3D توليد أنسجة عضلة القلب البشرية باستخدام الكتابة الكهربائي الذائب لسقالات بولي كابرولاكتون وخلايا القلب المشتقة من hiPSC

يتم تقديم طريقة قابلة للتكرار لتوليد أنسجة عضلة القلب ثلاثية الأبعاد تجمع بين سقالات بولي كابرولاكتون (PCL) والكتابة الكهربائية الذائبة (MEW) وسقالات بولي كابرولاكتون (PCL) والهيدروجيل الفيبرين مع الخلايا العضلية القلبية والخلايا الليفية المشتقة من hiPSC. توفر هذه التقنية تحكما دقيقا في بنية السقالة ويمكن تطبيقها في اختبار الأدوية قبل السريرية ونمذجة أمراض القلب.

يحمل تطوير أنسجة القلب البشرية الوظيفية وعدا كبيرا بتطوير التطبيقات في فحص الأدوية ونمذجة الأمراض والطب التجديدي. يصف هذا البروتوكول التصنيع التدريجي لأنسجة عضلة القلب ثلاثية الأبعاد مع تقليد متقدم لبنية القلب الأصلية من خلال الجمع بين سقالات بولي كابرولاكتون (PCL) ذات الكتابة الكهربائية الذائبة (MEW) مع الهلاميات المائية الفيبرين والخلايا القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC). تتضمن العملية تضمين مزيج من خلايا عضلة القلب (hiPSC-CMs) والخلايا الليفية القلبية (hiPSC-CFs) داخل مصفوفة الفيبرين لإنشاء أنسجة صغيرة ، مع الدعم الهيكلي الذي توفره السقالات التي تم إنشاؤها بواسطة MEW. يتم تصنيع هذه السقالات الليفية على نطاق الصغر إلى النانو ، مما يسمح بالتحكم الدقيق في بنية الألياف ، والتي تلعب دورا رئيسيا في تنظيم توزيع الخلايا ومحاذاتها. وفي الوقت نفسه ، تعزز مصفوفة الفيبرين بقاء الخلية وتحاكي البيئة خارج الخلية. يكشف توصيف الأنسجة المتولدة عن الأورام القشرية جيدة التنظيم داخل hiPSC-CMs ، إلى جانب نشاط انقباض مستقر. تظهر الأنسجة ضربة عفوية ثابتة في وقت مبكر يصل إلى يومين بعد البذر ، مع وظائف مستدامة بمرور الوقت. يعزز الجمع بين hiPSC-CFs مع hiPSC-CMs السلامة الهيكلية للأنسجة مع دعم بقاء الخلية على المدى الطويل. يوفر هذا النهج طريقة قابلة للتكرار وقابلة للتكيف وقابلة للتطوير لإنشاء نماذج أنسجة القلب المقلدة الحيوية ، مما يوفر منصة متعددة الاستخدامات لاختبار الأدوية قبل السريرية ، والدراسات الميكانيكية لأمراض القلب ، والعلاجات التجديدية المحتملة.

يحمل تصنيع الأنسجة البشرية الوظيفية المصممة بأمراض القلب وعدا كبيرا للتطبيقات عالية التأثير. تمتد هذه من تطوير نمذجة السمية القلبية للأدوية وأمراض القلب البشرية إلى توليد الأنسجة العلاجية ذات الأحجام^{ذات الصلة 1}. على الرغم من أن السنوات ال 15 الماضية شهدت تطورات كبيرة في هذا المجال ، إلا أن تصنيع عضلة القلب البشرية عالية المحاكاة يتم إحباطه حاليا بسبب الصعوبات في إعادة إنتاج التنظيم الهيكلي والميكانيكي المعقد لنظيره الطبيعي².

على الجانب البيولوجي ، فتحت تقنية إعادة برمجة الخلايا الثورية إمكانية تطوير خلايا علاجية خاصة بالمريض. حاليا ، الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) هي المصدر الوحيد لخلايا عضلة القلب البشرية في سياق شخصي. يمكن الحصول على عائد مرتفع من خلايا عضلة القلب باتباع بروتوكولات التمايز القوية^3،4. تتمثل إحدى المشكلات الرئيسية في درجة النضج حيث تعرض خلايا عضلة القلب المشتقة من hiPSC البشرية (hiPSC-CMs) المستخدمة حاليا نمطا ظاهريا غير ناضج في ظل ظروف التمايز ثنائية الأبعاد التقليدية⁵. يرتبط هذا بحقيقة أن التنظيم الهيكلي لأنسجة القلب معقد للغاية ، ويختلف تماما عن الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد. أيضا ، يتكون عضلة القلب من خلايا قلبية وعائية مختلفة ، بما في ذلك الخلايا غير العضلية مثل الخلايا الليفية القلبية ، والعضلات الملساء ، والخلايا البطانية ، مرتبة بشكل منظم من خلال بنية ثلاثية الأبعاد محددة ، مما يسمح بضخ الدم بكفاءة^6،7. وبالتالي ، هناك حاجة إلى أنسجة قلبية بشرية مصغرة عالية التنظيم تتكون من جميع أنواع الخلايا الرئيسية لتوليد أنسجة محاكاة حيوية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية.

يمكن أن يؤدي تطبيق مناهج التصنيع الحيوي الجديدة إلى كسر هذا الجمود. من بين هؤلاء ، الكتابة بالذوبان الكهربائي (MEW) ، وهي تقنية طباعة ثلاثية الأبعاد متقدمة قادرة على توفير دقة ودقة عالية. في MEW ، يتم استخدام مجال كهربائي لترسيب بوليمر منصهر على شكل ألياف في نطاق حجم الخلية ، وهو ترتيب أصغر من الطباعة ثلاثية الأبعاد لنمذجة الترسيب المنصهر التقليدية (FDM) ، مما ينتج عنه هياكل سقالة محددة^{للغاية 8،9}. لقد ثبت أن MEW قادرة على ترجمة مركب في تصميم السيليكو إلى مصفوفة مطبوعة وضبط الخصائص الفيزيائية في 3D لتتناسب مع تلك الموجودة في أنسجة القلب¹⁰. باستخدام تقنية MEW ، من الممكن طباعة شبكات بوليمرية بأشكال وهياكل مختلفة ، جنبا إلى جنب مع الهلاميات المائية الصديقة للخلايا الرخوة ، تولد أنسجة مركبة تحاكي البيئة الميكانيكية الدقيقة والكلية لعضلة القلب الأصلية للبالغين^11،12. لقد ثبت أن تعديل تصميم سقالة MEW 3D يغير الوظيفة الناتجة (عابرات الكالسيوم)¹⁰ ، مما يؤسس للأسباب لفهم العلاقة بين الشكل والوظيفة على هذا النظام الواعد ثلاثي الأبعاد.

هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل لتصنيع الأنسجة القلبية البشرية المصغرة المقلصة من hiPSC-CMs والخلايا الليفية القلبية البشرية المشتقة من iPSC (hiPSC-CFs) وتركيبها داخل هيدروجيل الفيبرين المقوى بهياكل مطبوعة ثلاثية الأبعاد MEW. تم استخدام إضافة الخلايا الليفية على نطاق واسع في أنظمة مختلفة ثلاثية الأبعاد لتعزيز بقاء hiPSC-CMs والحفاظ على بنية الأنسجة ، ولكن لم يتم استكشاف استخدامها في أنظمة 3D-MEW¹³. توفر التكنولوجيا الموضحة هنا منصة متعددة الاستخدامات للباحثين تهدف إلى تطوير نماذج دقيقة لأنسجة القلب مع تطبيقات مثل فهم آليات المرض وعلم السموم قبل السريرية وفحص الأدوية. هذا النموذج مناسب لتقييم السمية القلبية للأدوية الراسخة مثل أنثراسيكلين (على سبيل المثال ، دوكسوروبيسين) ، ومثبطات التيروزين كيناز ، والعلاجات الناشئة مثل الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR-T) ، والتي ارتبطت بخلل وظيفي في القلب¹⁴. علاوة على ذلك ، يحمل النموذج إمكانات كبيرة في تطوير الطب التجديدي من خلال تمكين اختبار المواد الحيوية والأحبار الحيوية والعلاجات القائمة على الخلايا التي تهدف إلى تحسين وظائف القلب واستعادة أنسجة عضلة القلب في حالات مثل احتشاء عضلة القلب.

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. إعداد الوسائط والكائف

1. الطلاء المسبق لألواح زراعة الخلايا
   1. قم بإعداد حصص مخزون Matrigel Growth Factor Reduced (MGFr). قم بإذابة قارورة واحدة من MGFr طوال الليل في الثلاجة على الثلج. في غطاء معقم ، باستخدام أطراف مبردة والحفاظ على المرق والأنابيب على الجليد في جميع الأوقات ، قم بعمل كميات ذات حجم مناسب عن طريق تخفيف المرق 1: 1 في RPMI 1640 L-glutamine البارد (RPMI).
      ملاحظة: بالنسبة لثقافة hiPSC وبذر خلايا عضلة القلب hiPSC (hiPSC-CMs) ، يتم استخدام تخفيفات مختلفة من MGFr. يختلف تخفيف طلاء MGFr ل hiPSCs اعتمادا على خط الخلية المحدد. ومع ذلك ، بمجرد الوصول إلى مرحلة عضلة القلب ، يتم استخدام التخفيف 1:80 بغض النظر عن خط الخلية.
   2. لطلاء ألواح زراعة الخلايا ، قم بإذابة العدد المطلوب من حصص MGFr ببطء على الجليد وتخفيفها بشكل أكبر في RPMI البارد ، 1: 180 لثقافة hiPSC (100 ميكرولتر من MGFr في 9 مل من RPMI) و 1: 80 لإعادة طلاء hiPSC-CMs (100 ميكرولتر من MGFr في 4 مل من RPMI).
      1. أضف MGFr المخفف على الفور بحجم 1 مل لكل بئر لألواح 6 آبار (صيانة hiPSC) و 0.5 مل لكل بئر لألواح 12 بئرا (إعادة طلاء hiPSC-CMs). قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية قبل الاستخدام (حتى أسبوع واحد).
         ملاحظة: يجب تسخين الألواح المطلية ب MGFr عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل بذر الخلايا. قبل طلاء الخلايا ، قم بشفط السائل من اللوحة المطلية ب MGFr.
   3. لزراعة hiPSC-CFs ، قم بتغطية قوارير T75 أو T175 بجيلاتين 0.1٪ لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام ، بحجم 5 مل ل T75 أو 10 مل لقوارير T175. بعد الحضانة ، استنشق السائل قبل بذر الخلايا.
2. وسائط زراعة الخلايا
   1. بالنسبة لثقافة hiPSC ، استخدم Complete Essential 8 Medium (E8 medium) عن طريق إضافة مكمل أساسي 8 (50x) إلى Essential 8 Basal Medium.
   2. لتمايز خلايا عضلة القلب ، قم بإعداد:
      1. RPMI/B27 بدون الأنسولين (-INS متوسط): امزج 500 مل من RPMI و 10 مل من B27 بدون مكملات الأنسولين. RPMI/B27 (متوسط B27): امزج 500 مل من RPMI و 10 مل من مكمل B27.
   3. لتنقية خلايا عضلة القلب (وسط اللاكتات) ، أضف 2 مل من 1 M لاكتات إلى 500 مل من RPMI 1640 الخالي من الجلوكوز. يمكن تخزين الوسط عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   4. لإعادة طلاء خلايا عضلة القلب (إعادة الطلاء المتوسط) ، مكمل وسيط B27 مع 10٪ بدائل مصل بالضربة القاضية (KSR) و 10 ميكرومتر من Y27.
      ملاحظة: KSR عبارة عن تركيبة محددة وخالية من المصل تحل محل FBS في بروتوكولات ثقافة ESC و iPSC.
   5. لتمايز الخلايا الليفية وصيانتها (اليوم 11 فصاعدا) ، قم بإعداد وسط نمو الخلايا الليفية الكامل 3 (FGM3) كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة. أضف عبوة المكملات الغذائية (0.1 مل / مل مصل ربلة الساق الجنينية ، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين البشري المؤتلف ، و 1 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسية ، FGF2) إلى الوسط القاعدي FGM3.
      ملاحظة: لتعزيز تكاثر الخلايا الليفية ، يوصى بزيادة تركيز FGF2 إلى 10 نانوغرام / مل.
   6. لتوليد أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد واستخدام الصيانة ، قم بإعداد:
      1. وسط توليد الأنسجة: مكمل B27 الوسط مع 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S) ، 10٪ KSR و 10 ميكرومتر من Y27. وسط صيانة الأنسجة: تحضير وسط B27 مع 1٪ P / S والأبروتينين (0.1٪ (الوزن / الحجم) ؛ 33 ميكروغرام / مل).
         ملاحظة: يسمح البروتينين بسلامة هلام الفيبرين خلال فترة الزراعة ، مما يمنع تدهوره ويحافظ على الخلايا داخل الهيدروجيل. لذلك ، يوصى بشدة بإضافته إلى الوسط في نفس اليوم الذي يتم فيه إنشاء الأنسجة.
3. حلول مخزون الجزيئات الصغيرة وعامل النمو
   1. CHIR-99021 (CHIR): بالنسبة لمثبط GSK3 ومنشط إشارات Wnt ، قم بإعداد محلول مخزون 10 ملي مولار عن طريق إذابته في DMSO. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      ملاحظة: قد تستجيب خطوط hiPSC لعلاج CHIR بشكل مختلف. قد تكون هناك حاجة إلى تحسين تركيز CHIR. يوصى باختبار 6-10 ميكرومتر CHIR.
   2. C59 ، مثبط Wnt: قم بإعداد محلول مخزون 10 ملي مولار عن طريق إذابته في DMSO. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
   3. Y-27632 ، مثبط ROCK (Y27): قم بإعداد مخزون 10 ملي مولار عن طريق إذابته في DMSO. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر. يعتمد التركيز النهائي على نوع الخلية المستهدفة. استخدم 2 ميكرومتر (1/5000) لمركبات hiPSCs و 10 ميكرومتر (1/1000) ل hiPSC-CMs و hiPSC-CFs وتوليد الأنسجة.
      ملاحظة: يعزز Y27 بقاء الخلية عن طريق قمع موت الخلايا في التعليق أثناء الانفصال. استخدمه عند الحصاد لتجنب الموت المفرط للخلايا.
   4. حمض الريتينويك: قم بإعداد محلول مخزون 30 ملي مولار عن طريق إذابته في الكلوروفورم. قم بتخزين الكميات عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 سنوات.
   5. FGF2 (عامل نمو الخلايا الليفية البشرية المؤتلف ، أيضا FGF-b ، يعزز تكاثر الخلايا الليفية): قم بإعداد محلول مخزون 50 ميكروغرام / مل عن طريق إذابته في ماء معقم. قم بتخزين الكميات عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
   6. SB431542 (SB) ، مثبط إشارات TGFß1: قم بإعداد محلول مخزون 10 ملي مولار عن طريق إذابته في DMSO. قم بتخزين الكميات عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      ملاحظة: أضفه إلى وسط الخلايا الليفية للحفاظ على حالة التليف الكيسي ومنع انتقال الخلايا الليفية العضلية (النمط الظاهري المرضي الذي ينشأ أثناء التليف) في ثقافة ثنائية الأبعاد.
4. حلول مخزون هيدروجيل الفيبرين
   1. الفيبرينوجين: تحضير محلول مخزون 200 مجم / مل. أولا ، قم بطحن كتل الفيبرينوجين إلى مسحوق ناعم باستخدام أدوات معقمة داخل غطاء الخلية. أضف محلول كلوريد الصوديوم الدافئ بنسبة 0.9٪ (بالوزن / الحجم) واحتفظ به عند 37 درجة مئوية حتى يذوب تماما. قم بتخزين الكميات عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام ؛ عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد.
      ملاحظة: نظرا لزوجته عند 4 درجات مئوية ، قم بإذابة الثلج واحتفظ به في RT في وقت ما قبل خطوة تكوين الأنسجة حتى يمكن ماصته بدقة. إذا تعذر سحب الكميات بسهولة عند إعادة استخدامها ، فمن المستحسن التخلص منها واستخدام واحدة جديدة.
   2. الثرومبين: قم بإعداد محلول مخزون 100 وحدة / مل عن طريق إذابة الثرومبين في 60٪ PBS معقم + 40٪ ماء. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      ملاحظة: قبل الاستخدام ، قم بإذابة الثلج واحتفظ به على الثلج حتى تكتمل خطوة تكوين الأنسجة.
   3. البروتينين: تحضير محلول مخزون 33 ملغم/مل عن طريق إذابة البروتينين في ماء معقم (100 مجم من المسحوق في 3.04 مل من الماء). قم بتخزين الكميات عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام.
5. حلول للتحليل
   1. المخزن المؤقت FACS (قياس الخلايا الخلوية): قم بإعداد محلول PBS (خال من Mg²⁺ و Ca²⁺) بالإضافة إلى 2.5 ملي مولار من EDTA و 5٪ (حجم / حجم) FBS.

2. ثقافة iPSC البشرية والمرور

ملاحظة: تم تنفيذ الإجراءات المذكورة هنا مع العديد من خطوط hiPSC ، بما في ذلك UCSFi001-A (ذكر ، هدية لطيفة من البروفيسور بروس كونكلين ، معاهد ديفيد جيه جلادستون) ، ESi044-A (ذكر) ، ESi007-A (أنثى) و ESi044-C (أنثى) و ESi107-A (خط مريض بالإناث من الداء النشواني القلبي) مع تعديلات طفيفة تتعلق بوسط ثقافة hiPSC ، وتخفيف المرور وتركيز CHIR. يحتوي البروتوكول الخاص به على التفاصيل الخاصة باستخدام UCSFi001-A. يتم إجراء جميع حضانات زراعة الخلايا في هذا البروتوكول عند ظروف رطوبة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 96٪.

1. خط ثقافة hiPSC على ألواح 6 آبار مطلية مسبقا 1: 180 MGFr. احتفظ بها على وسط E8 لضمان تعدد القدرات.
   ملاحظة: لمنع التمايز التلقائي ، من الأهمية بمكان تجنب فرط نمو الثقافات. لذلك ، قم بإجراء مرور hiPSC عندما تكون الخلايا ملتقية بنسبة 80٪ -90٪.
2. لمرور الخلية ، قم بشفط الوسط القديم ، واغسل الآبار مرتين باستخدام 1 مل من محلول EDTA 0.5 ملي مخفف في PBS (Mg^{2 +}- و Ca^{2 +} - مجانا) لكل بئر ، واحتضانه لمدة 7 دقائق في EDTA / PBS في RT لتعطيل الالتصاقات بين الخلايا.
3. قم بشفط EDTA / PBS وحصاد الخلايا ، وفصلها عن طريق سحب العينات القوية باستخدام ماصة دقيقة سعة 1000 ميكرولتر مع 1 مل من وسط E8 على سطح البئر حتى يتم فصل الخلايا. اجمعها في أنبوب طرد مركزي معقم.
   ملاحظة: تجنب سحب العينات أكثر من 10-15 مرة ، لأنه سيزيد من وفيات HIPSC.
4. من هذا الحجم ، قم بعمل 1: 15-1: 20 تخفيفات وبذر الخلايا على ألواح 6 آبار مطلية ب MGF في وسط E8 + 2 ميكرومتر من Y27. حافظ على Y27 فقط في أول 24 ساعة بعد البذر لتجنب السمية عن طريق التعرض المفرط.
   ملاحظة: اضبط نسبة الانقسام لخطوط hiPSC الأخرى للحفاظ على الخلايا غير متمايزة وعلى مورفولوجيا صحية لمدة 4-5 أيام.
5. بعد 24 ساعة ، قم بشفط الوسط القديم وأضف درجة حرارة الغرفة الطازجة E8 متوسطة بما يكفي لمدة يومين (عادة 3-4 مل). بعد ذلك ، قم بتغيير الوسيط كل يوم لمدة 3-4 أيام.
   ملاحظة: يعتمد تردد المرور على كل خط خلية. تجنب الوصول إلى 100٪ من التقاء. يجب أن تنمو hiPSCs في مستعمرات كبيرة ومسطحة ومضغوطة ذات هندسة متعددة الأضلاع وحواف ناعمة ونسبة عالية من النواة / السيتوبلازم.

3. تمايز خلايا عضلة القلب البشري

ملاحظة: بالنسبة لتوليد خلايا عضلة القلب من hiPSCs (hiPSC-CMs) ، يعتمد البروتوكول الموصوف على منهجية التمايز أحادية الطبقة التي استخدمها Lian et ^al.3،15 و Burridge et ^al.4. مع الصيانة الكافية ، يمكن تمييز hiPSC على 30 ممر متتالي بكفاءة تمايز عالية. يتم الكشف عن علامات السلوك غير الطبيعي عن طريق التمايز التلقائي أو الفشل المتتالي لأكثر من 4 تمايزات. يوصى بإجراء ضوابط منتظمة ، بما في ذلك اختبار الميكوبلازما.

1. لبدء التمايز القلبي ، قم بحصاد hiPSCs عند التقاء 80٪ -90٪ كما هو موضح في خطوة مرور الخلية أعلاه (الخطوة 2). خلايا البذور في 1: 180 MGFr المغلفة بألواح 12 بئر لضبط التخفيفات المنقسمة لتحقيق طبقات أحادية الخلية المدمجة عند 90٪ من التقاء بعد 48-72 ساعة من البذر. بالنسبة لخط الخلية هذا ، قم بإجراء 1:10 تخفيفات ، وستحقق الخلايا التقاء عند 72 ساعة.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم تعديل التخفيفات حسب الحجم ، وليس حسب عدد الخلايا ، لتجنب التباين المعتمد على المستخدم. إذا لم يتم تحقيق حالة أحادية الطبقة في غضون 72 ساعة بعد الطلاء ، فمن المحتمل جدا ألا تنجح عملية التمايز. في مثل هذه الحالة ، ينصح بتجاهل المحاولة وإعادة التشغيل ، مما يضمن كفاءة المرور المثلى.
2. عندما تستقر الطبقات الأحادية ، تبدأ عملية التمايز ، وتعتبر من الآن فصاعدا في اليوم 0. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسط إلى -INS المكمل ب 8 ميكرومتر من CHIR ، منشط إشارات Wnt ، واحتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية (1 مل لكل بئر).
   ملاحظة: تترات تركيز القمر بين 6-12 ميكرومتر لكل خط iPSC لتحريض الأديم المتوسط بكفاءة. في هذه الخطوة ، من المتوقع حدوث مستوى عال من موت الخلايا ، كعلامة على العملية المثلى.
3. اليوم 1: في اليوم التالي ، قم بشفط الوسط من كل بئر واغسل الخلايا باستخدام RPMI بدون مكملات غذائية (0.5 مل لكل بئر). ثم أضف 1.5 مل من وسط -INS الطازج واحتضان الخلايا لمدة يومين.
   ملاحظة: يتم تنفيذ خطوات الغسيل أثناء جميع تغييرات الوسائط لإزالة الحطام والخلايا الميتة وبقايا المكملات الغذائية.
4. اليوم 3: للحث على مواصفات النسب القلبية ، استبدل الوسط ب 1.5 مل من وسط -INS مكمل ب 5 ميكرومتر من مثبط Wnt C59 لمدة 48 ساعة.
   ملاحظة: هنا ، يتم تشكيل مركب GSK3 ، ويتحلل ß-catenin ، مما يؤدي إلى نسب الأديم المتوسط القلبي. يمكن أيضا ملاحظة بعض موت الخلايا بعد هذه الخطوة.
5. اليوم 5: يغسل وياستبدل بوسط -INS طازج لمدة 48 ساعة بحجم 1.5 مل لكل بئر ، لتعزيز تمدد أسلاف القلب.
6. اليوم 7: من هذا اليوم فصاعدا ، يتم الاحتفاظ بالخلايا في وسط B27 ، مع تغيير الوسائط كل 2-3 أيام.
   ملاحظة: اضبط كميات الوسائط على 2.5 مل لكل بئر لتخطي الوسط المتغير خلال عطلة نهاية الأسبوع ، ولكن بمجرد الوصول إلى هذه الحالة. عادة ، تبدأ hiPSC-CMs في الضرب تلقائيا في الأيام 7-9. أولا ، سيتم ملاحظة الانكماش كمجموعات معزولة وغير منسقة ، ولكن في غضون أيام قليلة ، يجب أن تشكل الثقافات عالية النقاء طبقة أحادية الضرب موحدة.
7. بمجرد الحصول عليها ، تخضع هذه الطبقات الأحادية الانقباضية (عادة في اليوم 10) لعملية اختيار أيضية تتكون من دورتين مدة كل منها 72 ساعة في وسط اللاكتات مفصولة بخطوة إعادة طلاء للقضاء على الخلايا غير عضلة القلب وإثراء نقاء الثقافة.
8. اليوم 10 ، خطوة التنقية الأولى (1^شارع اللاكتات): اغسل الخلايا النابضة بوسط اللاكتات (0.5 مل لكل بئر) واحتضانها ب 1 مل لكل بئر من وسط اللاكتات لمدة 72 ساعة.
   ملاحظة: يجب أن تتم خطوة الغسيل باستخدام وسط اللاكتات أو RPMI 1640 الخالي من الجلوكوز القاعدي لإزالة جميع آثار وسط الجلوكوز السابق (B27) تماما.
9. اليوم 13: اغسل واترك الخلايا تتعافى من جولة التنقية الأولى ب 1.5 مل لكل بئر من وسط B27 لمدة يومين.
10. اليوم 15 (خطوة إعادة الطلاء): بين دورتي التنقية ، قم بفصل الطبقات الأحادية عن طريق الغسيل باستخدام EDTA / PBS واحتضانها باستخدام TrypLE لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية (0.5 مل لكل بئر).
    ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على كل خط خلية.
11. افصل الخلايا باستخدام ماصة دقيقة سعة 1000 ميكرولتر واستعادتها ب 0.5 مل لكل بئر من وسط B27 مكمل بنسبة 10٪ KSR (v / v) في أنبوب طرد مركزي معقم.
    ملاحظة: خلايا عضلة القلب حساسة لإجهاد القص وسحب العينات القوية، لذا حاول تجنب خطوات سحب العينات المتكررة. يمكن أن تكون الخيارات الأخرى لتفكك hiPSC-CM أقل ضررا هي استخدام TrypLE 10x أو الكولاجيناز مع DNase. قم بتحسين وقت الحضانة للتأكد من أنه كاف لانفصال الخلية دون التسبب في تلف الخلايا أو يتطلب سحب ماصات مفرط، مما قد يضر بسلامة الخلية.
12. جهاز طرد مركزي 10 دقائق عند 100 × جم في RT وإعادة تصفيحها في 1: 80 MGFr المغلفة بألواح 12 بئر مع إعادة طلاء متوسطة. بذرها في 1 مل لكل بئر.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى إزالة الخلايا الميتة الزائدة والمصفوفة المترسبة أثناء التمايز ، حيث يمكن أن يكون لها تأثير سلبي لاحقا على توليد الأنسجة.
13. اليوم 16: بعد 24 ساعة من إعادة الطلاء ، قم بإزالة Y27 و KSR واحتفظ بالخلايا في وسط B27 قبل خطوة التنقية التالية (عادة 48-72 ساعة).
14. اليوم 18: خطوة التنقية الثانية (2^{اللاكتات} ). كما في الدورة الأولى ، اغسل الخلايا وحضنها بوسط اللاكتات لمدة 72 ساعة (1 مل لكل بئر).
    ملاحظة: يمكن أن تعزز دورات التنقية نقاء الثقافة بنسبة تصل إلى 30٪ ، كما لوحظ من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي لعلامة عضلة القلب cTNT (تروبونين القلب T) (غير معروض). تقلل هذه العملية في المقام الأول من الخلايا الليفية وتلوث hiPSC المتبقي. على الرغم من عدم تحديد الحد الأدنى لمستوى النقاء المقبول المطلوب للمضي قدما في توليد الأنسجة دون المساس بالمحصول ، فمن المستحسن استخدام مزارع بنقاء لا يقل عن 85٪ -90٪. يدعم هذا المستوى من النقاء تحسين ارتباط خلايا عضلة القلب ، ويعزز قوة الانقباض للأنسجة النهائية ، ويدعم قابلية التكاثر بين التجارب.
15. اليوم الحادي والعشرين: عند اكتمال تنقية اللاكتات ، حافظ على خلايا عضلة القلب المنقاة في وسط B27 حتى استخدامها ، مع تغييرات متكررة في الوسائط (كل 2-3 أيام).
    ملاحظة: سيؤدي التأخير في الاستخدام إلى تقليل إنتاجية الخلية حيث سيكون من الصعب فصلها. وبالتالي ، ينصح باستخدامها بين اليوم الذي يتم فيه الانتهاء من تنقية اللاكتات الثانية وأقل من أسبوع إضافي.

4. تمايز الخلايا الليفية القلبية البشرية

ملاحظة: للحصول على الخلايا الليفية القلبية البشرية (hiPSC-CFs) من hiPSCs ، يعتمد البروتوكول التالي على المنهجية المكونة من مرحلتين التي استخدمها Zhang et ^al.16. تتمثل الخطوة الأولى في الحصول على الخلايا النخابية (hiPSC-EpiCs) عن طريق إعادة تنشيط مسار إشارات Wnt بعد تحريض الأديم المتوسط القلبي. بعد ذلك ، تتعرض hiPSC-EpiCs لمثبطات نمو الأوعية الدموية و FGF2 للحصول على الخلايا الليفية القلبية في 18 يوما.

1. ضمان صيانة hiPSC والحصاد وكثافة البذر كما هو موضح في بروتوكول تمايز hiPSC-CMs. استزراع hiPSCs على ألواح 12 بئر مطلية ب 1: 180 MGFr لبدء التمايز.
2. عند تحقيق طبقات أحادية الضغطة hiPSC (اليوم 0) ، أضف وسط -INS مكملا ب 5 ميكرومتر من CHIR (1.5 مل لكل بئر) لمدة 48 ساعة.
   ملاحظة: معايرة تركيز CHIR لكل خط hiPSC لتحريض الأديم المتوسط بكفاءة.
3. اليوم 2: استنشق الوسط وتخلص منه ، واغسل الخلايا باستخدام RPMI ، واستبدله ب 1.5 مل من وسط -INS الطازج لمدة 24 ساعة.
   ملاحظة: كما هو الحال في بروتوكول hiPSC-CMs ، اشطف الخلايا أثناء أي تغيير للوسائط ؛ اعتمادا على كل خطوة ، استخدم الوسط القاعدي غير المكملة المقابل.
4. اليوم 3: احتضان الخلايا مع وسط -INS يحتوي على 5 ميكرومتر من C59 (مثبط Wnt) لمدة 48 ساعة (1.5 مل لكل بئر).
5. اليوم 5: لإعادة طلاء خلايا الأديم المتوسط القلبية ، افصل الخلايا عن طريق الغسيل باستخدام EDTA / PBS واحتضانها باستخدام TrypLE لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية (0.5 مل لكل بئر). اجمع الخلايا في 0.5 مل لكل بئر من الوسط القاعدي Advance DMEM (ADMEM) وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم في RT.
6. قم بزرعها في 1: 180 MGFr مطلية مسبقا بألواح 12 بئرا (1 مل لكل بئر) بكثافة 20,000 خلية / سم². لإعادة الطلاء ، استخدم ADMEM مكملا ب 5 ميكرومتر من CHIR ، و 2 ميكرومتر من حمض الريتينويك ، و 10٪ KSR (v / v) ، و 10 ميكرومتر من Y27.
7. اليوم 6: بعد 24 ساعة من إعادة الطلاء ، قم بتحديث الوسط لإزالة Y27 وتقليل KSR إلى 2٪. الحفاظ على نفس تركيزات CHIR وحمض الريتينويك لمدة 48 ساعة أخرى لتحقيق تطوير النمط الظاهري للنخابي.
8. اليوم 8: خلايا مزرعة مع ADMEM مكملة بالإضافة إلى 2٪ من KSR لمدة 72 ساعة لتعزيز توليد طبقات وحيدة النخابي.
   ملاحظة: يبدو أن hiPSC-EpiCs عبارة عن خلايا كبيرة مسطحة أو مكعبة الشكل مجمعة في مستعمرات مفردة. في هذه المرحلة الزمنية ، عند إجراء الجولات الأولى من التمايز ، يمكن تحليل علامات الخلايا النخابية النموذجية مثل WT1 (مستضد نووي) و ZO1 (مستضد الغشاء السيتوبلازمي) و TCF21 (مستضد السيتوبلازمي) بواسطة FACS (قياس الخلايا المتدفقة) أو IF (تلطيخ التألق المناعي) (غير معروض).
9. اليوم 11: لإعادة طلاء الخلايا النخابية ، قم بفصل غسل hiPSC-EpiCs باستخدام EDTA / PBS واحتضانه باستخدام TrypLE لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية (0.5 مل لكل بئر). اجمع الخلايا في وسط FGM3 (0.5 مل لكل بئر) وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم عند RT.
10. أعد طلاء hiPSC-EpiCs في ألواح 12 بئرا مطلية بالجيلاتين بنسبة 0.1٪ بكثافة خلية تبلغ 10,000 خلية / سم². استخدم وسيط FGM3 مكملا ب 10 ميكرومتر من SB (مثبط إشارات TGFß1 لتجنب انتقال الخلايا الليفية العضلية ، عادة أثناء الزراعة على البلاستيك) و 10 ميكرومتر من Y27 (فقط لأول 24 ساعة).
11. في اليوم التالي ، قم بتحديث وسط الخلايا الليفية (FGM3 + 10 ميكرومتر من SB) كل يومين حتى يتم الحصول على hiPSC-CFs ، مما يجعل المجموع حوالي 18 يوما للعملية برمتها.
    ملاحظة: يجب أن تقدم hiPSC-CFs مورفولوجيا على شكل مغزل. هنا ، يجب تحليل التعبير عن علامة الخلايا الليفية DDR2 بواسطة تقنيات FACS و IF (انظر الخطوات 7.1-7.2).
12. بمجرد أن تتلاقى ثقافة hiPSC-CFs ، قم بإجراء ممرات خلوية 1: 3 في قوارير T75 أو T175 المطلية مسبقا بالجيلاتين. تصل الخلايا إلى 90٪ التقاء في 4-6 أيام تقريبا. لفصل hiPSC-CFs ، استخدم بروتوكول حصاد TrypLE الموصوف لإعادة طلاء hiPSC-EpiCs ؛ هنا ، Y27 غير مطلوب للمرور.
13. حافظ على hiPSC-CFs في FGM3 المتوسط + 10 ميكرومتر من SB حتى استخدامها أو قم بتجميدها عند مرور منخفض بكثافة خلية تبلغ 1-3 ملايين خلية لكل أنبوب تبريد.
    ملاحظة: يوصى بالحفاظ على hiPSC-CFs لمدة أقصاها 6 ممرات قبل إذابة الخلايا الجديدة ، كما هو الحال عند زراعتها في قوارير بلاستيكية على المدى الطويل ، تبدأ الخلايا في التمايز إلى نمط ظاهري للأرومات الليفية العضلية أكثر انقباضا.

5. تصنيع سقالات الكتابة بالذوبان الكهربائي (MEW)

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول بوليمر متجانس بولي ε-كابرولاكتون (PCL) من الدرجة الطبية لطباعة السقالات الليفية ، باستخدام طابعة MEW مصممة خصيصا لهذا الغرض من قبل جامعة كوينزلاند للتكنولوجيا¹⁰.

1. قم بإعداد مخزون بوليمر PCL للطباعة. اشحن حبيبات PCL في حقنة بلاستيكية سعة 3 مل متصلة بإبرة 23 جم وقم بإذابتها عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين في الفرن ، مع الضغط برفق على المكبس لإزالة أي فقاعات أثناء ذوبان البوليمر. قم بإعداد عدة محاقن وتخزينها في RT ، حيث يتجمد PCL بسرعة.
2. في يوم الطباعة ، أدخل المحقنة داخل غرفة التسخين وقم بتوصيلها بأنبوب إمداد N₂ مضغوط. قم بتشغيل معدات MEW ، واضبط منظمات درجة الحرارة على 80/65 درجة مئوية (الغرفة / الفوهة) ، واحتفظ بالمحقنة لمدة 30 دقيقة لضمان الذوبان المناسب للبوليمر.
3. أسفل المحقنة ، توجد لوحة التجميع ، الآلية والمتحركة في اتجاهات XY بواسطة برنامج متوافق (Mach3). حرك لوحة التجميع (التحكم في مؤشرات الكمبيوتر) حتى يتم وضع رأس الطباعة على إحدى حواف اللوحة أو في أي مكان مرغوب فيه ، واضبط المسافة بين غرفة التسخين ولوحة التجميع (مسافة المجمع) يدويا إلى 10 مم (المستوى Z).
   ملاحظة: يجب اختبار هذه المسافة تجريبيا للوصول إلى قطر ألياف معين. كلما كانت مسافة المجمع أقصر ، زادت سماكة الألياف ، والعكس صحيح.
4. أغلق باب الجهاز الذي يربط تلقائيا إمداد المجال الكهربائي. اضبط الجهد على 7 كيلو فولت وضغط N₂ عند 2 بار حتى يتمكن من البثق عبر طرف 23 جيجا عند الطباعة.
   ملاحظة: من خلال توفير جهد عال ، يتم إنشاء فرق جهد بين طرف المحقنة ولوحة التجميع (مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ). بعد ذلك ، يصبح الانخفاض المتراكم في الفوهة بواسطة الضغط المزود مشحونا إلكتروستاتيكيا ، مما يولد مخروط تايلور ، الذي يتحرك نحو لوحة التجميع. يمكن ضبط الجهد والضغط لتعديل أبعاد الألياف النهائية. ستعمل معلمات الضغط العالي على بثق الألياف السميكة ، مما يتطلب زيادة الجهد لتثبيت الألياف. يعتمد البرنامج على التحكم العددي بالكمبيوتر (CNC) ، لذلك تتم كتابة أشكال هندسة السقالات كرمز G ويتم إدخالها إلى البرنامج ، الذي يتحكم في حركة XY وسرعة محرك لوحة المجمع. لذلك ، قبل طباعة السقالات النهائية ، يوصى بطباعة أي رمز G كخطوة سابقة للحصول على نفاثة مستقرة تبني أليافا محددة دون أي مظهر لف أو جلد. لذلك ، قم بتحسين المعلمات عن طريق تغييرات صغيرة في كل مرة ، أي 0.1 بار لضغط الهواء ، و 0.1 كيلو فولت للجهد ، و 60-100 مم / دقيقة لسرعة المجمع ؛ سيضمن ذلك سلوك تايلور المخروطي للطائرة.
5. حدد رمز G المصمم في البرنامج لطباعة السقالات بهندسة نمط مربع. يطبع رمز G هذا مثالا شبكات مربعة من 15 طبقة بحجم 6 سم × 6 سم بمسام مربعة الشكل 0.5 مم × 0.5 مم.
6. لطباعة الألياف المودعة بدقة (أي الألياف المتداخلة) ، اضبط سرعة المجمع على 1080 مم / دقيقة.
   ملاحظة: اضبط الجهد والضغط وسرعة المجمع ومعلمات مسافة المجمع على كل جهاز MEW لتحديد أقطار الألياف الدقيقة (μm). بالإضافة إلى تأثير المعلمات المذكورة سابقا ، تؤدي زيادة سرعة المجمع إلى ألياف أرق ، بينما ينتج عن تقليلها ألياف أكثر سمكا. تتيح إعدادات المعلمات في هذا البروتوكول طباعة ألياف بأقطار 10-15 ميكرون.
7. اضغط على زر START في البرنامج لبدء الطباعة. قم بإزالة السقالة بعناية من المجمع بعد الانتهاء من الطباعة.
   ملاحظة: لتسهيل التعامل مع السقالة بعد الطباعة ، يوصى بطباعتها على قطعة زجاجية أكبر من السقالة ، مثبتة على قاعدة المجمع بشريط لاصق.
8. قم بقص الشبكة المطبوعة بكمة قطرها 6 مم للحصول على السقالات النهائية لتصنيع الأنسجة.
9. نظرا لأن شبكات PCL شديدة الكارهة للماء ، فقم بمعالجتها لمدة 5 دقائق باستخدام بلازما O₂ / Argon لزيادة محبة الماء وتعزيز التفاعل مع الفيبرين والخلايا.
   ملاحظة: اختياريا ، يعمل أيضا علاج 0.1 نيوتن من هيدروكسيد الصوديوم لمدة 15 دقيقة ، متبوعا بغسالات PBS مكثفة.
10. قم بتعقيم الشبكات عن طريق الغمر في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة ، واغسلها على نطاق واسع بالماء المقطر المعقم لمدة 30 دقيقة ، واتركها حتى تجف.
    ملاحظة: قم بهذه العملية في طبق بتري معقم وداخل غطاء معقم. لا تجفف الشبكات تماما حتى يتم استخدامها لتجنب التصاقها باللوحة وما يترتب على ذلك من تشوه.

6. توليد وصيانة أنسجة الفيبرين المصغرة

ملاحظة: يعتمد توليد الأنسجة المصغرة ثلاثية الأبعاد لعضلة القلب البشرية على تغليف خلايا القلب المشتقة من hiPSC داخل الهلاميات المائية الفيبرينية جنبا إلى جنب مع سقالات MEW التي توفر الدعم الليفي. تم تكييف البروتوكول التالي من مناهج التصميم الهندسي التي استخدمها Breckwoldt et ^al.17 و Ronaldson-Bouchard et ^al.18.

1. افصل hiPSC-CMs كما هو موضح أعلاه في خطوة إعادة الطلاء (3.10-3.11) لبروتوكول تمايز hiPSC-CMs (حصاد TrypLE). أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط توليد الأنسجة لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
2. افصل hiPSC-CFs كما هو الحال في خطوة حصاد hiPSC-CMs باستخدام TrypLE. استخدم 3 مل من TrypLE ل T75 ، و 5 مل لقوارير T175 ، ونفس الحجم لتعطيل حضانة TrypLE. أخيرا ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط توليد الأنسجة ، كما هو الحال بالنسبة ل CMs ، حيث سيتم خلطها وزراعتها في نفس الوسائط.
3. عد الخلايا في غرفة نيوباور. احسب العدد الإجمالي الدقيق للخلايا اللازمة لزرع جميع الأنسجة.
   ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول 1 مليون خلية لكل نسيج ، تتكون من 80٪ CMs و 20٪ CFs ، أي 800,000 سم و 200,000 CFs. يمكن أيضا تحقيق كميات أخرى ، مثل إجمالي 1.5 و 3 ملايين لكل نسيج ، من خلال الممارسة.
4. امزج وحبيبات الخلايا الكلية المطلوبة في أنبوب جديد (مزيج الخلية) ، 5 دقائق عند 300 × جم في RT. تأكد من أن الحبيبات جافة تماما واحتفظ بها على الجليد حتى البذر. احسب الحجم الإجمالي للهيدروجيل المطلوب لبذر جميع الأنسجة.
   ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول 35 ميكرولتر لكل نسيج (لحجم سقالة يبلغ قطره 6 مم) إلى كثافة نهائية قريبة من 30 مليون خلية / مل ، ولكن يمكن زيادتها ، كما هو مذكور سابقا في الخطوة 6.4 أعلاه. يتكون كل هيدروجيل من الفيبرين من 6 مجم / مل من الفيبرينوجين بالإضافة إلى 5 وحدة / مل من الثرومبين جنبا إلى جنب مع وسط توليد الأنسجة ، حيث يتم تعليق الخلايا. بالنسبة لهيدروجيل 35 ميكرولتر ، تكون نسبة الفيبرينوجين / الثرومبين 1.05 ميكرولتر / 1.8 ميكرولتر. يوصى بحجم نهائي إضافي بنسبة 10٪ من الهيدروجيل لتجنب فقدان الحجم بسبب أخطاء سحب العينات. مثال: بالنسبة ل 10 أنسجة ، أعد تعليق الخلايا في 350 ميكرولتر + 10٪ ، أي 385 ميكرولتر كحجم نهائي إجمالي.
5. أعد تعليق مزيج الخلايا في الحجم المطلوب من وسط توليد الأنسجة. تخلط بعناية ، وتجنب تكوين الفقاعات.
   ملاحظة: بالنسبة ل 10 أنسجة ، أعد تعليق 10 ملايين خلية (80 سم: 20 CFs) في 374.5 ميكرولتر من وسط توليد الأنسجة (الحجم الإجمالي للهيدروجيلات مطروحا منه الكمية الإجمالية للفيبرينوجين المطلوبة لإجمالي الأنسجة ، أي 10.5 ميكرولتر).
6. أضف الحجم المطلوب من الفيبرينوجين واخلطه بعناية. بالنسبة ل 10 أنسجة ، أضف 10.5 ميكرولتر من الفيبرينوجين إلى مزيج الخلية ، مما ينتج عنه مزيج الهيدروجيل. احتفظ بها في RT.
   ملاحظة: من الضروري تجنب سحب العينات المتكرر بشكل مفرط حتى لا تؤثر قوى القص على قابلية بقاء hiPSC-CMs. يوصى بقطع قطعة من طرف طرف الماصة بمشرط معقم ثم إعادة تعليق مزيج الهيدروجيل معها لتقليل تلف القص.
7. لتجنب التصاق الفيبرين باللوحة ، قم بخلط هيدروجيل البذور في سطح بولي تترافلورو إيثيلين (PTFE). الماصة نصف حجم الأنسجة (17.5 ميكرولتر) ، والتي ستبقى كقطرة ، وتفعل ذلك للعدد الإجمالي للأنسجة.
   ملاحظة: لا تصنع أكثر من 10 مناديل في المرة الواحدة ، لأنها يمكن أن تجف.
8. ضع سقالة PCL فوق كل قطرة وأضف الحجم المتبقي (17.5 ميكرولتر). تأكد من أن السقالة مغمورة تماما.
   ملاحظة: كن مستعدا لسحب العينة بكلتا يديك ، لأن التفاعل سريع جدا. نسيج واحد في كل مرة.
9. أضف الكمية المطلوبة من الثرومبين (1.8 ميكرولتر) بيدك غير المهيمنة واخلط الهيدروجيل بسرعة باليد المهيمنة (سحب العينة 2-3 مرات على الأقل).
   ملاحظة: يفضل الخلط عن طريق سحب العينة أقل من الحجم الإجمالي ، لتجنب تكوين الفقاعات (30 ميكرولتر). إذا تشكلت فقاعة هواء ، فقم بوخزها بسرعة بإبرة.
10. كرر الخطوة السابقة لكل نسيج.
    ملاحظة: ينصح بممارسة هذه التقنية بدون خلايا حتى يتم ضمان التعامل الجيد.
11. احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لإكمال بلمرة الفيبرين.
12. التقط كل منديل برفق من الحافة باستخدام ملاقط معقمة وضعه في 12 بئرا مع 2 مل لكل بئر من وسط توليد الأنسجة مع 33 ميكروغرام / مل من البروتينين. ضع منديلا واحدا في كل بئر.
    ملاحظة: لا تلتقطها من مركز الهيدروجيل حتى تتلف الخلايا بالقوة الميكانيكية. إذا لزم الأمر ، استخدم ملعقة.
13. احتضان الأنسجة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان الحفاظ على البروتينين في وسط زراعة الأنسجة من يوم الجيل فصاعدا ، حيث لوحظ أن حذف البروتينين خلال أول 24 ساعة ، حتى لو تمت إضافته لاحقا ، يؤدي إلى انفصال جزئي للخلايا عن الشبكة والهيدروجيل. هذا يضر بتغطية الخلية الكاملة اللازمة لسلامة الأنسجة النهائية.
14. في اليوم التالي ، قم بتحديث الوسط ب 2 مل من وسط صيانة الأنسجة ، وإزالة بقايا KSR و Y27. قم بتغيير الوسيط كل يومين من هناك فصاعدا.

7. التحليل المنهجي لإمكانات التمايز القلبي لوظائف الأنسجة المصغرة وسرطان الدم المصغر

1. تحليل قياس التدفق الخلوي
   ملاحظة: يتم تحليل الخلايا باستخدام طريقة القياس الخلوي "فرز الخلايا المنشط بالفلورة" (FACS) لتحديد كفاءة تمايز hiPSC. يتم تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف درجة حرارة الغرفة.
   1. قم بفصل مزارع الخلايا إلى معلق أحادي الخلية (حصاد TrypLE) ، كل من hiPSC-CMs و CFs بشكل منفصل.
   2. أعد تعليق الحبيبات عند 250,000 خلية/مل في المخزن المؤقت FACS وتوزيع ما لا يقل عن 1 مل لكل أنبوب. احتضن لمدة 30 دقيقة لتجنب ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.
   3. خلايا الطرد المركزي عند 300 × جم عند RT لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي في ظل هذه الظروف.
   4. للكشف عن المستضدات داخل الخلايا ، قم بإصلاح أغشية الخلايا وتنفذها باستخدام مجموعة نفاذية الخلايا. أولا ، احتضان الخلايا باستخدام Reactive A (Fix) لمدة 30 دقيقة وجهاز الطرد المركزي (كما في الخطوة 7.1.3).
   5. بعد ذلك ، احتضان الخلايا ب التفاعلي (بيرم) بالإضافة إلى الجسم المضاد الأساسي لمدة 30 دقيقة. استخدم 100 ميكرولتر من المتفاعل لكل أنبوب.
      1. بالنسبة إلى hiPSC-CMs ، استخدم الجسم المضاد cTNT للفأر (تروبونين T القلبي ، علامة CM) عند تخفيف 1/200. بالنسبة لمركبات hiPSC-CFs ، استخدم الجسم المضاد DDR2 للفأر (مستقبلات الكولاجين ، علامة التليف الكيسي) عند تخفيف 1/500.
         ملاحظة: لإيقاف جميع التفاعلات ، أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب قبل الطرد المركزي.
   6. احتضن لمدة 15 دقيقة باستخدام الجسم المضاد الثانوي Alexa-Fluor 488 المضاد للفأر المخفف 1/100 في المخزن المؤقت FACS.
   7. اغسل 3 مرات باستخدام PBS ، والطرد المركزي بين الغسلات (باتباع نفس الشروط كما في الخطوة 7.1.3) ، وأخيرا أعد تعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من PBS. التحليل في مقياس الخلوي أو جهاز مشابه.
2. تحليل تلطيخ التألق المناعي (IF)
   1. بالنسبة لثقافات خلايا القلب ثنائية الأبعاد ، قم بزرع كلا النوعين من الخلايا بشكل منفصل على نظام غرفة الثقافة القائم على الشريحة 1: 80 MGFr أو 0.1٪ الجيلاتين المطلي مسبقا. لوحة ما يقرب من 80,000 خلية / سم² للوصول إلى ما يكفي من التقاء الخلايا للتحليل. بالنسبة للأنسجة المصغرة ثلاثية الأبعاد ، انقلها برفق باستخدام ملاقط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.
   2. تخلص من وسط الخلية واغسل الخلايا أو الأنسجة باستخدام PBS مرتين. إصلاح العينات مع 10٪ الفورمالين (v / v) في RT ؛ 15 دقيقة لغرفة الانزلاق و 1 ساعة للأنسجة الصغيرة.
      تنبيه: الفورمالين خطير إذا تم استنشاقه ويجب التعامل معه في غطاء الدخان.
   3. تخلص من المخزن المؤقت للتثبيت واغسله لمدة 5 دقائق باستخدام PBS ثلاث مرات. قم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية في PBS حتى استخدامها.
   4. لاختراق غشاء الخلية ، احتضان الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X-100 (v / v) لمدة 10 دقائق أو أنسجة ثلاثية الأبعاد مع 1٪ Tween-20 لمدة 15 دقيقة في RT. ثم اغسل 5 دقائق باستخدام PBS ثلاث مرات.
   5. لتقليل روابط الأجسام المضادة غير المحددة ، عالج العينات بمحلول ألبومين مصل الأبقار (BSA) بنسبة 3٪ (v / v) لمدة 30 دقيقة في RT.
   6. قم بإعداد محاليل الأجسام المضادة الأولية في PBS بالإضافة إلى 1٪ BSA لمنع الروابط غير المحددة واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      1. بالنسبة إلى 2D hiPSC-CMs ، استخدم 1/400 تخفيف من الجسم المضاد للفأر المضاد للقلب α-ACTN (الأكتينين السارمي). بالنسبة إلى 2D hiPSC-CFs ، استخدم تخفيف 1/500 من الجسم المضاد للماوس المضاد ل DDR2. بالنسبة للأنسجة ثلاثية الأبعاد ، اجمع بين الأجسام المضادة الخاصة ب CM و CF.
   7. في اليوم التالي ، قم بشفط محلول الأجسام المضادة وقم بإجراء 3 غسلات باستخدام PBS عند RT ، 5 دقائق لكل منها.
   8. خفف الأجسام المضادة الثانوية (Alexa-Fluor 488 و Alexa-Fluor 594) عند 1/200 واحتضانها لمدة ساعة واحدة في RT في الظلام لتحديد الأجسام المضادة الأولية للفئران والأرانب ، على التوالي. كرر غسل PBS ثلاث مرات.
   9. لمواجهة تلطيخ النوى ، احتضان العينات بتخفيف 1/500 من 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام. كرر غسل PBS ثلاث مرات وقم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية في PBS.
   10. فحص العينات باستخدام مجهر متحد البؤر ، والحصول على الصور ، ومعالجتها باستخدام برامج مناسبة مثل فيجي.
   11. بالنسبة للأنسجة المصغرة ثلاثية الأبعاد ، انقلها بعناية باستخدام PBS بين أغطية زجاجية للسماح بتصوير جيد.
       ملاحظة: يوصى بالغمر بالزيت بمقدار 40 ضعفا أو هدف أعلى للحصول على صور Z-stack بدقة عالية.
3. تحليل بقاء الخلية
   ملاحظة: يستخدم اختبار Alamar Blue (AB) لقياس نشاط التمثيل الغذائي للخلايا ، والذي يرتبط ارتباطا مباشرا بصلاحية الخلية في أنسجة القلب المصغرة ثلاثية الأبعاد. قم بتنفيذ العملية بأكملها لحماية العينات من الضوء وفي ظل ظروف معقمة.
   1. قم بإعداد محلول AB بنسبة 10٪ (حجم / حجم) في وسط RPMI 1640 بدون أحمر الفينول (لأنه قد يتداخل مع قياس اللون).
   2. انقل أنسجة القلب الصغيرة بعناية إلى صفيحة 48 بئرا باستخدام ملاقط معقمة. احتضان التركيبات مع 300 ميكرولتر من محلول AB لكل نسيج لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة (ضبط الوقت تجريبيا) عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: نظرا لأن الخلايا تقلل من الريزازورين من خلال عمل الإنزيمات الأيضية ، سيتم إنشاء تغيير في اللون في وسط الثقافة ، والذي سيتم قياسه عن طريق قياس الطيف الضوئي عند 570 نانومتر و 600 نانومتر.
   3. للقياس ، اجمع 100 ميكرولتر لكل نسيج من محلول AB المستقبر في صفيحة 96 بئرا واقرأ الامتصاص.
      ملاحظة: يمكن زراعة العينات بعد هذا التحليل عن طريق تغيير الوسيط إلى وسط صيانة الأنسجة مرة أخرى.
4. تحليل الانكماش
   ملاحظة: تبدأ أنسجة القلب المصغرة في الضرب تلقائيا ، عادة بعد 1-2 أيام من تكوين الأنسجة.
   1. قم بقياس تردد الضرب يدويا من خلال مراقبة الأنسجة تحت المجهر البصري (نبضات / دقيقة). إذا تم قياس العديد من الأنسجة في نفس الوقت ، فاحتفظ بالصفائح دافئة قبل كل قراءة.
      ملاحظة: مع انخفاض درجة الحرارة ، يبدأ معدل الضرب أيضا في الانخفاض.
   2. لتقييم انقباض القلب الموسع ، احصل على مقاطع فيديو مجهرية بصرية للأنسجة النابضة. عند 4x لالتقاط مستوى أكبر أو 10x من مناطق الأنسجة المختلفة. سجل حوالي 30 ثانية لكل فيديو (3 نبقات على الأقل).
   3. استخدم معدل إطارات لا يقل عن 30 إطارا / ثانية واحفظ الفيديو بتنسيق .AVI.
      ملاحظة: هنا ، تم تحليل مقاطع الفيديو باستخدام خوارزمية نقطة تتبع مخصصة تم تطويرها ل MATLAB¹⁰. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحصول على سرعة الانكماش والإزاحة القصوى للانكماش (السعة) واتجاه الانكماش لكل فيديو.
   4. قم بتشغيل الخوارزمية مباشرة في MATLAB لمقاطع الفيديو الموجودة في مجلد التحليل. سيوفر تلقائيا مستند Excel النتائج بقيم سرعة الانكماش لكل إطار ، وسعة الانكماش لكل إطار ، وزاوية الانكماش (الاتجاه) ، والانحرافات المعيارية الخاصة^{به 10}.
   5. اضرب "سرعة الانكماش لكل إطار" في دقة الكاميرا (ميكرومتر/بكسل) ومعدل إطارات الكاميرا (الإطارات/ثانية). سيعطي هذا القيمة النهائية لسرعة الانكماش (ميكرومتر / ثانية).
   6. اضرب "سعة الانكماش لكل إطار" في دقة الكاميرا (ميكرومتر / بكسل) ، وهذا سيعطي القيمة النهائية لسعة الانكماش (ميكرومتر).
      ملاحظة: سيكون من الممكن تحليل حركية الانكماش بمزيد من العمق باستخدام برامج مثل MUSCLEMOTION ، كما تمت مناقشته في مكان آخر^19،20. يجب أن يلتقط إعداد التصوير ما لا يقل عن 60 إطارا/ثانية لتحليلها باستخدام البرنامج.

توصيف خلايا القلب المشتقة من hiPSC ثنائية الأبعاد
من أجل توليد أنسجة قلبية متعددة الأنماط ، يتم تمييز hiPSC-CMs و hiPSC-CFs بشكل مستقل وتمييزها في المختبر. مع التحسين المناسب والصيانة الصارمة ، سيؤدي البروتوكول التالي إلى عائد hiPSC-CMs يزيد عن 80٪ في اليوم التاسع من التمايز ، مما يؤدي إلى ظهور خلايا نابضة تلقائية (الشكل 1 أ). علاوة على ذلك ، فإن إثراء النقاء عن طريق الانتقاء الأيضي يزيل إلى حد كبير غير hiPSC-CMs ، مما يؤدي إلى ثقافات تتكون من أكثر من 90٪ من الخلايا التي تعبر عن بروتين التروبونين القلبي (cTNT ⁺) في اليوم 21 (الشكل 1 ب). تظهر هذه الطبقات الأحادية القوية للضرب تعبيرا عن بروتين الأكتينين الساركميري المقلص (ACTN) عن طريق تلطيخ IF (الشكل 1 ج ، د).

على الجانب الآخر ، يعتمد نجاح هذا البروتوكول على توليد الخلايا الليفية الخاصة بالقلب من خلال تحريض حالة النخابية الوسيطة. هنا ، بعد إعادة تنشيط إشارات Wnt بواسطة CHIR ، يتم الحصول على الخلايا النخابية في اليوم 8 من أسلاف الأديم المتوسط القلبي (الشكل 2 أ). هذه hiPSC-EpiCs عبارة عن خلايا كبيرة مجمعة في مستعمرات مفردة ، عند إعادة الطلاء بوسط الخلايا الليفية ، تؤدي إلى ظهور خلايا الخلايا الليفية القلبية ذات التشكل على شكل مغزل (الشكل 2 ج). وبالتالي ، بعد 18 يوما إجماليا من التمايز ، تقدم hiPSC-CFs أكثر من 90٪ تعبير عن DDR2 عن طريق تحليل FACS (الشكل 2 ب). يمكن ملاحظة مستقبل الكولاجين هذا ، الذي يتميز بأنه علامة CF ، أيضا من خلال تلطيخ IF (الشكل 2 د).

الشكل 1: الجدول الزمني للتمايز بين hiPSC-CMs وتوصيف التألق المناعي وقياس التدفق الخلوي. (أ) المخطط العام لتمايز CMs المشتقة من hiPSCs وخطوات التنقية. (ب) قياس التدفق الخلوي لنقاء hiPSC-CMs (النسبة المئوية لخلايا cTNT ⁺ ) في اليوم 21. (ج) صورة تباين المرحلة التمثيلية للخلايا بعد خطوات التنقية (اليوم 21). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (د) صورة متحدة البؤر لمركبات hiPSC-CMs المتمايزة تماما الملطخة ب ACTN (أخضر) والنوى الملطخة ب DAPI (الأزرق). شريط المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: الجدول الزمني للتمايز بين hiPSC-CFs وتوصيف التألق المناعي وقياس التدفق الخلوي. (أ) المخطط العام لتمايز التليف المزمن المشتق من الخلايا النخابية المائية المائية ب PSC. (ب) قياس التدفق الخلوي لنقاء hiPSC-CFs (النسبة المئوية لخلايا DDR2 ⁺ ) في اليوم 18 وصورة تباين الطور التمثيلي للثقافة (C) ؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (د) صورة متحدة البؤر ل hiPSC-CFs ملطخة ب DDR2 (أخضر) والنوى الملطخة ب DAPI (الأزرق). شريط المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

توليد سقالات PCL من MEW
يتم تحديد الخواص الميكانيكية للسقالات من خلال العدد الإجمالي للطبقات وكثافة الألياف والقطر والتوزيع وهندسة المسام. هذه جوانب أساسية يمكن أن تؤثر بشدة على سلوك الخلية. بمجرد إنشائها ، تم إعداد المعدات (الشكل 3 أ) واتباع إعدادات الطباعة الموضحة في هذا البروتوكول (7 كيلو فولت ، مسافة المجمع 10 مم ، 2 بار ، 80/65 درجة مئوية الرأس / الفوهة ، سرعة المجمع 1080 مم / ثانية وطرف المحقنة 23 جيجا) ، تم إنشاء سقالات مربعة من 15 طبقة بهندسة مسام مربعة تبلغ 500 ميكرومتر × 500 ميكرومتر (الشكل 3 ب). تم ترسيب ألياف PCL طبقة تلو الأخرى بشكل صحيح ، مما يوفر قطر ألياف يبلغ حوالي 15 ميكرومتر.

الشكل 3: معدات MEW وتصنيع السقالات الليفية. (أ) إعداد MEW (i) وبرنامج Mach3 (ii)؛ عرض رأس الطابعة ولوحة التجميع (iii) ، وتشكيل مخروط تايلور أثناء الطباعة (IV). (ب) صور تباين الطور للسقالات المربعة الليفية (i) وتضخيم ترسيب الألياف الدقيق (ii). شريط المقياس = 250 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

توصيف وظائف الأنسجة القلبية المصغرة ثلاثية الأبعاد
بعد تفكك الخلية المفردة ، تم زرع مزيج الخلية المكون من 8: 2 hiPSC-CMs: hiPSC-CFs داخل هيدروجيليات الفيبرين على سقالات MEW PCL (الشكل 4 أ). بعد ساعة واحدة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، يتشكل الفيبرين بثبات ، مع توزيع الخلايا بشكل موحد في جميع أنحاء الجل ، وتغطي مسام الشبكة بأكملها (الشكل 4 ب). هذا مهم لأن hiPSC-CMs في الغالب غير انقسامية ، ولا يمكن الاعتماد على نمو الخلايا لملء المسام كما هو الحال مع أنواع الخلايا الأخرى. أظهرت الخلايا إعادة تشكيل سريعة للمصفوفة المحيطة عن طريق استطالة الخلية ، مع ضرب عفوي موضعي في وقت مبكر يصل إلى يومين بعد الطلاء. أظهر تحليل تلطيخ IF توزيعا مختلطا للخلايا في جميع أنحاء الجل ، يتفاعل مع شبكة PCL ، مع غالبية CMs (ACTN ⁺ VIM^-) متباعدة مع VIM ⁺ ACTN^- hiPSC-CFs. تظهر hiPSC-CMs بنية قشر معلق جيد التنظيم تتميز بتلوين بروتين ACTN المتباعد بانتظام (الشكل 4C). أظهرت أنسجة القلب المكونة من مليون خلية تقلصا مستقرا في جميع أنحاء الشبكة بأكملها ، بتردد ضرب يبلغ حوالي 30 نبضة في الدقيقة في اليوم السابع (28.93 ± 11.2 ، متوسط ± SD). استمرت هذه القدرة الوظيفية طوال الأيام في الثقافة ، مع انخفاض طفيف حتى اليوم 14 (17.18 ± 12.6 ، متوسط ± SD) (الشكل 4 د). عند تحليل نشاط التمثيل الغذائي ، أظهرت الأنسجة أنها تحافظ على بقاء الخلية في جميع أنحاء الثقافة ، دون أي تغييرات كبيرة ، هنا تم تحليلها في اليوم 7 مقابل. اليوم 14 (الشكل 4E). أخيرا ، أظهر تحليل نقطة المسار للأنسجة في أسبوع واحد سرعة انكماش تبلغ 38.53 ميكرومتر / ثانية ± 19.8 (متوسط ± SD ، ن = 16) وسعة انكماش تبلغ 28.91 ميكرومتر ± 15 (متوسط ± SD ، ن = 16) (الشكل 4F).

الشكل 4: توليد أنسجة القلب المصغرة البشرية ثلاثية الأبعاد وتوصيف بنية الأنسجة ووظائفها وقابلية الخلية للحياة. (أ) المخطط العام لتوليد الأنسجة الذي يجمع بين الخلايا القلبية المشتقة من hiPSC ، والسقالات المطبوعة MEW ، وتغليف هيدروجيل الفيبرين. (ب) صور تباين المرحلة التمثيلية للأنسجة الصغيرة الضاربة. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. (ج) صورة مكدس Z متحد البؤر لتنظيم الأنسجة ثلاثية الأبعاد ؛ hiPSC-CMs ملطخة ب ACTN (أخضر) ، وملطخة hiPSC-CFs ب VIM (أحمر) ، والنوى ملطخة ب DAPI (أزرق). يشار إلى شبكة MEW بواسطة رؤوس الأسهم. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. (د) تطور معدل ضرب الأنسجة من الجيل إلى اليوم 14. يتم تمثيل البيانات كمتوسط مع SD ل N = 3 ، n = 2-4. (ه) بقاء الخلية (تم تحليلها بواسطة النشاط الأيضي) للأنسجة بين اليومين 7 و 14. يتم تمثيل البيانات كمتوسط مع SD ل N = 3 ، n = 3-6. (و) تحليل الانكماش للأنسجة القلبية المصغرة التي تنبض تلقائيا في 1 أسبوع. يتم تمثيل سرعة الانكماش (ميكرومتر / ثانية) وسعة الانكماش (ميكرومتر) كمتوسط مع SD (ن = 16). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لإنشاء نموذج نسيج قلبي مصغر مركب ثلاثي الأبعاد يكرر الخصائص الأصلية لعضلة القلب البشرية ، يجب مراعاة العديد من العوامل الأساسية. يمكن تجميعها في ثلاث نقاط رئيسية: (1) تحسين إنتاجية ونقاء الخلايا لتصنيع الأنسجة ، (2) طباعة السقالة الليفية لتقليد البيئة الميكانيكية ثلاثية الأبعاد ، و (3) دمج هيدروجيل الفيبرين في عملية التصنيع.

تتضمن بعض الخطوات الرئيسية لضمان عملية تمايز ناجحة الحفاظ على خصائص تعدد القدرات لمركبات المقاومة المائية السرطانية عن طريق منع التقاء من تجاوز 90٪ ، وتحسين تخفيف hiPSC عند المرور لتحقيق التقاء كاف في بداية تمايز CM أو CF ، وضبط تركيز CHIR لكل خط خلوي لضمان تحريض الأديم المتوسط الفعال^{4 ، 15}. من الضروري التأكد من أن المزارع تحقق أكثر من 90٪ نقاء وأن أنواع خلايا القلب المختلفة يتم إنشاؤها بشكل منفصل. يسمح ذلك بتكوين الأنسجة الوظيفية حيث يمكن دراسة الأدوار المحددة لكل نوع من أنواع الخلايا بشكل صحيح ، خاصة عند استخدامها لنمذجة الأمراض أو الاختبارات الدوائية. للحفاظ على هذا المستوى العالي من نقاء الخلية ، من الضروري إجراء الاختيار الأيضي لخلايا عضلة القلب بدقة في الوسط المقيد للجلوكوز. من ناحية أخرى ، عند الحصول على الخلايا الليفية القلبية الصحية ، فإن القدرة على تعديل نمطها الظاهري والانتقال إلى الخلايا الليفية العضلية عبر مسار TGF-β توفر فرصة لنمذجة حالات مثل التليف القلبي ، الموصوفة في مكان آخر²¹. في هذا البروتوكول ، ينصب التركيز على توليد الخلايا الليفية غير المنشطة والصحية. لتحقيق ذلك ، من الضروري الحفاظ على مثبط TGF-β (SB) في وسط الثقافة بعد اكتمال عملية التمايز. بالإضافة إلى ذلك ، يجب ألا تتجاوز ثقافة hiPSC-CFs ستة مقاطع ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى تنشيط الخلايا الليفية والتمايز بسبب الصلابة فوق الفسيولوجية لبلاستيك زراعة الأنسجة²².

بالانتقال إلى عملية توليد سقالات ثلاثية الأبعاد اصطناعية ، تبرز MEW كتقنية واعدة للغاية نظرا لقدرتها على إنتاج هياكل ألياف دقيقة إلى نانوية عالية الترتيب باستخدام مواد متوافقة حيويا. بالمقارنة مع تقنيات التصنيع المضافة الأخرى ، توفر MEW تحكما فائقا في قطر الألياف من خلال تعديل معلمات النظام مثل درجة الحرارة وسرعة التجميع والجهد المطبق^23،24. ومع ذلك ، فإن إنتاج الألياف المتسق والدقيق يتطلب ضبطا دقيقا لهذه المعلمات للحفاظ على استقرار الألياف. يمكن أن تؤدي العوامل البيئية مثل درجة حرارة الغرفة والرطوبة إلى حدوث انحرافات طفيفة ولكنها كبيرة في إنتاج السقالات ، مما يؤكد الحاجة إلى ظروف تصنيع خاضعة للرقابة. يمكن أن يؤدي أي خلل في التوازن إلى تغييرات في قطر الألياف أو ترسب غير دقيق ، مما يؤثر على مورفولوجيا السقالة والخصائص الميكانيكية²⁴. لذلك ، يعد تحسين جميع المعلمات المذكورة أعلاه إحدى الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول التي يجب تحسينها في كل مختبر. هنا ، لتصنيع السقالات الليفية المدمجة في التركيبات ثلاثية الأبعاد ، تم اختيار الصف الطبي PCL كبوليمر المفضل لطباعة MEW ، لأنه ليس فقط المعيار الذهبي في هذا المجال ولكنه يوفر أيضا العديد من خصائص المواد المفيدة. يحتوي PCL على نقطة انصهار منخفضة (~ 60 درجة مئوية) وهو شبه موصل ، مما يبسط متطلبات المعالجة ويعزز اتساق تكوين الألياف أثناء الطباعة. من منظور الطب الحيوي ، فإن PCL متوافق حيويا للغاية ، ويدعم ارتباط الخلايا ونموها ، مما يجعلها مثالية لسقالات هندسة^{الأنسجة 25}. تؤكد الابتكارات الحديثة أيضا على استخدام مواد مثل PCL نظرا لقدرتها على موازنة قابلية التحلل البيولوجي مع الاستقرار الميكانيكي ، مما يضمن أن السقالات توفر الدعم الكافي لتجديد الأنسجة مع التحلل التدريجي دون إنتاج منتجات ثانوية^{ضارة 25،26}. هذا ضروري للتطبيق المحتمل للتركيبات الحالية لدراسات تجديد القلب في الجسم الحي . أيضا ، توفر قابلية ضبط هندسة سقالات MEW إمكانات إضافية للتحقيق في كل من سلوك الخلية والخصائص الميكانيكية في التركيبات الهندسية للأنسجة. من خلال تعديل حجم المسام وصلابة السقالة ، يتيح MEW إنشاء بيئات تحاكي المصفوفة خارج الخلية التي تؤثر على الاستجابات الخلوية. يوفر هذا منصة متعددة الاستخدامات لدراسة تفاعلات سقالات الخلايا ويعزز إمكانات MEW للنهوض بمجالات هندسة الأنسجة والطب^{التجديدي 26،27،28}. بالمقارنة مع التقنيات الأخرى مثل الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ، والتي توفر دقة ودقة أقل ، فإن قدرة MEW على إنتاج بنى مرتبة بدقة خاضعة للرقابة تضيف قيمة هائلة لتطبيقها.

على الرغم من هذه المزايا ، تقدم MEW قيودا معينة مقارنة بتقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد الأخرى ، لا سيما فيما يتعلق بأقصى ارتفاع للهياكل القابلة للطباعة. يصبح تراكم الشحنات الكهروستاتيكية داخل الألياف المترسبة مشكلة عندما تتجاوز ارتفاعات السقالة حوالي 4 مم ، مما يؤدي إلى تشوهات في الطبقات العليا بسبب تنافر الشحنة²⁹. في هذه الحالة ، فإن التحدي في توليد أنسجة أكثر سمكا أقل حول تنافر ألياف PCL ، حيث لا يتجاوز سمك هذه الأنسجة عادة 200 ميكرومتر ، والمزيد عن انخفاض توافر الأكسجين في التركيبات السميكة (أكثر من 200-300 ميكرومتر)³⁰. يؤدي هذا الانخفاض في الأكسجين إلى نقص الأكسجة وموت الخلايا لاحقا. للتغلب على هذه المشكلة وجعل التركيبات ثلاثية الأبعاد مناسبة للدراسات التجديدية في الجسم الحي ، ستتطلب التحسينات المستقبلية في سمك الأنسجة دمج الأوعية الدموية والتروية. هذا أمر بالغ الأهمية ، حيث أن دمج شبكات الأوعية الدموية في التركيبات ثلاثية الأبعاد سيضمن توافر الأكسجين والمغذيات الكافي في جميع أنحاء الأنسجة ، وهو التركيز الحالي في مجال هندسة أنسجة القلب^30،31،32.

من المعروف أن عضلة القلب الأصلية تتكون من خلايا قلبية وعائية مختلفة ، بما في ذلك خلايا عضلة القلب ، والخلايا الليفية ، وخلايا العضلات الملساء ، والخلايا البطانية ، وكلها منظمة بطريقة عالية التنظيم^{ومحاذاة 7}. على الرغم من أن نماذج الأنسجة الحالية تتضمن فقط CMs و CFs ، إلا أن الترتيب الدقيق لهذه الخلايا ، التي تم الحصول عليها من hiPSCs ، داخل الهيكل ثلاثي الأبعاد يمثل تقدما كبيرا. يلعب استخدام سقالات MEW دورا مهما في تحقيق هذا التنظيم ، حيث توفر السقالات بنية مجهرية محددة جيدا تعزز المحاذاة المناسبة وتنظيم الخلايا. في هذا النموذج ، تظهر خلايا عضلة القلب قساما قسيمة جيدة التنظيم وتظهر انكماشا قويا ، وهي الخصائص الرئيسية لأنسجة القلب الوظيفية. يعد هذا المستوى من المحاذاة الخلوية والتنظيم الخلوي أمرا بالغ الأهمية لتقليد أنسجة القلب الأصلية ويمثل تحسنا كبيرا مقارنة بالنماذج الأخرى ، مثل عضيات القلب ، حيث تظهر الخلايا غالبا محاذاة عشوائية³³. لذلك ، يوفر هذا النموذج نظاما أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لدراسة وظائف القلب وأمراضه ، مما يوفر تحكما أفضل في تنظيم الخلايا ، وهو أمر ضروري للنمذجة الدقيقة لأنسجة القلب.

ومع ذلك ، لتطوير نماذج تمثيلية حقيقية لأمراض القلب ، يتمثل أحد التحديات الكبيرة في التغلب على عدم نضج الأنسجة المتولدة. تنبع هذه المشكلة إلى حد كبير من الطبيعة غير الناضجة ل hiPSC-CMs التي تم الحصول عليها في المختبر³⁴. لا تكرر هذه الخلايا الخصائص الوظيفية لخلايا عضلة القلب البالغة بشكل كامل ، لذا فإن تعزيز نضجها أمر ضروري. يمكن تحقيق ذلك من خلال نهجين أساسيين: أولا ، من خلال تعزيز نضوج hiPSC-CMs نفسها ، وثانيا ، من خلال تحسين نضج الأنسجة متعددة الأنماط الظاهرية بشكل عام. أظهرت استراتيجيات مثل التحفيز الميكانيكي والكهربائي نتائج واعدة في دفع كل من النضج الوظيفي والهيكلي ، مما يساعد على إنشاء نماذج أنسجة تحاكي أنسجة القلب الأصلية^{للبالغين بشكل وثيق 35،36}. هذه قابلة للتطبيق على النموذج الحالي مع تغييرات طفيفة ، بالنظر إلى الطبيعة القائمة بذاتها للأنسجة القائمة على MEW.

فيما يتعلق بالخطوات الفنية لبروتوكول تصنيع الأنسجة ، من المهم ملاحظة أن نسبة CM: CF المضمنة في هيدروجيل الفيبرين يمكن أن تختلف. تم الإبلاغ عن أنه بالنسبة للتركيبات القلبية المهندسة ، فإن نسبة الخلايا الليفية من 5٪ -20٪ ضرورية لتقليد سلوك الضرب الطبيعي للأنسجة لأنها يمكن أن تزيد من معدل انتشار جهد^{الفعل 37}. في هذه الدراسة ، تم اختيار مستوى 20٪ من hiPSC-CFs لتقييم استجابات الخلايا الليفية بشكل أفضل في دراسات السموم اللاحقة. يمكن أيضا تعديل العدد الإجمالي للخلايا المزروعة ، حيث يمكن إنشاء الأنسجة بانتظام باستخدام 0 أو 5 أو 10 أو 20٪ من hiPSC-CFs. احسب دائما هذه النسبة بالنسبة للحجم الكلي للأنسجة ، وليس قطرها. قبل عملية التغليف ، يجب ضمان صلاحية الخلية الجيدة. لذلك ، حاول التخلص من محلول TrypLE بشكل صحيح عند حصاد الخلايا وتجنب إبقاء الخلايا مفصلة ومحببة إلى خلايا مفردة لفترة طويلة قبل البذر. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن خلايا عضلة القلب حساسة جدا للإجهاد الميكانيكي ، تأكد من عدم استخدام الطرد المركزي عند g أعلى مما هو محدد ، أو سحب العينات بقوة شديدة.

بالنسبة للتطبيقات العلاجية المحتملة ، من الضروري تغليف الخلايا داخل مادة تدعم كل من الجدوى والوظائف. في هذا السياق ، تم اختيار الفيبرين نظرا لتوافقه الحيوي العالي ، وقابليته للتحلل البيولوجي ، وقدرته على تقليد مكونات المصفوفة خارج الخلية³⁸. تنشأ قيود هذه المادة من تنوعها الكبير من دفعة إلى أخرى وقوتها الميكانيكية المنخفضة نسبيا. ومع ذلك ، تتم معالجة هذه المشكلات من خلال التعزيز الذي توفره السقالات الليفية MEW. لضمان قدرة إعادة تشكيل الخلايا داخل هذه المصفوفة المسامية ، من المهم الحصول على محلول متجانس لمزيج الهيدروجيل. لذلك, تأكد من أن حبيبات Cell Mix جافة بدرجة كافية, تخلص من أي حجم متبقي يمكن أن يخفف من محلول الهيدروجيل النهائي, واخلطه جيدا مع الثرومبين. بالنسبة للتركيبات الأكبر حجما ، يجب أيضا تعديل نسبة الفيبرينوجين / الثرومبين بالنسبة للحجم الكلي للأنسجة. يعد تجنب فقاعات الهواء أمرا بالغ الأهمية لتحقيق بنية ثلاثية الأبعاد محددة جيدا ومتجانسة ، مما يسمح للخلايا بالانتشار بشكل صحيح. بعد فترة وجيزة من إضافة الثرومبين ، يجب أن تكون الزيادة في لزوجة الجل ملحوظة ، إلى جانب تغيير طفيف في اللون من اللون الوردي (Tissue Generation Medium) إلى الأصفر.

أخيرا ، تتمثل إحدى أهم الخطوات لضمان نجاح العملية في إضافة البروتينين إلى الوسط حيث يتم نقل الأنسجة بعد بلمرة هلام الفيبرين لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. يمنع البروتينين ، وهو مثبط للبروتياز سيرين ، تحلل الفيبرين (تحلل الفيبرين) عن طريق تثبيط الإنزيمات المحللة للبروتين مثل البلازمين ، والتي يتم إطلاقها في الجسم أو الثقافة^17،39. بدون تثبيط ، ستقوم هذه الإنزيمات بتكسير الفيبرين إلى منتجات تحلل. من خلال الحفاظ على سلامة سقالة الفيبرين ، يسمح البروتينين للمصفوفة بالبقاء وظيفيا لفترات طويلة ، مما يحافظ على الهيكل ثلاثي الأبعاد الضروري لدعم بقاء الخلية على المدى الطويل ووظائفها في الأنسجة الهندسية.

لا يوجد تضارب في المصالح بين المؤلفين.

تم تمويل هذا البحث من قبل برنامج البحث والابتكار H2020 بموجب اتفاقيات المنح رقم 874827 (BRAV). وزارة العلوم والجامعات (إسبانيا) من خلال مشاريع PLEC2021-008127 (CARDIOPRINT) و PID2022-142562OB-I00 (VOLVAD) و PID2022-142807OA-I00 (INVESTTRA) بتمويل من MICIU / AEI / 10.13039 / 501100011033 والاتحاد الأوروبي NextGenerationEU / PRTR ؛ Gobierno de Navarra Proyectos Estratégicos IMPRIMED (0011-1411-2021-000096) و BIOHEART (0011-1411-2022-000071) ؛ Gobierno de Navarra Proyectos Colaborativos BIOGEN (PC020-021-022) و Gobierno de Navarra Salud GN32 / 2023. تم إنشاء الشكل 1 أ والشكل 2 أ والشكل 4 أ باستخدام BioRender.com.