدماغ تجزئة: أ

على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

إعداد Synaptoneurosomes من اللحاء باستخدام الماوس متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز

كثافة التدرج الطرد الفائق للتحقيق في إعادة تدوير الغدد الصماء في خلايا الثدييات

التنميط المتعدد بدون صانعي التدرج أو أنظمة التجزئة

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

عالية الدقة الكمية متشابك بروتيوم من التنميط ماوس مناطق الدماغ بعد السمعية التمييز التعلم