Name: genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)
Uploaded: 2012-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs at JoVE.com

1. عرف عملية ZFN التصميم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للإسراع في عملية تصميم ZFN، وينبغي أن محقق توفر ما يلي: </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معلومات عن الجينات المستهدفة مثل اسم الجينات والأنواع والجينات، وعدد الشرح / تحديد الهوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبوضوح أكثر من كل شيء الهدف من التجربة (على سبيل المثال، الضربة القاضية أو Knockin) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أي من العوامل المحددة للهدف الجينات التي تشمل شاذة بنية الجينات والبيولوجيا خاص المتورطين في مكان وراثية، أو أي مناطق متماثلة في مكان آخر في الجينوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نطاق معين من تسلسل الحمض النووي لالاصبع الزنك nucleases لاستهداف. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فريق المعلوماتية الحيوية سيغما تجري في تصميم ZFN السيليكو الأولية لتطوير المواقع المستهدفة الزنك الاصبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتقدم الأولية المواقع المستهدفة ZFN إلى مستشار ZFN التقنية والعلمية. لمشاريع أكثر تعقيدا من الناحية الفنية، هذا عالم سيغما يعمل مع المحققين لوضع استراتيجية المشروع. </li><lأنا&gt; فريق المعلوماتية الحيوية سيغما تجري تحليلا مع خوارزميات لتوليد ZFN في التصاميم ZFN السيليكو. ويشمل هذا البحث الجينوم للخارج الهدف المواقع، اخفاء، كرر الحزب الوطني الاسكتلندي وتحليل لكل موقع ZFN هدفا محتملا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعلوماتية الحيوية ويوفر هدف ZFN أعلى المواقع إلى محقق للمراجعة. بناء على موافقة من المواقع ZFN هدفا محتملا، وتقدم هذه المعلومات إلى فريق الإنتاج ZFN للبدء في عملية تصنيع ZFN. </li></ol> 2. عرف ZFN الإنتاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم الأرشيف سيجما من وحدات الاصبع الزنك لتجميع التصاميم ZFN المعتمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تجميع كل تصميم ZFN وتسلسل التحقق من على منصة عالية الإنتاجية الاستنساخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إرسالها مرة واحدة انتاج جميع التصميمات ZFN يتم استكمال كل ZFN إلى التحقق من الصحة. </li></ol> 3. التحقق من ZFNs مخصص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشاريع في ZFNيتم التحقق من صحة الإنسان، والجرذان والفئران أو CHO الأنواع في خطوط الخلايا تتميز أيضا لكل نوع، يتم استخدام فحص خميرة القائم للكائنات الحية الأخرى أو أنواع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تسليم البنى ZFN في خط الخلية المناسبة من قبل nucleofection وأعرب ZFNs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حصاد الحمض النووي من تجمع لخلايا ZFN transfected والمنطقة من الفائدة هو تضخيم PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويجري بعد ذلك فحص-1 سل على المنتج PCR. يتم تشغيل هلام إستشراد على فحص-1 سيل إلى نشاط ZFN التحقق من صحتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتقدم بعد ذلك ZFN أعلى نشاط تصميم كما أكده فحص سيل-1 إلى العميل. يتم تسليم ZFNs في مرنا والحمض النووي البلازميد مع بادئات PCR لفحص الجوف (1) والحمض النووي الجيني كعنصر تحكم إيجابية. </li></ol> 4. تسليم ZFNs المصادق عليها من قبل Nucleofection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 2x10 5 خلية / مل في اليوم السابق nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم nucleofection،اخراج الخلية الخط Nucleofector كيت الخامس وترك الحارة إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ملحق للNucleofection الخامس الحل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا. يجب أن تكون كثافة الخلايا بين الخلايا 5 2.5-5x10 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل لوحة 6 جيدا مع 2ml من المتوسط ​​في كل جيدا، وقبل الدافئة في حاضنة CO 2 في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 20 دقيقة قبل nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة 2x10 6 خلايا في ترنسفكأيشن (8X10 6 المجموع) في 200xg لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع 20 مل من محلول هانك في سولت المتوازن (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنابيب التجريبية: (انظر الجدول في النشرة الفنية مخصص ZFN) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة 6 جيدا تحتوي على وسائل الإعلام من الخطوة (6.5) من الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 400 ميكروليتر (100 ميكروليتر / رد فعل) من الحل Nucleofection V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رد فعل واحد في وقت واحد، أضف 100 ميكروليتر من الخلايا إلى كل DNA أو الرنا التي تحتوي على أنبوب. Transfإيه هذا المزيج على كوفيت مم electroporation 2 و nucleofect على Nucleofector مع البرنامج المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد nucleofection من كل عينة، واستخدام ماصة نقل لإضافة ~ 500 ميكرولتر من متوسط ​​prewarmed من لوحة 6 جيدا في الخطوة (6.9) إلى كوفيت. ثم، بعناية نقل الخلايا من كفيت والمتوسطة في prewarmed المتبقية في لوحة 6 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتهاء من كل ردود الفعل والعودة لوحة 6 جيدا للحاضنة CO 2 في 37 درجة مئوية. </li></ol> 5. حصاد الحمض النووي الجينوم بعد التسليم من ZFNs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 كذلك لوحة - لا حصاد كافة الخلايا المجمعة. من المهم للحفاظ على الثقافة من أجل الحصول على الخلايا وحيدة الخلية إلى استنساخ تخفيف بعد التأكد من أن لديك منتجات سيل-1 الهضم. واحد إلى ثلاثة أيام بعد nucleofection جمع الخلايا لإعداد الحمض النووي الصبغي باستخدام الحمض النووي الجيني GenElute الثدييات Miniprep كيت. </li></ol> 6. CEL-1 الفحص </P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR تضخيم الحمض النووي الجيني من العينات transfected ZFN والجينومية مراقبة إيجابية الحمض النووي المنصوص عليها في عدة، وذلك باستخدام بادئات الموردة. تم تعيين رد فعل PCR مع الشروط التالية: (انظر الجدول في النشرة الفنية مخصص ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد heteroduplexes من homoduplexes PCR تستغرق 10 ميكرولتر من رد فعل PCR من كل عينة ZFN المعالجة بالاضافة الى مراقبة واستخدام البرنامج التالي على thermocycler: 95 درجة مئوية، 10 دقائق 95 درجة مئوية إلى 85 درجة مئوية، -2 درجة مئوية / 2 85 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية، -0،1 درجة مئوية / 2 4 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من محسن و 1 ميكرولتر من S Nuclease (من رقم الكتالوج Transgenomic 706025) على كل رد فعل واحتضانها في 42 درجة مئوية لمدة 20-40 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الهضم على جل الصفحات TBE 10٪ مع علامات السليم، مثل الحمض النووي سلم DirectLoad WideRange (رقم الكتالوج D7058) (انظر النتائج في نشرة مخصصة التقنية ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فيتم الكشف عن CE إشارة إيجابية في ZFN المعاملة من قبل السكان CEL-I فحص، والمضي قدما إلى العزلة نسيلي والتوصيف. </li></ol> 7. نسيلي عزل وتوصيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وحيدة الخلية استنساخ نماذج ZFN المعالجة بالطرق العادية بما في ذلك نظام مراقبة الأصول الميدانية والاستنساخ التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للاستنساخ لتوسيع بما فيه الكفاية، ثم انشق بعض نسبة من الخلايا لحصاد الحمض النووي الجيني، وتجميد ما تبقى كما ظهر هذه المواد المخزونة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم الحمض النووي الجيني من الحيوانات المستنسخة باستخدام بادئات الجوف أنا وتحليل amplicon بواسطة سيل-I فحص (مع وبدون الحمض النووي WT ارتفعت في)، أو بدلا من استخدام هذه amplicon إلى الانتقال مباشرة إلى التنميط الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ مرشح الوراثي التي تم تحديدها على أنها الأليلات قديم الأسلوب المفضل. </li></ol> 8. ممثل النتائج ويقدم مثالا على سير العمل كله ZFN CompoZr في الشكل 2. يتم تسليم ZFNsإلى الخلايا حيث ربط ويلتصق تسلسل الحمض النووي المناسبة مما يؤدي إلى كسر مزدوج الجديلة (DSB). عملية الإصلاح الطبيعية، وغير المتجانسة انهاء انضمام (NHEJ)، وإصلاح جهاز تسوية المنازعات. في بعض الحالات نتائج NHEJ الشاذة في الإدراج أو الحذف أو الاستبدال من النيوكليوتيدات. PCR التضخيم من حصاد نتائج الحمض النووي الجيني في تشكيل مضاعف متغاير بين نوع البرية وamplicons تعديل بعد تمسخ / خطوة الصلب للتفاعل PCR. علاوة على ذلك من نتائج انزيم سيل-1 في شق من أي جزيئات مضاعف متغاير. يتم حل CEL-1 النتائج وفقا لتحليل PAGE لتأكيد الانقسام ZFN. الشكل (3) يوفر التخطيطي لفحص الجوف (1) والنتائج المتوقعة. وترد ممثل سيل-1 النتائج في الأرقام 4 و 5 الشكل 4 يحتوي على النتائج من زوج نشطة جدا من ZFNs (21٪) في K562 الخلايا؛. الشكل (5) يحتوي على النتائج من زوج أقل نشاطا (2.4٪) من ZFNs فيK562 الخلايا. ويؤكد ZFN النشاط في كل من الأرقام عن وجود شظايا PCR 2 أدناه جزء PCR الوالدين. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. صممت تمثيل متجهة nucleases إصبع الزنك. ZFNs البروتينات تتألف من إصبع الزنك الحمض النووي ملزم نطاق تنصهر فيها إلى المجال انشقاق في نوكلياز داخلية تقييد FokI. عندما ملزمة باعتبارها مثنوي مغاير، ZFNs إنشاء فاصل المزدوج تقطعت بهم السبل في تسلسل الحمض النووي المستخدم المحدد. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. التخطيطي لسير عمل مخصص خدمة ZFN. التمثيل البياني لسير العمل لإنشاء خط خلية المعدلة وراثيا باستخدام ZFNs CompoZr. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="الشكل (3)" /> الشكل 3. التخطيطي لفحص الجوف (1) والنتائج. A) ZFN س البلازميد<html> يتم تسليم ص مرنا للخلايا. ب) أعربت عن ZFNs ربط وقطع تسلسلها الهدف خلق فاصل مزدوج الجديلة (DSB) في جزء من الخلايا. C) إصلاح الشاذة من بعض DSBs بواسطة مثلي عدم انهاء انضمام النتائج في النوكليوتيدات الإدراج أو الحذف. D) يتم حصاد الحمض النووي الجيني من تجمع transfected من الخلايا وتضخيمها في موضع الاهتمام. EF) PCR المنتج هو التشويه والتحريف وإعادة تشكيل مطوع خلق مضاعف متغاير بين نوع البرية وamplicons تعديل. ز) عدم تطابق نتائج فحص نوكلياز داخلية سيل-1 في شق من الجزيئات مضاعف متغاير. يتم حل H) سل-1 إنزيم يساعد على هضم بواسطة PAGE. الملاحظ أن نسبة من الناتج الانقسام إلى فرقة بالحقن، التي تحددها البرمجيات يماغيج، يدل على قطع جزء وكفاءة ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. CEL-1 النتائج من ZFNs نشط 21٪ يماغيج البرنامج متاح في:_blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. CEL-1 النتائج من 2.4٪ ZFNs نشط يماغيج البرنامج متاح على العنوان التالي:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> .

<ol>
	<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+restriction+enzymes:+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain.">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li><li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases.">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).</li><li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases.">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433 (2009).</li><li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li><li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).</li><li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases.">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li><li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li><li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption.">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li></ol>

يمكن للباحثين تقديم ZFN خلايا معدلة أو الحيوانات للمتعاونين في إطار اتفاق للبحوث الترخيص القياسية. في هذا الظرف سيغما يطلب أن يتم وضع اتفاق لنقل المواد في مكان ما بين سيجما، والعملاء والمتعاونين ZFN بهم. ويمكن الاطلاع على الترخيص بحث في: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . إذا كان هناك إمكانية لتطبيق التجارية باستخدام الخلايا المعدلة ZFN سيجما ثم يطلب أن يتم وضع رخصة تجارية في المكان. وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المادة من قبل سيغما، وشركة

يتم عزل مرة ZFN المعدلة الخلايا لديهم دائم وراثية التعديلات الحمض النووي. هذه النتائج في القدرة على توليد خطوط الخلايا المعدلة ثابت أو الحيوانات تولد مع بعض التعديلات الوراثية المطلوبة لإجراء البحوث. CompoZr ZFNs مخصص توفير وسيلة قوية لجينوم التحرير في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. نشر الخريطة الجينية الناجحة مع تحرير ZFNs يشمل لكن لا يقتصر على خطوط الخلايا البشرية، الفأر، الجرذ، الزرد، الضفادع، الخنازير ونماذج البحوث CHO. 3،4،5،6،7،8،9 والقدرة على خلق وأكد المزدوج تقطعت بهم السبل انقطاع في موقع الهدف المنشود في نوع من الخلايا المحددة عندما يتم تسليمها بشكل صحيح ZFNs في خلية. ومن الممكن أيضا لأداء تسلسلي التعديلات إصبع الزنك إلى خلية من أجل أن يكون أكثر من التعديل الوراثي داخل الخلية. (10) القدرة على تحديد تسلسل هدف محدد وتعديلها فقط أن مكان معين هو السبب الرئيسي للقدرة على إنشاء عدة modifiالكاتيونات. يتم إنشاء شهادة CompoZr ZFN مخصص للتحليل مع الكواشف جدا المنصوص عليها في عدة وبذلك يضمن أنه تم جميع مكونات عدة التحقق من صحة تماما للنجاح العملاء. وتعرض الخطوات الحاسمة في سير العمل من البداية الى النهاية أدناه: استنساخ الخلية وينبغي اختبار القدرة على عزل وتوسيع خط خلية معينة قبل البدء في أي تجارب ZFN. ينبغي عزل الخلايا وحيدة وتوسيعها لضمان أن سكان clonally المستمدة من الممكن. بعض خطوط الخلايا هي المتمردة في هذه المسألة، والحيل مثل تخصيب اليورانيوم لاستنساخ التعديل، أو الثقافة مع وسائل الاعلام في ظروف يمكن أن تساعد في التغلب على هذه التحديات. تسليم كفاءة الاستغلال الأمثل للكفاءة تسليم أمر لا بد منه قبل تسليم ZFNs. ويمكن استخدام العديد من الأساليب بما في ذلك الدهون مقرها ترنسفكأيشن، electroporation، وnucleofectiفي. طريقة التسليم المثالي يتكون من احد ان يعطي مزيج معظم الأمثل للكفاءة تسليم وبقاء الخلية. قد Quantitating هذه الكفاءات أن يقدر من خلال تقديم سيطرة GFP البلازميد وquantitating بالمعاينة البصرية أو نظام مراقبة الأصول الميدانية 24 48hrs بعد التسليم. CEL-I مقايسة لا بد من أن يتم تنفيذ سيل-I فحص بالتوازي مع الضوابط المناسبة لضمان PCR، والهضم، والكهربائي المعلمات لن تتدخل في تفسير التجربة ZFN. كل مجموعة تضم الحمض النووي تحكم الجيني التي يتم استخدامها لخلق صورة سيل-I في شهادة التحليل. والتضخيم من الحمض النووي السيطرة مع الاشعال المقدمة تليها الجوف أنا الفحص تسمح للمستخدم لمقارنة النتائج مع تلك المنصوص عليها في شهادة التحليل (CofA) صورة، وعزل أي أوجه القصور المحتملة في هذا الجانب من تجربة. تعامل عنصر تحكم المناسبة السلبية مثل وهمية، أو خلية GFPوينبغي أيضا أن تدرج عينة للسماح للتوضيح أي من منتجات الانقسام غير محددة. نوعي / التحليل الكمي وحيدة الخلية المستنسخة بعد العلاج ZFN واحد استنساخ الخلية، قد يتم فحص السكان من الخلايا للتحرير في موضع الاهتمام من جانب عدد من الطرق. ويمكن إجراء CEL-I فحص الحمض النووي في الجينوم من الحيوانات المستنسخة لغرض تحديد استنساخ مرشح لمزيد من التنميط الجيني. من المهم أن amplicon ارتفاع PCR WT في amplicons عينة بنسبة 1:1 قبل تنفيذ سيل-I هضم مثل الحيوانات المستنسخة طافرة متماثل سوف تحتوي على جزيئات متجانسة، وبالتالي نقل سلبي سيل-I فحص النتيجة. طريقة بديلة لفحص هذه الحيوانات المستنسخة مرشح هو تصميم واحد هبوط التمهيدي PCR مباشرة على موقع الهدف ZFN. تستخدم جنبا إلى جنب مع واحدة من الاشعال السيطرة، نتيجة الفحص سلبية تشير إلى فقدان تسلسل WT. وهناك نسخة متخالف التي تحتوي على واحد على الأقل الأليل WT ذويمكن فصل درع PCR إشارة، ولكن من الحيوانات المستنسخة WT تماما قبل تنفيذ PCR في سياق qPCR SYBR. مرة واحدة وقد تم تحديد مرشح استنساخ بواسطة الطرق المذكورة أعلاه، قد تكون مرمزة من قبل pyrosequencing القياسية، وتسلسل عميق، أو تسلسل أساليب أخرى. لجميع طرق التسلسل، ينبغي إنشاء amplicon إنشاؤها من الحمض النووي الجيني نسيلي. ويمكن فصل لالأليلات pyrosequencing التقليدية بواسطة TA-PCR الاستنساخ المنتج، والتسلسل المستعمرات الفردية. لأساليب مثل التسلسل عميق هذه الخطوة ليست ضرورية. إصلاح تناظر إخراج (تقرير) يتيح هذا البروتوكول طريقة للخروج المغلوب ZFN بوساطة الجينات عبر NHEJ. ويمكن أيضا دمج الجينات المحورة سيجريه مقدمة من إحدى الجهات المانحة البلازميد مع الأسلحة التي تناظر الجناح موقع قطع ZFN. 11 في هذا السيناريو، ZFN خلقت يتم إصلاح المزدوج تقطعت بهم السبل انقطاع بواسطة HDR بدلا من NHEJ. توجه تقرير التنمية البشرية الأولويمكن تأكيد ntegration من الجينات المحورة باستخدام أساليب مماثلة للإجراءات المنصوص عليها في جميع أنحاء هذا البروتوكول. استكشاف الأخطاء وإصلاحها تسليم ZFNs ويمكن السيطرة على تسليم ZFN والتعبير التسليم عن طريق التسليم من GFP أو غيرها. هذا البلازميد و / أو التصور تحديد الكميات ويمكن التغلب على التعبير منخفضة نظرا لعدم توافق المروج مع نوع من الخلايا في المصالح عن طريق التسليم من ZFNs في شكل مرنا. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتم استخدام أسلوب الصدمة الباردة لزيادة فعالية ZFNs في الخلايا. 12 إذا تم استخدام مرنا لا بد من أن تغسل الخلايا قبل التسليم لضمان أن يتم نقل جميع Rnases المصل المشتقة. بل هو أيضا من الحكمة أن ذوبان الجليد ومرنا على الجليد، وإضافة إلى هذه الخلايا في آخر لحظة جدا للحد من أي فرصة للتحلل. CEL-I مقايسة تأسيس آسا سيل-Iy هو التضخيم محددة وافرة من موضع الاهتمام. إذا لاحظت منتجات التضخيم غير محددة استخدام معيار PCR إجراءات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لزيادة خصوصية مثل الاستفادة المثلى من كمية القالب، وتركيز التمهيدي، وركوب الدراجات المعلمات. لتحليل PAGE في مقابل الكهربائي الاغاروز معيار كأسلوب الأخير لا يوفر القرار الملائم وحساسية. ويمكن أيضا CEL-I ظروف هضم يكون الأمثل في حال ملاحظة أي منتج هضمها أو تلطيخ المفرطة. ويمكن معاير معايرة كمية سيل-1 / وnuclease أو طول الفترة الزمنية الهضم لتحسين هذه الجوانب.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> Nuclease S (CEL-1 إنزيم) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> توسيع الدقة العالية PCR النظام </td><td> روش </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> خلية الخط Nucleofector كيت الخامس </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP سم داخلي المنشأ خالية البلازميد Maxiprep كيت </td><td> سيغما الدريخ </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

الجينوم التحرير هي تقنية قوية التي يمكن استخدامها لتوضيح وظيفة الجين والأساس الجيني للمرض. الجينات التقليدية أساليب تحرير مثل المواد الكيميائية القائمة على الطفرات أو التكامل عشوائية من تسلسل الحمض النووي تمنح التغييرات الجينية العشوائية بأسلوب غير فعال الشاملة وتتطلب إدراج تسلسل الاصطناعية غير مرغوب فيه أو استخدام الظروف الشاذة ثقافة، يحتمل أن تكون مربكة دراسة بيولوجية. على النقيض من ذلك، يمكن للعابر التعبير ZFN في زنزانة تسهيل دقيق، الموروثة التحرير الجين بطريقة ذات كفاءة عالية دون الحاجة لإدارة المواد الكيميائية أو التكامل من الجينات المحورة الاصطناعية. nucleases إصبع الزنك (ZFNs) هي الانزيمات التي تربط وقطع متواليات متميزة من المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA). وظيفي من وحدة ZFN CompoZr يتكون من البروتينات 2 أحادى الفردية التي تربط الحمض النووي &quot;نصف موقع&quot; ما يقرب من 15-18 النيوكليوتيدات (انظر الشكل 1). عندما اثنين ZFN أحاديةالسائدة &quot;الوطن&quot; على مواقعهم الهدف المتاخمة المجالات الحمض النووي انشقاق dimerize وإنشاء فاصل مزدوج الجديلة (DSB) في الحمض النووي. 1 مقدمة من ZFN بوساطة DSBs في الجينوم يضع أساسا للتحرير الجينوم كفاءة عالية. يمكن إصلاح ناقص من DSBs في خلية عن طريق المنظمات غير المتجانسة في نهاية الانضمام (NHEJ) والحمض النووي مسار الإصلاح يؤدي إلى الإدراج الصغيرة والحذف (indels). ويمكن إنشاء indels ضمن تسلسل الجينات ترميز خلية يؤدي إلى انزياح الإطار، وبالضربة القاضية الفنية لاحق من مكان الجين على كفاءة عالية. 2 في حين أن هذا البروتوكول يصف استخدام ZFNs لخلق بالضربة القاضية جين، والتكامل من الجينات المحورة ويمكن أيضا أن تتم عن طريق تناظر الموجهة إصلاح في موقع قطع ZFN. مخصص CompoZr ZFN الخدمة يمثل نهج منتظم وشامل، وكذلك تتميز إلى تحرير الجينات المستهدفة للأوساط العلمية مع التكنولوجيا ZFN. العلماء سيجما العمل بشكل وثيق مع المحققين إلى 1) perfoRM تحليل العناية الواجبة بما في ذلك تحليل بنية الجينات ذات الصلة، والبيولوجيا، ونظام نموذجي وفقا لأهداف المشروع، 2) تطبيق هذه المعرفة لوضع استراتيجية سليمة تستهدف، 3) ثم تصميم وبناء، والتحقق من صحة وظيفيا ZFNs عن النشاط في ذات الصلة خط خلوي. المحقق يتلقى إيجابي الحمض النووي الجيني السيطرة والاشعال، والجاهزة للاستخدام الكواشف ZFN توفيره في كل من الحمض النووي البلازميد في المختبر وتنسيق مرنا المحولة. قد ثم يتم تسليم هذه الكواشف للتعبير عابر في خط خلية المحقق أو نوع من الخلايا في الاختيار. ثم يتم اختبار عينات لتحرير الجين في موضع الاهتمام من جانب معيار تقنيات البيولوجيا الجزيئية بما في ذلك التضخيم PCR، هضم الأنزيمية، والكهربائي. بعد يتم الكشف عن إشارة إيجابية لتحرير الجين في عدد السكان الأولية، الخلايا وحيدة الخلية المستنسخة ومرمزة لتحديد من الحيوانات المستنسخة طافرة / الأليلات.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs at JoVE.com

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

مخصص CompoZr الزنك فنجر Nuclease (ZFN) خدمة تمكن دقيق التحرير الجينوم في أي كائن حي أو خط خلية في أي مكان محدد من قبل المستخدم. توضح هذه المقالة عملية لتصميم والتحقق من صحة وتصنيع وتنفيذ الخدمة CompoZr ZFN مخصص.

الجينوم التحرير مع مخصص Nucleases CompoZr فنجر الزنك (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

genome-editing-with-compozr-custom-zinc-finger-nucleases-zfns

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.3K Views.  Sigma Life Science. مخصص CompoZr الزنك فنجر Nuclease (ZFN) خدمة تمكن دقيق التحرير الجينوم في أي كائن حي أو خط خلية في أي مكان محدد من قبل المستخدم. توضح هذه المقالة عملية لتصميم والتحقق من صحة وتصنيع وتنفيذ الخدمة CompoZr ZFN مخصص.

Video: Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

إنشاء الجينوم تحريره المحفزة الإنسان خطوط الخلايا الجذعية: من استهداف لعزل

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Developmental Biology

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Genetics

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

تعزيز الجينوم التحرير مع ريبونوكليوبروتين Cas9 في مختلف الخلايا والكائنات الحية

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been harnessed by researchers to study important biologically relevant problems. The unparalleled power of the CRISPR/Cas genome editing method allows researchers to precisely edit any locus of their choosing, thereby facilitating an increased understanding of gene function. Several methods for editing the C. elegans genome by CRISPR/Cas9 have been described previously. Here, we discuss and demonstrate a method which utilizes in vitro assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. Specifically, in this article, we go through the step-by-step process of introducing premature stop codons into the C. elegans rbm-3.2 gene by homology-directed repair using this method of CRISPR/Cas9 editing. This relatively simple editing method can be used to study the function of any gene of interest and allows for the generation of homozygous-edited C. elegans by CRISPR/Cas9 editing&#160;in less than two weeks.

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The goal of this protocol is to enable seamless CRISPR/Cas9 editing of the C. elegans genome using assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. This protocol can be used to make a variety of genetic modifications in C. elegans including insertions, deletions, gene replacements and codon substitutions.

CRISPR/Cas9 تحرير الجين C. elegans rbm-3.2 باستخدام علامة فحص dpy-10 Co-CRISPR ومجمعات ريبونوكليوبروتين المجمعة.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

فحص الحيوانات المنوية للعزل السريع لتعديلات الخط الجرثومي في الزرد

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

تحرير الجينوم الفعال للفئران بواسطة كريسبر التثقيب الكهربائي للزيجوت

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

الماوس الجينوم الهندسية عن طريق Nucleases مصمم

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

الزنك الاصبع نوكلياز المحسن استهداف الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

تحرير قاعدة فعال بدون PAM لنمذجة الزرد للأمراض الوراثية البشرية باستخدام zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Genome Editing

A well-established technique for modifying specific sequences in the genome is gene targeting by homologous recombination, but this method can be laborious and only works in certain organisms. Recent advances have led to the development of &#8220;genome editing&#8221;, which works by inducing double-strand breaks in DNA using engineered nuclease enzymes guided to target genomic sites by either proteins or RNAs that recognize specific sequences. When a cell attempts to repair this damage, mutations can be introduced into the targeted DNA region. In this video, JoVE explains the principles behind genome editing, emphasizing how this technique relates to DNA repair mechanisms. Then, three major genome editing methods&#8212;zinc finger nucleases, TALENs, and the CRISPR-Cas9 system&#8212;are reviewed, followed by a protocol for using CRISPR to create targeted genetic changes in mammalian cells. Finally, we discuss some current research that applies genome editing to alter the genetic material in model organisms or cultured cells.