وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد القومية للصحة، R01CA142928.

1. في الوريد حقن الأزرق ايفانز في ذيل الماوس الجانبي وريد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول 0.5٪ من اللون الأزرق العقيمة ايفانز في برنامج تلفزيوني. إذا لزم الأمر، فلتر تعقيم الحل لإزالة أي الجسيمات التي لم المنحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح 200 ميكرولتر حل الأزرق ايفانز في حقنة. تجنب كل فقاعات الهواء التي قد هربوا إلى الحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران هي المكان الذي 8-12 أسابيع من العمر في جهاز ضبط النفس حتى يتسنى للحيوانات بحرية غير متحرك ولكن يمكن التعامل معها ذيله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجهاز ضبط النفس الماوس على جانبها حتى الذيل الأفقي السياق مرئيا بسهولة وتواجه التصاعدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التمسك الذيل مع اليد غير المسيطرة بين الإبهام والسبابة و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج إبرة (قياس صغيرة، 27-30) في 10-15 درجة زاوية مسبقا، حتى شطبة، في الوريد الذيل الأفقي نحو اتجاه الرأس. إبقاء موازية الإبر والمحاقن الى الذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dس يتم تطبيق الضغط مرة أخرى للتأكد من تحديد المكان المناسب لأن ذلك قد تنهار في الوريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن ببطء 200 ميكرولتر حل الأزرق ايفانز في الوريد ذيل الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة السهولة التي الغطاس التقدم، وهذا هو دليل على التنسيب الصحيح للإبرة في الوريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الماوس مرة أخرى إلى قفصه والالتزام به لمدة 30 دقيقة. </li></ol> 2. كوكتيل الجهاز واستخراج الأزرق ايفانز من هيئات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران من خلال خلع عنق الرحم. لأغراض الفحص ينصح مايلز خلع عنق الرحم كما أنه يحد تدخل كبير مع نفوذية الأوعية الدموية. تضحية جميع الفئران في نفس الوقت، في أسرع وقت ممكن. العمل مع الأفواج من 6 الفئران أو أقل، لأنه بعد وقت قصير من وفاة الأوعية الدموية تصبح أكثر نفاذا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران على ظهورهم ويعلقون أقدامهم على لوحة بيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح تجويف البطن والصدر للكشف عن ثورمايا والبطن الأجهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور ممثل لإظهار الاختلافات في التسرب الأزرق ايفانز. تشمل جميع الفئران في نفس المجال من أجل الحصول على ظروف الإضاءة مماثلة لجميع الفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع أجهزة الفائدة ووضعها في أنابيب 1.5 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن أنبوب فارغ وتقديم قيمة الرصيد إلى الصفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينات الأنسجة والوزن عليه. تكرار لجميع عينات الأنسجة. يمكن أن تكون الأنسجة الهواء المجفف للقضاء على التباين بين المحتوى المائي أجهزة مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . إضافة 500 ميكرولتر الفورماميد إلى كل الأنسجة أنبوب العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جميع أنابيب إلى 55 درجة مئوية أو حمام مائي كتلة الحرارة. احتضان لمدة 24-48 ساعة لاستخراج ايفانز الأزرق من الأنسجة. </li></ol> 3. Extravasated الكمي للالأزرق ايفانز في النسيج الخلالي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لالفورماميد / إيفانز خليط الأزرق إلى أي شظايا بيليه الأنسجة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية في 610نانومتر. يستعملون 500 ميكرولتر الفورماميد كما فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نانوغرام ايفانز الأزرق extravasated في الأنسجة ملغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم كافة البيانات في الرسم البياني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل احصائى لتحديد فروق ذات دلالة إحصائية. </li></ol>

<ol><li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+NO+synthase%3A+role+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li>
<li>Bertglia, S., Giusti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nitric+oxide+in+capillary+perfusion+and+oxygen+delivery+regulation+during+systemic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).</li>
<li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+reactions+to+histamine%2C+histamine-liberator+and+leutaxine+in+the+skin+of+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs.</a> J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).</li>
<li>Weis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+cardiovascular+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer.</a> Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).</li>
<li>Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+endothelial+hyperpermeability%3A+implications+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation.</a> Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).</li>
<li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability%2C+blood+pressure%2C+and+organ+damage+in+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens.+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).</li>
<li>Scheppke,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2%2FSrc+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).</li>
<li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CD34+Leads+To+Exacerbated+Autoimmune+Arthritis+through+Increased+Vascular+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability.</a> J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).</li>
<li>Dvorak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-derived+mediators+of+enhanced+microvascular+permeability%2C+vascular+permeability+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%2C+histamine%2C+and+serotonin%2C+cause+leakage+of+macromolecules+through+a+new+endothelial+cell+permeability+organelle%2C+the+vesiculo-vacuolar+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle.</a> Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).</li>
<li>Le Guelte, A., Gavard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell-cell+junctions+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability.</a> Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).</li>
<li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+%22endothelium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم الصراع أو المصالح المالية المتنافسة.

نفاذية الأوعية الدموية هو علامة حاسمة للحصول على مركز الأوعية الدموية. وقد تبين زيادة نفوذية الأوعية الدموية لتكون موجودة في العديد من الأمراض الجهازية، بما في ذلك مرض السكري وارتفاع ضغط الدم، وأمراض المناعة الذاتية 6،7،8. وقد تبين زيادة نفوذية الأوعية الدموية التي تتوسط فيها إجهاد القص، عوامل النمو مثل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية وعامل نمو الخلايا الليفية، مثل الهستامين وسطاء التهابات، والسيروتونين براديكينين 9. ويعتقد تسرب المياه والجزيئات الصغيرة أن تحدث من خلال فتحات صغيرة بين الخلايا البطانية. وينظم بدقة قوة الخلية الى خلية تقاطعات بواسطة التفاعل بين جزيئات 10. في الظروف الفسيولوجية البطانة هي منفذة للماء وأيونات، وغير منفذة للبروتينات. وهكذا، في غياب المحفزات التهابات، ويقتصر الزلال لتدفق الدم ولا ينتقل الى السائل خارج الخلية. عن طريق حقن Eعربات الأزرق، الذي يربط صبغة الزلال، يمكننا رصد مدى تسرب البروتين من مجرى الدم إلى الأنسجة الخلالية. وهناك نسخة معدلة من هذا الاختبار يستخدم الفلورسنت التي تحمل علامات المجهرية. باستخدام مختلف المجهرية الحجم أو الوزن الجزيئي مختلفة الفلورسنت التي تحمل علامات ديكستران (4-70 كيلو دالتون) يمكن للمرء أن إجراء تقييم أفضل لمدى الضرر البطانية. ومع ذلك، فإن هذا الخيار يلغي سهولة التصور ويتطلب إصلاح الأنسجة والتصوير المجهري الفلورسنت، أو القياس باستخدام قارئ لوحة مضان. في المختبر استخدمت دراسات نفاذية الأوعية بنجاح في الأدب 11. عنصرا أساسيا في أي دراسة في المختبر نفاذية هو سليمة، أحادي الطبقة خلية متموجة. هذه المقايسات استخدام غرفة كلاسيكية مزدوجة حيث يتم استزراع الخلايا البطانية في أحادي الطبقة على نفاذية غشاء تقع في مجلس الشيوخ. يتم تطبيق الصبغة إلى الأعلىويتم تقييم وغرفة البطانية نفاذية الخلية عن طريق قياس كمية الصبغة التي تصل إلى مجلس النواب. نتائج تقليد في معظم الحالات في نتائج الفحص الجسم الحي. ومع ذلك، فإنها تفتقر إلى إطار مناسب الفسيولوجية ومعقدة وبالتالي من تعقيد النتائج. والنهج في المختبر كما يلغي دور pericytes، الخلايا التي، في الأنسجة الحية، على اتصال وثيق مع الخلايا البطانية وإرسال إشارات لانتشار الخلايا البطانية، ونمو الأوعية المتفرعة. ينبغي من الناحية المثالية نتائج الاختبار مايلز تكون مصحوبة الدراسات الجزيئية التي يواصل النظر في الفرضية التي يتم اختبارها. كما ذكر، في الحي كله، نفاذية الأوعية الدموية يعتمد على العديد من المتغيرات، وبالتالي النتائج لفحص النفاذية في الجسم الحي لابد من تفسيرها في ضوء تعقيد النظام تحليلها.

تشكيل وصيانة الحواجز نفاذية انتقائية ضرورية لتطوير الجهاز السليم و1،2 الأداء. الخلايا البطانية المبطنة للتجويف الأوعية الدموية وتشكل حاجزا شبه منفذ التي لا غنى عنها في نقل الدم بين الانتقائية والفضاء الخلالي من جميع الأجهزة. يتم الاحتفاظ حاجز النفاذية الكافية من خلال تقاطعات خلية الى خلية الضيق الذي تخضع للرقابة الصارمة من قبل عوامل النمو، السيتوكينات والجزيئات الأخرى. 3 الإجهاد. يمكن تعطيل الجدار الخلية البطانية يؤدي إلى زيادة نفاذية الأوعية الدموية والتسرب. وينظر في هذه الآثار الحالات المرضية المختلفة وفهم الإشارات الجزيئية التسطير يتطلب أساليب متعددة التخصصات 4،5. في هذه المقالة، ونحن تصف طريقة في الجسم الحي لقياس نفاذية الأوعية باستخدام نموذج الفأر. الفحص نحن تصف، المعروف أيضا باسم فحص مايلز، هو جيد أنشأناished طريقة لاختبار نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي. ويستند الفحص على حقيقة أنه في ظل الظروف الفسيولوجية القاعدية، الزلال لا عبور حاجز غشائي. يتم حقن ايفانز الأزرق، وهي صبغة الآزو مع تقارب عالية لالزلال، في مجرى الدم لحيوانات التجارب، وتحت ظروف الفسيولوجية، ومن المتوقع أن تكون مقيدة داخل الأوعية الدموية. عند إضافة التحفيز نفاذية الأوعية الدموية، إما موضعيا أو جهازيا، والأوعية الدموية تبدأ في تسرب البروتين، وبالتالي، أيضا الأزرق ايفانز المنضم إلى الألبومين. وهذا يؤدي إلى تلون مزرق السريع للأنسجة التي لديها سفن نفاذية. حقن صبغة الناجح لفي ذيل الماوس الوريد الوحشي هو أمر حاسم لنتيجة جيدة من التجربة. تقنية حقن الوريد ذيل يتطلب ممارسة واسعة ويجب أن يتقن قبل بدء التجربة. نفاذية الأوعية تعتمد بشكل كبير على عمر ووزن علىIMAL، لذلك عند مقارنة سلالات الفئران مختلفة لا بد أن الفئران أو غيرها من المواضيع اختبار مقربة من تواريخ الميلاد متطابقة والوزن. العوامل الأخرى التي تؤثر على نفاذية حاجز غشائي هي الظروف البيئية مثل الرطوبة ودرجة الحرارة، والأهم من ذلك،. الضغط التعامل مع الماوس بسبب العديد من العوامل التي يمكن أن تؤثر على نتائج التجربة أنه من المستحسن دائما أن يتم تكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل ويقوم التحليل الإحصائي. ويمكن استخدام هذا الاختبار لمقارنة أو نفاذية الأوعية من الفئران التي تم تعديلها وراثيا، وكذلك الفئران مع خلفيات وراثية مختلفة. ويمكن تقييم النفاذية في وجود أو عدم وجود التحفيز، وهذا يتوقف على وظيفة الجين الذي هو التضمين. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا الفحص أو لاختبار تأثير مركبات مختلفة على نفاذية الأوعية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> كاشف </td></tr><tr><td> EVANS الزرقاء </td><td> SIGMA </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> الفورماميد </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 0.2M الفوسفات كلوريد الصوديوم 1.5M درجة الحموضة 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> الطيف </td><td> EPPENDORF </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> MOUSE التقييد DEVICE </td><td> HARVARD APPARATUS </td><td> 340012 </td><td></td></tr><tr><td> المحاقن </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> إبر </td><td> BD </td><td> 305106 </td><td> مقياس من إبرة يعتمد على حجم الحيوان. </td></tr><tr><td> توازن </td><td> دنفر ناغتس INSTRUMENT </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

an in vivo assay to test blood vessel permeability

ويستند هذا الأسلوب على حقن الوريد الأزرق ايفانز في الفئران كما اختبار نموذج حيواني. ايفانز الأزرق هو صبغة التي تربط الزلال. في ظل ظروف الفسيولوجية البطانة غير منفذ لالزلال، لذلك ايفانز الأزرق بقايا الزلال محدد مقيد داخل الأوعية الدموية. في ظروف مرضية تعزز زيادة الخلايا البطانية نفاذية الأوعية الدموية تفقد جزئيا اتصالاتهم وثيقة والبطانة تصبح قابلة للاختراق للبروتينات صغيرة مثل الزلال. هذا الشرط يسمح لانصباب الأزرق ايفانز في الأنسجة. A البطانة صحية تمنع تسرب للصباغة في الأنسجة المجاورة أوعية دموية. سوف الأجهزة مع زيادة نفاذية تظهر تلوين الزرقاء زيادة كبيرة مقارنة مع أجهزة البطانة سليمة. ويمكن تقييم مستوى نفاذية الأوعية الدموية عن طريق التصور بسيطة أو عن طريق القياس الكمي للصباغة أدرجت في مليغرام من أنسجة حيوانات التجارب التحكم مقابل / الأنسجة. اثنين باورجوانب من هذا الاختبار rful هي بساطتها والخصائص الكمية. ويمكن استخراج ايفانز الأزرق الصبغة من الأنسجة احتضان كمية معينة من الأنسجة في الفورماميد. ايفانز أقصى امتصاص الأزرق هو 620 نانومتر في الدنيا والامتصاص هو في 740 نانومتر. باستخدام منحنى القياسية لايفانز الأزرق، يمكن تحويل القياسات الكثافة البصرية في صبغ مليغرام لكل مليغرام من القبض على الأنسجة. وينبغي استخدام التحليل الإحصائي لتقييم فروق ذات دلالة إحصائية في نفوذية الأوعية الدموية.

<html> استخدمنا في فحص النفاذية المجراة لاختبار تسرب السفينة في الفئران 8-12 أسابيع من العمر. هذا الاختبار مفيد في المقارنة بين النفاذية النسبية الأوعية الدموية بين الحيوانات من الخلفية الجينية المختلفة أو في سلالة واحدة من الفئران التعرض للعلاجات التي تؤثر على الأوعية الدموية. نتائجنا تظهر أن سلالة من الفئران المعدلة وراثيا التي صنعناها في المختبر لديه البطانة أكثر نفاذية مقارنة البرية من نوع الفئران. هذه التغييرات واضحة على المستوى العيانية في العديد من الأجهزة (الشكل 1). كنا قادرين على قياس الفرق في نفاذية الأوعية عن طريق قياس spectophotometricaly ايفانز الأزرق التي تم التقاطها لكل غرام من النسيج في مختلف الأجهزة. كما لاحظنا في الشكل 2 مختلف الأجهزة تظهر استجابة لإشارات مختلفة محفز النفاذية وبالتالي تظهر صبغة مختلفة تراكم. وهذا هو أيضا وظيفة من مستويات الأوعية الدموية في الأنسجة المختلفة. = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50062/50062fig1.jpg" alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50062/50062fig1highres.jpg"/> الشكل 1. تمت التضحية ايفانز الأزرق التسرب في الأنسجة. بعد 30 دقيقة الفئران حقن ايفانز الأزرق من خلال خلع عنق الرحم. أخذت الصور ممثل أجهزة الفائدة. <img src="/files/ftp_upload/50062/50062fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. تحديد الكميات من التسرب الأزرق ايفانز في الأنسجة المختلفة. وحضنت 50-100 ملغ الأنسجة مع 500 ميكرولتر الفورماميد لاستخراج extravasated ايفانز الأزرق. وقد تم قياس الكثافة البصرية في 610 نانومتر وتحويلها إلى قياسات صبغ نانوغرام في الأنسجة extravasated ملغ. وتكرر التجربة ثلاث مرات.

Watch this Scientific Journal Video about An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability at JoVE.com

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

نحن نقدم ل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; فحص الدم لاختبار نفاذية الأوعية. ويستند هذا الفحص على حقن في الوريد لصبغ التصور واللاحقة من التشتت في أماكن الخلالي.

على<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; الفحص لفحص الدم نفاذية سفينة

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

an-in-vivo-assay-to-test-blood-vessel-permeability

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

64.4K Views.  Fox Chase Cancer Center. نحن نقدم ل في الجسم الحي فحص الدم لاختبار نفاذية الأوعية. ويستند هذا الفحص على حقن في الوريد لصبغ التصور واللاحقة من التشتت في أماكن الخلالي.

Video: An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

في مقايسات المختبر لتقييم الحاجز الدموي الدماغي تشبه تشكيل سفينة وتشوه

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

في فيفو حاجز الدم في الدماغ نفاذية مقايسة في الفئران باستخدام المسمى فلوريسسينتلي تتبع

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Neuroscience

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

أسلوب في فيفو لتقييم حاجز القناة الهضمية-الدم والايض الكبد من منتجات الحجمية

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

قياس النفاذية في واحدة Microvessel المعزولة الجرذ إعداد الرئة perfused الدم

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Biology

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

تروية دقيقة التقنية المعنية بالتحقيق في تنظيم Microvessel النفاذية في الفئران مساريق

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

في دراسة فيفو من تفاعل الانسان غشائي-خلية حوطية باستخدام مصفوفة جل التوصيل الفحص في الماوس

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

فحص نقل الخلايا البطانية كنموذج في المختبر لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الشبكي الداخلي

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby the permeability of the endothelium to blood cells, plasma macromolecules, and water can be adapted according to the physiological need. In certain diseases, cytokines and growth factors are released that target the endothelial barrier to transiently increase vascular permeability; however, their prolonged presence may cause chronic vascular hyperpermeability and thereby tissue-damaging edema. The Miles assay is an in vivo technique that allows researchers to study vascular hyperpermeability through the proxy measurement of vascular leakage. Here, we provide a detailed protocol on how to perform this procedure in the mouse, which is the most widely used model organism to study mammalian physiology and pathology. The procedure involves the intravenous injection of Evans blue dye to label the circulating albumin followed by multiple intradermal injections of permeability-inducing agents and vehicle control solutions into opposing flanks of the mouse. Consequently, Evans blue dye gradually leaks into the dermis, where it accumulates and can be extracted for quantification as leakage induced by the permeability-inducing agent relative to the vehicle. The Miles assay can be performed in wild type or genetically modified mouse models and may be combined with drug administration to study molecular mechanisms that regulate vascular permeability and identify agents/targets capable of inducing or blocking hyperpermeability.

Here, we present a protocol to measure the vascular leakage induced by intradermal administration of permeability promoting agents into the murine skin. This technique can be used to determine the ability of molecules to promote or inhibit vascular leakage or to study the molecular mechanisms that regulate vascular permeability.

تقييم الوكلاء الذي يحفز هايبربيرميبيليتي الأوعية الدموية في الجلد بمقايسة كم

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the endothelial barrier dysfunction is related to many salivary gland secretory disorders. The present protocol describes an in vivo paracellular permeability detection method to evaluate the function of endothelial tight junctions (TJs) in mouse submandibular glands (SMG). First, fluorescence-labeled dextrans with different molecular weights (4 kDa, 40 kDa, or 70 kDa) were injected into the angular veins of mice. Afterward, the unilateral SMG was dissected and fixed in the customized holder under a two-photon laser-scanning microscope, and then images were captured for blood vessels, acini, and ducts. Utilizing this method, the real-time dynamic leakage of the different-sized tracers from blood vessels into the basal sides of the acini and even across the acinar epithelia into the ducts was monitored to evaluate the alteration of the endothelial barrier function under physiological or pathophysiological conditions.

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In the present protocol, the endothelial barrier function of the submandibular gland (SMG) was evaluated by injecting different molecular weighted fluorescent tracers into the angular veins of test animal models in vivo under a two-photon laser-scanning microscope.

في الجسم الحي كشف نفاذية الأوعية الدموية في الغدة تحت الفك السفلي للفأر

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

تبسيط دراسات تكوين الأوعية باستخدام مقايسة سدادة هلام مصفوفة معدلة

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في تكوين الأوعية ونفاذية الأوعية من خلال مقايسة سدادة هلام مصفوفة معدلة

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

تعديل في الجسم الحي مصفوفة هلام المكونات مقايسة لدراسات تولد الأوعية

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

على

Summary

Explore More Videos