JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لتحليل وظيفة lncRNAs في العمليات المعتمدة على الوقت مثل عدم استقرار الكروموسومات ، يجب تحقيق تأثير ضربة قاضية طويل الأمد. لهذا الغرض ، يتم تقديم بروتوكول يستخدم قليل النوكليوتيدات المعدلة المضادة للمعنى لتحقيق ضربة قاضية فعالة في خطوط الخلايا لمدة 21 يوما.

Abstract

تلعب الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNAs) أدوارا تنظيمية رئيسية في التعبير الجيني على مستوى النسخ. أثبتت الأدلة التجريبية أن جزءا كبيرا من lncRNA يتراكم بشكل تفضيلي في النواة. لتحليل وظيفة lncRNAs النووية ، من المهم تحقيق ضربة قاضية فعالة لهذه النصوص داخل النواة. على عكس استخدام تداخل الحمض النووي الريبي ، وهي تقنية تعتمد على آلية إسكات السيتوبلازم ، يمكن لتقنية قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى (ASO) تحقيق ضربة قاضية للحمض النووي الريبي عن طريق تجنيد RNase H في الازدواج بين الحمض النووي الريبي والحمض النووي لانقسام الحمض النووي الريبي. على عكس استخدام أدوات CRISPR-Cas لهندسة الجينوم ، حيث يمكن أن تحدث تغييرات محتملة في حالة الكروماتين ، تسمح ASOs بالضربة القاضية الفعالة للنصوص النووية دون تعديل الجينوم. ومع ذلك ، فإن إحدى العقبات الرئيسية أمام الضربة القاضية بوساطة ASO هي تأثيرها العابر. لدراسة التأثيرات طويلة الأمد لإسكات lncRNA ، هناك حاجة إلى الحفاظ على ضربة قاضية فعالة لفترة طويلة. في هذه الدراسة ، تم تطوير بروتوكول لتحقيق تأثير ضربة قاضية لأكثر من 21 يوما. كان الغرض من ذلك هو تقييم التأثيرات التنظيمية لرابطة الدول المستقلة لضربة قاضية lncRNA على جين الترميز المجاور RFC4 ، والذي يرتبط بعدم استقرار الكروموسومات ، وهي حالة لا يتم ملاحظتها إلا من خلال الوقت وشيخوخة الخلايا. تم استخدام خطين مختلفين من الخلايا البشرية: PrEC ، الخلايا الظهارية الأولية الطبيعية للبروستاتا ، و HCT116 ، وهو خط خلوي ظهاري معزول من سرطان القولون والمستقيم ، مما يحقق ضربة قاضية ناجحة في خطوط الخلايا التي تم فحصها.

Introduction

يتم نسخ الغالبية العظمى من الجينوم البشري ، مما يؤدي إلى ظهور مجموعة متنوعة من النصوص ، بما في ذلك lncRNAs ، والتي ، في العدد ، تتجاوز عدد جينات الترميز المشروحة في النسخ البشري1. LncRNAs عبارة عن نسخ أطول من 200 نيوكليوتيد لا تشفر البروتينات2،3 وقد تم فحصها مؤخرا لوظائفها التنظيمية المهمة في الخلية4. لقد ثبت أن وظائفهم تعتمد على توطينهم تحت الخلوي5 ، مثل النواة حيث يتراكم جزء كبير من lncRNAs ويشاركون بنشاط في تنظيم النسخ6 ولصيانة العمارة النووية7 ، من بين العمليات البيولوجيةالأخرى 8،9،10.

من أجل التوصيف الوظيفي ل lncRNAs النووية ، يجب استخدام طرق قادرة على إحداث ضربة قاضية (KD) في النواة ، وتعد ASOs أداة قوية لإسكات النصوص النووية. بشكل عام ، ASOs عبارة عن تسلسلات DNA أحادية الشريطة ~ 20 زوجا أساسيا في الطول ترتبط بالحمض النووي الريبي التكميلي عن طريق اقتران قاعدة Watson-Crick11،12،13 ويمكنها تعديل وظيفة الحمض النووي الريبي من خلال الآليات التي تعتمد على تركيبها الكيميائي وتعديلاتها13،14. يمكن تقسيم تعديلات كيمياء ASO إلى مجموعتين رئيسيتين: تعديلات العمود الفقري وتعديلات حلقة السكر 2'15 ، وكلاهما يهدف إلى زيادة الاستقرار من خلال منح مقاومة عالية للنوكليازات ولكن أيضا لتعزيز التأثير البيولوجي المقصود13،16. من بين تعديلات العمود الفقري ، تستخدم روابط مورفولينو الفوسفوراميد (PMO) ، والثيوفوسفوراميدات ، والمورفولينو على نطاق واسع لأغراض مثل التداخل في التضفير17،18 من خلال العمل كعوامل حجب استفراغية19 ولكن ليس للحث على تدهور النسخ. تعديل آخر للعمود الفقري هو رابطة الفوسفوروثيوات (PS) ، وهي واحدة من أكثر التعديلات استخداما في ASOs. على عكس التعديلات المذكورة سابقا ، لا تتداخل سندات PS مع تجنيد RNase H12،20 ، مما يسمح بضربة قاضية من RNA. ومع ذلك ، هناك أيضا مجموعة متنوعة من تعديلات حلقة السكر 2 '21. ومع ذلك ، لغرض ضربة قاضية من الحمض النووي الريبي ، من بين التعديلات التي تحفز تأثيرات إسكات فعالة الأحماض النووية المقفلة (LNAs) 22 و 23 و 2'-O-methyl24. على الرغم من أن LNAs أثبتت فعاليتها العالية في الضربة القاضية مقارنة بالتعديلات الأخرى25 ، إلا أنها يمكن أن تسبب تأثيرات غير مرغوب فيها مثل السمية الكبدية26 وتحريض موت الخلايا المبرمج في الجسم الحي وفي المختبر27.

لغرض ضربة قاضية من الحمض النووي الريبي ، يمكن ل ASOs مع التعديلات المناسبة المذكورة من قبل تجنيد RNase H1 و H220،28 ، ويتم تجنيد هذه الإنزيمات في هجينة الحمض النووي الريبي وشق الحمض النووي الريبي المستهدف ، وإطلاق ASO13. ثم تتم معالجة منتجات الحمض النووي الريبي لهذا الانقسام بواسطة آلية مراقبة الحمض النووي الريبي ، مما يؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي29 دون تعديل المنطقة الجينومية ذات الأهمية ، على عكس التقنيات الأخرى مثل أنظمة CRISPR-Cas ، حيث يمكن أن تخلق التعديلات في حالة الكروماتين تأثيرات بيولوجية غير مرغوب فيها30. على الرغم من مزايا تقنية ASO ، فإن تأثيرات الإسكات المؤقتة بسبب انقسام الخلايا أو تدهور ASO بمرور الوقت تشكل عقبة يجب التغلب عليها عند دراسة العمليات المعتمدة على الوقت مثل عدم استقرار الكروموسومات (CIN) 31.

على وجه الخصوص ، يتم تعريف CIN على أنه معدل متزايد من التغيرات في عدد الكروموسومات وهيكلها مقارنة بتلك الموجودة في الخلايا الطبيعية32 وينشأ من أخطاء في فصل الكروموسوم أثناء الانقسام ، مما يؤدي إلى تغيرات جينية تنشأ عدم التجانس داخل الورم33 بمرور الوقت. وبالتالي ، لا يمكن تقييم CIN فقط من خلال إيجاد نمط نواة اختلال الصيغة الصبغية. من أجل الدراسة والتقييم المناسبين ل CIN في زراعة الخلايا ، من المهم مراقبة الخلايا بمرور الوقت. لدراسة تأثيرات lncRNA KD على CIN ، هناك حاجة إلى منهجية تسمح بتأثير KD طويل الأمد. لهذا الغرض ، تم استخدام ASOs في هذا البروتوكول ، حيث تم إسكات lncRNA-RFC4 بنجاح في خطوط الخلايا البشرية HCT115 و PrEC لمدة 18 و 21 يوما على التوالي. هذا النسخة عبارة عن lncRNA غير مميز يبلغ طوله 1.2 كيلو بايت ، وموقعه الجيني على الكروموسوم 3 (q27.3). إنه مجاور لجين ترميز البروتين RFC4 ، وهو جين مرتبط ب CIN في أنواع مختلفة من السرطان البشري34،35،36.

Protocol

ملاحظة: الغرض من هذا البروتوكول هو أن يتم تنفيذه فقط من قبل موظفي المختبر ذوي الخبرة في إجراءات سلامة المختبرات. من الضروري قراءة أوراق بيانات السلامة بشكل صحيح من جميع الكواشف والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول قبل البدء في التعامل مع المواد والمعدات الخطرة. من الضروري قراءة وفهم وتلبية جميع متطلبات السلامة المشار إليها في دليل سلامة المختبر الخاص بمؤسستك على طول البروتوكول بأكمله. يجب أن يتم التخلص من جميع النفايات البيولوجية والكيميائية وفقا لدليل إدارة النفايات والتخلص منها الخاص بالمؤسسة. إذا لم يتم التعامل معها بعناية ووفقا لممارسات مختبرية آمنة ، يمكن أن تتسبب المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول في إصابات خطيرة. اتبع دائما دليل مختبر السلامة الخاص بالمؤسسة وإجراءات السلامة.

1. تصميم ASOs

  1. تصميم ASOs يدويا كما هو موضح أدناه.
    1. احصل على التسلسل الكامل للنسخة المستهدفة وقم بتحليله في RNAfold WebServer ، جامعة فيينا37 (جدول المواد) ، باستخدام المعلمات الافتراضية على موقع الويب للحصول على الحد الأدنى من البنية الثانوية للطاقة الحرة (MFE).
    2. عندما تكون النتائج جاهزة، انتقل إلى رسم الهيكل العادي للمؤسسة وانقر فوق عرض في فورنا لفتح البنية الثانوية للمؤسسة على موقع الويب، وسيعرض البرنامج البنية الثانوية المتوقعة للنسخة التي تم تحليلها.
    3. من الهيكل الثانوي المتوقع ل MFE ، حدد منطقة بطول 20 نقطة أساس في الحمض النووي الريبي ، وتجنب سلاسل G (تسلسلات من 3 جوانين على التوالي) عند تصميم قليل النوكليوتيدات. لتحديد أفضل منطقة مستهدفة ل ASO، استخدم المناطق التي يتوقع أن يكون لها احتمال أقل لإقران القاعدة الداخلية (الشكل 1).
    4. من المنطقة المحددة البالغة 20 نقطة أساس ، قم بإنشاء تسلسل المكمل العكسي. قم بإنشاء المكمل العكسي يدويا أو استخدم أداة المكملة العكسية عبر الإنترنت (جدول المواد). سيكون تسلسل المكملة العكسي هو ASO الذي يجب تصنيعه للتجربة.
    5. قم بتحليل تسلسل ASO باستخدام Nucleotide Blast NCBI (blastn) ومتصفح الجينوم UCSC على الإنسان (GRCh38 / hg38). تأكد من أن ASOs لا تظهر تماثلا مع النصوص الأخرى أو المناطق الجينومية الأخرى في الجينوم البشري.
      ملاحظة: تم إجراء تخليق وتنقية ASO من قبل شركة تجارية (جدول المواد).
  2. تأكد من أن قليل النوكليوتيدات المركبة لها الخصائص التالية.
    1. تأكد من روابط PS على طول التسلسل الكامل لقليل النوكليوتيد38 (الشكل 2 أ). تأكد من أن ASOs خيالية ، مع وجود 5 نيوكليوتيدات تحيط بالنهايات 5 و 3 بحلقات سكر معدلة ب 2'-O-methyl (الشكل 2 ب).
    2. تأكد من أن النيوكليوتيدات ال 10 الموجودة في المنتصف تحتوي على حلقة سكر غير معدلة لدعم ارتباط RNase H (الشكل 2 ج).
    3. اطلب من الشركة إجراء التنقية باستخدام تحلية المياه القياسية والمرحلة العكسية (RP) HPLC39.
    4. اطلب تسليم ASO بتنسيق مجفف.
  3. قم بإذابة ASOs المجففة بالتجميد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco بدون الكالسيوم والمغنيسيوم إلى تركيز نهائي يبلغ 200 ميكرومتر.
  4. تحضير محلول عمل ASO عن طريق تخفيف المخزون المركز إلى تركيز 20 ميكرومتر. تحضير التخفيف باستخدام DPBS. يحفظ في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة، تم تصميم اثنين من ASOs يستهدفان lncRNA-RFC4. لتحسين تركيز ASO من أجل التعداء والكفاءة ، تم اتباع بروتوكول Zong et al.40 . تم تصميم اثنين من ASOs وتحسينهما تجريبيا وفقا لبروتوكول Zong: ASO-lncRFC4 و ASO-lncRFC4-2. بعد التحسين ، تم اختيار ASO فعال يستهدف lncRNA-RFC4 ، ASO-lncRFC4 ، لبروتوكول الضربة القاضية المطول (الشكل التكميلي 1). كعنصر تحكم إيجابي ، تم استخدام ASO فعال مؤكد سابقا يستهدف lncRNA MALAT18 : ASO-MALAT1. بالنسبة للتحكم السلبي ، تم تصميم ASO يستهدف جين الإشريكية القولونية lacZ ، ASO-lacZ (رقم انضمام NCBI: FN297865).

2. تحضير الخلايا

ملاحظة: اعمل داخل غطاء مزرعة الخلية في كل مرة يتم فيها التعامل مع خطوط الخلايا أو المحاليل أو المواد أو أي منتج يتم استخدامه أثناء التلاعب بزراعة الخلايا. عند التلاعب بالسوائل لزراعة الخلايا، استخدم دائما ماصات مصلية معقمة أو ماصات دقيقة ذات أطراف معقمة. استيفاء واتباع جميع متطلبات السلامة المشار إليها في دليل سلامة المختبر الخاص بالمؤسسة أثناء البروتوكول بأكمله.

  1. قم بإعداد وسائط زراعة الخلايا الكاملة لكل خط خلية كما هو موضح أدناه.
    1. بالنسبة إلى HCT116 ، قم بإعداد وسط McCoy 5A مع 10٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS).
    2. بالنسبة ل PrEC ، قم بإعداد الوسط القاعدي للخلايا الظهارية للبروستاتا باستخدام مجموعة نمو الخلايا الظهارية للبروستاتا.
  2. استخدم ثلاث ألواح استزراع 100 مم (مساحة سطح 55 سم2 ) لتجارب KD ، واحدة لكل قليل النوكليوتيد لاستخدامها: ASO يستهدف lncRNA ، ASO لاستخدامه كعنصر تحكم إيجابي (ASO-MALAT1) و ASO لاستخدامه كعنصر تحكم سلبي (ASO-lacZ).
  3. استخدم لوحين للاستزراع مقاس 35 مم (9 سم2 في مساحة السطح) لاستخدامهما كنقاط تفتيش ل KD بين ممرات الخلايا ، سيتم نقل أحدهما بوسائط تعداء كاملة ل ASO-lncRFC4 والآخر ل ASO-lacZ.
    ملاحظة: تم التخطيط للتعداء وفقا لإجراءات وبروتوكولات الشركة المصنعة للكاشف القائم على الدهون (انظر جدول المواد) التي تم الإبلاغ عنها سابقا41،42.
  4. خلايا البذور بكثافة 1 × 104 خلايا / سم2 في أطباق زراعة الخلايا. احتضان عند 37 درجة مئوية في الحاضنة باستخدام 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء حتى تصل الخلايا إلى التقاء 50٪ (عندما يتم تغطية 50٪ من السطح بواسطة طبقة أحادية الخلية). مع التقاء 50٪ ، تكون الخلايا جاهزة للنقل لهذا البروتوكول.
    ملاحظة: بالنسبة لتعداء ASO-lncRFC4 و ASO-lacZ ، تم زرع طبق واحد مقاس 100 مم وطبق واحد مقاس 35 مم. بالنسبة لتعداء ASO-MALAT1 ، تم زرع طبق 100 مم فقط (الشكل 3 أ).

3. التعداء

  1. قم بتسخين متوسط المصل المخفض إلى 37 درجة مئوية قبل بدء الإجراء.
  2. للتعداء باستخدام ASO-lacZ و ASO-lncRFC4 ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    ملاحظة: تم التخطيط للتعداء باستخدام ASO-lacZ و ASO-lncRFC4 للخلايا في مساحة سطح 55 سم2 ؛ عند استخدام مناطق مختلفة ، يمكن تعديل الأحجام وفقا لذلك. يجب تنفيذ هذا الإجراء لكل ASO مستخدم في نفس الظروف.
    1. قم بإعداد الأنبوب 1 داخل غطاء مزرعة الخلية عن طريق إذابة 43.75 ميكرولتر من ASO (20 ميكرومتر) في 1.4 مل من وسط المصل المختزل الدافئ في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل سعة 15 مل.
    2. قم بإعداد الأنبوب 2 داخل غطاء مزرعة الخلية عن طريق خلط 18.66 ميكرولتر من كاشف التعدي القائم على الدهون مع 1.4 مل من وسط المصل الدافئ المخفض في أنبوب ميكرو فوج خال من RNase سعة 1.5 مل.
    3. احتضان الأنبوبين 1 و 2 داخل غطاء مزرعة الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    4. أضف المحلول الموجود في الأنبوب 2 (كاشف التعدي + المصل المختزل) مباشرة إلى الأنبوب 1 (ASO + مصل مختزل) ببطء ، قطرة قطرة ، لتجنب انتشار الكواشف على سطح الأنبوب.
    5. احتضان الخليط الموجود في الأنبوب 1 لمدة 20 دقيقة داخل غطاء المزرعة في درجة حرارة الغرفة.
    6. أضف وسط المصل الدافئ المخفض إلى الأنبوب 1 إلى الحجم النهائي 8.75 مل.
      ملاحظة: احتوت وسائط التعداء النهائية على ASO بتركيز 100 نانومتر.
    7. قم بإزالة وسائط الاستزراع من طبق زراعة الخلية الذي يحتوي على الخلايا المراد نقلها وأضف 7.5 مل من وسائط التعدي إلى لوحة الثقافة 100 مم و 1 مل إلى لوحة الثقافة مقاس 35 مم مباشرة في الطبقة الأحادية للخلية ، قطرة قطرة. تأكد من توزيع الوسائط بالتساوي على طول السطح بالكامل عن طريق رج الطبق برفق.
    8. احتضان في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء لمدة 6 ساعات.
    9. بعد 6 ساعات من الحضانة في وسائط التعدي ، أضف 7.5 مل من الوسائط الكاملة إلى الخلايا الموجودة في لوحة الثقافة 100 مم و 1 مل من الوسائط الكاملة إلى الخلايا الموجودة في لوحة الثقافة 35 مم. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. للتعداء باستخدام ASO-MALAT1 ، قم بإجراء التجارب كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: تم التخطيط للتعداء باستخدام ASO-MALAT1 للخلايا في مساحة 55 سم2.
    1. قم بإعداد الأنبوب 1 داخل غطاء مزرعة الخلية عن طريق إذابة 37.5 ميكرولتر من ASO (20 ميكرومتر) في 1.2 مل من وسط المصل الدافئ المختزل في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل سعة 15 مل.
    2. قم بإعداد الأنبوب 2 عن طريق خلط 16 ميكرولتر من كاشف التعدي القائم على الدهون مع 1.2 مل من وسط المصل الدافئ المختزل.
    3. احتضان الأنبوبين 1 و 2 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق داخل غطاء مزرعة الخلية.
    4. أضف المحلول الموجود في الأنبوب 2 (كاشف التعداء القائم على الدهون + المصل المختزل) مباشرة إلى الأنبوب 1 (ASO + مصل مختزل) ببطء ، قطرة قطرة ، لتجنب انتشار الكواشف على سطح الأنبوب.
    5. احتضان الخليط الموجود في الأنبوب 1 لمدة 20 دقيقة داخل غطاء المزرعة في درجة حرارة الغرفة.
    6. أضف وسط مصل دافئ مخفف إلى الأنبوب 1 إلى الحجم النهائي 7.5 مل. احتوت وسائط التعدي النهائية على ASO بتركيز 100 نانومتر.
    7. قم بإزالة وسائط الثقافة من طبق زراعة الخلية الذي يحتوي على الخلايا المراد نقلها وأضف 7.5 مل من وسائط التعدي مباشرة إلى الخلية أحادية الطبقة بالتنقيط لضمان توزيع الوسط بالتساوي على طول السطح بالكامل عن طريق رج الطبق برفق.
    8. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة باستخدام 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء لمدة 6 ساعات.
    9. بعد 6 ساعات من الحضانة باستخدام وسائط التعدي ، أضف 7.5 مل من الوسائط الكاملة إلى الخلايا واحتضانها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  4. قم بتقييم الخلايا مجهريا كل 12-24 ساعة حتى تصبح الخلايا جاهزة لجولة التعداء التالية.
    ملاحظة: بعد ذلك ، يجب إجراء التعدي عندما تحقق الخلايا التقاء بنسبة 70٪. إذا لزم الأمر ، استبدال الوسائط بوسيط ثقافة كامل.
  5. عندما تتلاقى الخلايا بنسبة 70٪ في طبق زراعة الخلايا ، كرر الإجراء (الخطوات من 3.1 إلى 3.4) وقم بإجراء الجولة التالية من التعداد.
    ملاحظة: بعد التعداء الثاني ، يجب تقييم الخلايا مجهريا كل 12-24 ساعة. يجب إجراء حصاد الخلايا ومرورها عندما تحقق الخلايا التقاء 80٪ -85٪. إذا لزم الأمر ، استبدال الوسائط بوسيط ثقافة كامل.

4. حصاد الخلايا ومرورها

ملاحظة: يتم إجراء حصاد الخلايا ومرورها بعد كل جولتين من التعدي وبعدالجولات 2 و 4 و 6 من التعدين. كان متوسط وقت الحصاد في خلايا HCT116 بعد 6 أيام من عمليات النقل 1و 3و 5 ، وبالنسبة لخلايا PrEC ، كان متوسط الوقت 7 أيام بعد عمليات النقل 1 و 3 و 5. تختلف النقطة الزمنية للتعداء لكل من خطي الخلايا المستخدمين في هذا البروتوكول. بالنسبة إلى HCT116 ، يتم إجراء عملياتالتعداء 2 و 3و 4 و 5 و 6 و 6 بعد 3 و 6 و 9 و 12 و 15 يوما بعد التعداء الأول ، على التوالي. بالنسبة ل PrEC ، يتم إجراء عمليات النقل 2و 3 و 4 و 5 و 6 بعد 3 و 7 و 10 و 14 و 18 يوما بعد التعداء الأول ، على التوالي. راجع الجدول الزمني في الشكل 3 للتحقق من النقاط الزمنية للتعداء والمرور والحصاد.

  1. قم بإجراء حصاد الخلايا ومرورها لتجارب الديكوراتي في ألواح استزراع 100 مم كما هو موضح أدناه.
    1. المضي قدما في حصاد الخلايا والمرور عندما تحقق الخلايا التقاء 80٪ -85٪.
    2. قم بتسخين المحاليل الكاملة واغسل المحاليل إلى 37 درجة مئوية. قم بتسخين كاشف التفكك إلى درجة حرارة الغرفة. قم بتسخين محلول المحايد لكاشف التفكك إلى درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: تختلف محاليل الغسيل وكواشف التفكك والمحاليل المعادلة باختلاف خطي الخلايا المستخدمين في هذا البروتوكول. يتم غسل خلايا HCT116 باستخدام PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) وفصلها بمحلول التربسين-EDTA. يتم إجراء تحييد كاشف التفكك باستخدام وسائط مزرعة كاملة لخلايا HCT116. بالنسبة ل PrEC ، يتم استخدام محلول ملحي مخزن ب HEPES كمحلول غسيل. يستخدم Trypsin-EDTA ككاشف التفكك. لتحييد كاشف التفكك ، استخدم محلول تحييد التربسين.
    3. داخل غطاء المزرعة ، قم بإزالة وسائط الثقافة من طبق زراعة الخلايا واغسلها برفق باستخدام 3 مل من محلول الغسيل ، متبوعا بالتخلص من محلول الغسيل. كرر هذه الخطوة 2x.
    4. أضف 2 مل من كاشف التفكك وفقا لخط الخلية إلى الطبقة الأحادية للخلية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. قم بتقييم الخلايا كل دقيقتين حتى يكتمل التفكك.
    5. أضف 2 مل من محلول المعادل وفقا لخط الخلية وانقل الحجم الكامل لتعليق الخلية من طبق زراعة الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي 15 مل.
    6. لاستخراج الحمض النووي الريبي ، خذ 500 ميكرولتر من تعليق الخلية وانقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. ضع الأنبوب على الجليد وانتقل إلى الخطوة 5.1 لاستخراج الحمض النووي الريبي و RT-qPCR.
    7. قم بالطرد المركزي لباقي تعليق الخلية عند 120 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية.
    8. أعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من وسائط الثقافة الكاملة وانتقل إلى عد الخلايا وفقا للإجراءات القياسية.
    9. للتنميط النووي ، خلايا البذور بكثافة 1 × 104 خلايا / سم2 في طبق زراعة خلية بقطر 35 مم (مساحة سطح 9 سم2) ، تحتضن في حاضنة عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء لمدة 24 ساعة وانتقل إلى التنميط النووي وفقا للإجراءات القياسية.
    10. لمواصلة تجارب KD في الممر الخلوي التالي ، خلايا البذور بكثافة 1 × 104 خلايا / سم2 في طبق زراعة خلوي جديد قطره 100 مم. سيكون هذا الطبق هو المقطع رقم 2 للتجربة. احتضان عند 37 درجة مئوية في الحاضنة باستخدام 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء حتى تحقق الخلايا التقاء بنسبة 50٪.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، يمكن استخدام الخلايا المتبقية لاستخراج البروتين و / أو التجميد وفقا للإجراءات القياسية.
    11. كرر الخطوات من 3.1 إلى 4.1.10 للتعداء والحصاد من الممر 2 ومن المقطع 3.
  2. اتبع الإجراء التالي لحصاد الخلايا لنقاط التفتيش الخاصة بتجارب KD في أطباق الاستزراع 35 مم.
    ملاحظة: يتم إجراء حصاد نقطة التفتيش الأولى في تجربة KD بعد يومين منإجراءات التعدي 2 و 4.
    1. قم بتسخين الوسائط الكاملة ومحاليل الغسيل إلى 37 درجة مئوية. قم بتسخين كاشف التفكك إلى درجة حرارة الغرفة. قم بتسخين محلول المحايد لكاشف التفكك إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. داخل غطاء المزرعة، قم بإزالة وسائط المزرعة من طبق زراعة الخلايا واغسلها برفق باستخدام 0.5 مل من محلول الغسيل ثم تخلص من محلول الغسيل. كرر هذه الخطوة 2x.
    3. بعد التخلص من محاليل الغسيل ، أضف 0.5 مل من كاشف التفكك وفقا لخط الخلية واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. قم بتقييم الخلايا كل دقيقتين حتى يكتمل التفكك.
    4. أضف 0.5 مل من محلول التحييد وفقا لخط الخلية وانقل الحجم الكامل لتعليق الخلية من طبق زراعة الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وضعه على الجليد.
    5. انتقل إلى الخطوة 5.1 لاستخراج الحمض النووي الريبي و qPCR.

5. استخراج الحمض النووي الريبي و RT-PCR

  1. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. اغسل حبيبات الخلية ب 600 ميكرولتر من PBS البارد (4 درجات مئوية).
  2. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    استخدم حبيبات الخلية لاستخراج الحمض النووي الريبي وفقا للإجراءات القياسية.
  3. انتقل إلى معالجة DNase للحمض النووي الريبي المنقى وفقا للإجراء القياسي المتبع في المختبر. عند نقطة التوقف ، قم بتخزين الحمض النووي الريبي المنقى عند -80 درجة مئوية لفترات طويلة.
  4. استخدم الحمض النووي الريبي لتخليق الحمض النووي (كدنا) القياسي مع كل عينة من الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها. عند نقطة التوقف المؤقت ، قم بتخزين (كدنا) عند -20 درجة مئوية لفترات طويلة.
  5. قم بإجراء qPCR القياسي وفقا للخطوات الموضحة أدناه.
    1. بالنسبة إلى qPCR ، تعمل قلة النوكليوتيدات على تضخيم النصوص التالية: lncRNA محل الاهتمام ، و MALAT1 والجين المعبر عنه بشكل أساسي كعنصر تحكم داخلي (الجدول 1). بالنسبة لهذا البروتوكول، تم استخدام التعبير RPS28 كعنصر تحكم داخلي.
    2. قم بإجراء تفاعلات qPCR لتضخيم التحكم الداخلي و lncRNA محل الاهتمام و MALAT1 باستخدام (كدنا) من عينة ASO-LacZ. سيتم استخدام هذه العينة لتطبيع التعبير من العينات الأخرى.
    3. قم بإجراء تفاعلات qPCR لتضخيم التحكم الداخلي RPS28 و lncRNA ذي الأهمية باستخدام (كدنا) من عينة ASO-lncRNA.
    4. قم بإجراء تفاعلات qPCR لتضخيم عناصر التحكم الداخلية RPS28 و MALAT1 باستخدام (كدنا) من عينة ASO-MALAT1. اتبع إعداد التفاعل وظروف التدوير الحراري كما هو موضح في الجدول 2.
    5. قم بتحليل بيانات qPCR عن طريق تطبيع ΔΔCt للتعبير عن النص محل الاهتمام مقابل التحكم الداخلي ، ثم تطبيع التعبير عن النص محل الاهتمام (lncRNA أو MALAT1) مقابل التعبير عن نفس النص في عينة ASO-LacZ للحصول على مستوى التعبير النسبي للنسخة.

النتائج

في البروتوكول الحالي ، تم تكييف استخدام ASOs مع KD ل lncRNA النووي لفترة طويلة في خطوط الخلايا البشرية PrEC و HCT116.

بالتأكيد ، كانت تجربة KD ناجحة في خط الخلية PrEC لمدة 21 يوما من التجربة ، كما لوحظ في الشكل 4. لتأكيد هذا البيان ، بالإضافة إلى تحليل التعب?...

Discussion

كما ذكرنا سابقا ، فإن lncRNAs لها وظائف تنظيمية رئيسية في الخلية. وبالتالي ، قد يكون خلل تنظيم هذه النصوص متورطا في الأمراض. السرطان هو أحد هذه الأمراض التي تتميز بخلل في تنظيم lncRNA43،44. في هذا المرض ، من المعروف أن lncRNAs تلعب أدوارا تنظيمية مهمة م...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

مونتيل مانريكيز ، روجيليو طالب دكتوراه من برنامج الدكتوراه في العلوم البيولوجية ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (UNAM) وحصل على زمالة CONACyT مع رقم CONACyT CVU: 581151.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15ml Centrifuge Tubes - 15ml Conical TubesThermo Fisher Scientific339650
Corning 100 mm TC-treated Culture DishCorning 430167Surface area:55 cm2
Corning 35 mm TC-treated Culture DishCorning 430165Surface area: 9 cm2
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190144
Fetal Bovine Serum (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 cell lineATCCCCL-247
HEPES, 1M Buffer SolutionThermo Fisher Scientific15630122
Integrated DNA Technologies NANAhttps://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX ReagentThermo Fisher Scientific13778150
McCoy's 5A medium ATCC30-2007
Normal Human Primary Prostate Epithelial Cells (HPrEC)ATCCPCS-440-010
Nucleotide Blast NCBI NANAhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Reduced Serum MediaThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher Scientific
Prostate Epithelial Cell Basal MediumATCCPCS-440-030
Prostate Epithelial Cell Growth KitATCCPCS-440-040
Reverse complement online toolNANAhttps://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANAhttp://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLThermo Fisher ScientificAM12400
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher Scientific12604013Trypsin-EDTA solution
Trypsin Neutralizing SolutionATCCPCS-999-004
Trypsin-EDTA for Primary CellsATCCPCS-999-003
UCSC Genome Browser, Human (GRCh38/hg38)NANAhttps://genome.ucsc.edu/

References

  1. Fang, S., et al. NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (Database issue), D308-D314 (2018).
  2. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  3. Palazzo, A. F., Koonin, E. V. Functional Long Non-coding RNAs Evolve from Junk Transcripts. Cell. 183 (5), 1151-1161 (2020).
  4. Ransohoff, J. D., Wei, Y., Khavari, P. A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 143-157 (2017).
  5. Chen, L. L. Linking Long Noncoding RNA Localization and Function. Trends in Biochemical Sciences. 41 (9), 761-772 (2016).
  6. Basu, S., Larsson, E. A Catalogue of Putative cis-Regulatory Interactions Between Long Non-coding RNAs and Proximal Coding Genes Based on Correlative Analysis Across Diverse Human Tumors. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (6), 2019-2025 (2018).
  7. Petermann, F., et al. The Magnitude of IFN-γ Responses Is Fine-Tuned by DNA Architecture and the Non-coding Transcript of Ifng-as1. Molecular Cell. 75 (6), 1229.e5-1242.e5 (2019).
  8. Tripathi, V., et al. The Nuclear-Retained Noncoding RNA MALAT1 Regulates Alternative Splicing by Modulating SR Splicing Factor Phosphorylation. Molecular Cell. 39 (6), 925-938 (2010).
  9. Chen, L. L., Carmichael, G. G. Decoding the function of nuclear long non-coding RNAs. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 357-364 (2010).
  10. Vance, K. W., Ponting, C. P. Transcriptional regulatory functions of nuclear long noncoding RNAs. Trends in Genetics. 30 (8), 348-355 (2014).
  11. Ren, H., Zhang, Z., Zhang, W., Feng, X., Xu, L. Prodrug-type antisense oligonucleotides with enhanced nuclease stability and anti-tumour effects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 162, 105832 (2021).
  12. Kole, R. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. DRUG DISCOVERY. 16, (2012).
  13. DeVos, S. L., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Treating Neurodegeneration at the Level of RNA. Neurotherapeutics. 10 (3), 486-497 (2013).
  14. Le, B. T., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Angiogenic Factors as Potential Cancer Therapeutics. Molecular Therapy Nucleic Acids. 14, 142-157 (2019).
  15. Shadid, M., Badawi, M., Abulrob, A. Antisense oligonucleotides: absorption, distribution, metabolism, and excretion. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 17 (11), 1281-1292 (2021).
  16. Roberts, T. C., Langer, R., Wood, M. J. A. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (10), 673-694 (2020).
  17. Havens, M. A., Hastings, M. L. Splice-switching antisense oligonucleotides as therapeutic drugs. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6549-6563 (2016).
  18. Michaels, W. E., Pena-Rasgado, C., Kotaria, R., Bridges, R. J., Hastings, M. L. Open reading frame correction using splice-switching antisense oligonucleotides for the treatment of cystic fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (3), e2114886119 (2022).
  19. Lim, K. H., et al. Antisense oligonucleotide modulation of non-productive alternative splicing upregulates gene expression. Nature Communications. 11 (1), 3501 (2020).
  20. Crooke, S. T. Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 70-77 (2017).
  21. Monia, B. P., Johnston, J. F., Sasmor, H., Cummins, L. L. Nuclease Resistance and Antisense Activity of Modified Oligonucleotides Targeted to Ha. Journal of Biological Chemistry. 271 (24), 14533-14540 (1996).
  22. Grünweller, A., et al. Comparison of different antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids, 2′-O-methyl RNA, phosphorothioates and small interfering RNA. Nucleic Acids Research. 31 (12), 3185-3193 (2003).
  23. Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. 32 (9), 1948-1957 (2018).
  24. Yoo, B. H., Bochkareva, E., Bochkarev, A., Mou, T. C., Gray, D. M. 2′-O-methyl-modified phosphorothioate antisense oligonucleotides have reduced non-specific effects in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (6), 2008-2016 (2004).
  25. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86.e16-101.e16 (2017).
  26. Kasuya, T., et al. Ribonuclease H1-dependent hepatotoxicity caused by locked nucleic acid-modified gapmer antisense oligonucleotides. Scientific Reports. 6 (1), 30377 (2016).
  27. Swayze, E. E., et al. Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but cause significant hepatotoxicity in animals. Nucleic Acids Research. 35 (2), 687-700 (2007).
  28. Hyjek, M., Figiel, M., Nowotny, M. RNases H: Structure and mechanism. DNA Repair. 84, 102672 (2019).
  29. Lima, W. F., De Hoyos, C. L., Liang, X., Crooke, S. T. RNA cleavage products generated by antisense oligonucleotides and siRNAs are processed by the RNA surveillance machinery. Nucleic Acids Research. 44 (7), 3351-3363 (2016).
  30. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  31. Drews, R. M., et al. A pan-cancer compendium of chromosomal instability. Nature. 606 (7916), 976-983 (2022).
  32. Benhra, N., Barrio, L., Muzzopappa, M., Milán, M. Chromosomal Instability Induces Cellular Invasion in Epithelial Tissues. Developmental Cell. 47 (2), 161.e4-174.e4 (2018).
  33. Gronroos, E., López-García, C. Tolerance of Chromosomal Instability in Cancer: Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Cancer Research. 78 (23), 6529-6535 (2018).
  34. Liu, L., et al. An RFC4/Notch1 signaling feedback loop promotes NSCLC metastasis and stemness. Nature Communications. 12 (1), 2693 (2021).
  35. Shiomi, Y., Nishitani, H. Control of Genome Integrity by RFC Complexes; Conductors of PCNA Loading onto and Unloading from Chromatin during DNA Replication. Genes. 8 (2), (2017).
  36. Carter, S. L., Eklund, A. C., Kohane, I. S., Harris, L. N., Szallasi, Z. A signature of chromosomal instability inferred from gene expression profiles predicts clinical outcome in multiple human cancers. Nature Genetics. 38 (9), 1043-1048 (2006).
  37. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA Websuite. Nucleic Acids Research. 36 (suppl_2), W70-W74 (2008).
  38. Wan, W. B., et al. Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages. Nucleic Acids Research. 42 (22), 13456-13468 (2014).
  39. Kanavarioti, A. HPLC methods for purity evaluation of man-made single-stranded RNAs. Scientific Reports. 9 (1), 1019 (2019).
  40. Zong, X., et al. Knockdown of Nuclear-Retained Long Noncoding RNAs Using Modified DNA Antisense Oligonucleotides. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs: Methods and Protocols. , 321-331 (2015).
  41. Zhao, M., et al. Lipofectamine RNAiMAX: An Efficient siRNA Transfection Reagent in Human Embryonic Stem Cells. Molecular Biotechnology. 40 (1), 19-26 (2008).
  42. . . Nuclear bodies and noncoding RNAs: methods and protocols. , (2015).
  43. CAWG Drivers and Functional Interpretation Group. Cancer LncRNA Census reveals evidence for deep functional conservation of long noncoding RNAs in tumorigenesis. Communications Biology. 3 (1), 56 (2020).
  44. Schmitt, A. M., Chang, H. Y. Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways. Cancer Cell. 29 (4), 452-463 (2016).
  45. Hosono, Y., et al. Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA. Cell. 171 (7), 1559.e20-1572.e20 (2017).
  46. Cho, S. W., et al. Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element. Cell. 173 (6), 1398.e22-1412.e22 (2018).
  47. Ding, W., Ren, J., Ren, H., Wang, D. Long Noncoding RNA HOTAIR Modulates MiR-206-mediated Bcl-w Signaling to Facilitate Cell Proliferation in Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  48. Huo, H., et al. Long non-coding RNA NORAD upregulate SIP1 expression to promote cell proliferation and invasion in cervical cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 106, 1454-1460 (2018).
  49. Prensner, J. R., et al. The Long Non-Coding RNA PCAT-1 Promotes Prostate Cancer Cell Proliferation through cMyc. Neoplasia. 16 (11), 900-908 (2014).
  50. Li, H., et al. Long noncoding RNA NORAD, a novel competing endogenous RNA, enhances the hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition to promote metastasis in pancreatic cancer. Molecular Cancer. 16, (2017).
  51. Li, Q., et al. High expression of long noncoding RNA NORAD indicates a poor prognosis and promotes clinical progression and metastasis in bladder cancer. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 36 (6), 310.e15-310.e22 (2018).
  52. Katayama, H., et al. Long non-coding RNA HOTAIR promotes cell migration by upregulating insulin growth factor-binding protein 2 in renal cell carcinoma. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  53. Ling, H., et al. CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24, underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer. Genome Research. 23 (9), 1446-1461 (2013).
  54. Lee, S., et al. Noncoding RNA NORAD Regulates Genomic Stability by Sequestering PUMILIO Proteins. Cell. 164 (1-2), 69-80 (2016).
  55. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  56. Iwamoto, N., et al. Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotides. Nature Biotechnology. 35 (9), 845-851 (2017).
  57. Naeem, M., Majeed, S., Hoque, M. Z., Ahmad, I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 9 (7), 1608 (2020).
  58. Vicente, M. M., Chaves-Ferreira, M., Jorge, J. M. P., Proença, J. T., Barreto, V. M. The Off-Targets of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Gene Editing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, (2021).
  59. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, e264 (2015).
  60. Shen, X., Corey, D. R. Chemistry, mechanism, and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1584-1600 (2018).
  61. Stein, C. A., Subasinghe, C., Shinozuka, K., Cohen, J. S. Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Research. 16 (8), 3209-3221 (1988).
  62. Crooke, S. T., Vickers, T. A., Liang, X. Phosphorothioate modified oligonucleotide-protein interactions. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5235-5253 (2020).
  63. Manoharan, M. 2′-Carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1489 (1), 117-130 (1999).
  64. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnology. 10 (1), 9 (2010).
  65. Bassett, A. R., et al. Considerations when investigating lncRNA function in vivo. eLife. 3, e03058 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

LncRNAs RNase H RNA DNA RFC4 PrEC HCT116

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved