نهج فقدان الوظيفة في شبكية العين الجنينية باستخدام التعبير الوراثي بوساطة Tol2 transposon للحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي

لقد طورنا نهجا جديدا لفقدان الوظيفة يتضمن إدخال تسلسل الحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي ودمجه الجينومي في أجنة الفرخ باستخدام التثقيب الكهربائي في البويضات ونظام ترانسبوزون Tol2. توفر هذه التقنية منهجية قوية ومستقرة لضربة قاضية للجينات لدراسات وظيفة الجينات أثناء التطوير.

لطالما كانت شبكية العين كتكوت نظاما نموذجيا مهما في علم الأعصاب التنموي ، مع مزايا تشمل حجمها الكبير وتطورها السريع وإمكانية الوصول إليها للتصور والتلاعب التجريبي. ومع ذلك، كان القيد التقني الرئيسي هو عدم وجود نهج قوية لفقدان الوظيفة لتحليل وظائف الجينات. يصف هذا البروتوكول منهجية إسكات الجينات في شبكية العين النامية التي تنطوي على التعبير الوراثي للحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي (miRNAs) باستخدام نظام Tol2 transposon. في هذا النهج ، يتم إدخال بلازميد Tol2 transposon الذي يحتوي على شريط تعبير لعلامة EmGFP (بروتين الفلورسنت الأخضر الزمردي) وتسلسلات اصطناعية قبل miRNA ضد جين مستهدف في شبكية العين الجنينية مع تعبير Tol2 transposase بناء بواسطة في التثقيب الكهربائي للبيض . في خلايا الشبكية المنقولة ، يحفز transposase استئصال كاسيت التعبير من ناقل transposon واندماجه في الكروموسومات المضيفة ، مما يؤدي إلى التعبير المستقر عن miRNAs وبروتين EmGFP. في دراستنا السابقة ، أثبتنا أن التعبير عن Nel ، وهو بروتين سكري يمارس وظائف متعددة في التطور العصبي ، يمكن قمعه بشكل كبير في شبكية العين النامية باستخدام هذه التقنية. تشير نتائجنا إلى أن هذه المنهجية تحفز قمعا مستقرا وقويا للتعبير الجيني وبالتالي توفر نهجا فعالا لفقدان الوظيفة لدراسات تطور الشبكية.

شبكية الفقاريات هي نظام نموذجي مهم لدراسة التطور العصبي. على الرغم من موقعها المحيطي ، فإن شبكية العين هي امتداد تشريحي وتنموي للجهاز العصبي المركزي ، ويمثل العصب البصري ، الذي يتكون من محاور عصبية لخلايا العقدة الشبكية ، مسلك داخل الجهاز العصبي المركزي. تتمتع شبكية العين بمزايا كبيرة كنظام نموذجي لدراسة الآلية الجزيئية للتطور العصبي: إنها كبيرة وتتطور بسرعة. لديها أوجه تشابه هيكلية ووظيفية مع شبكية العين البشرية. يمكن الوصول إليه بشكل كبير للتصور والتلاعب التجريبي. تمت دراسة الآليات الجزيئية لتكاثر الخلايا وتمايزها ، والتشكل ، وتوجيه المحور العصبي أثناء التطور العصبي على نطاق واسع باستخدام شبكية الدجاج.

تم استخدام التثقيب الكهربائي في البويضات بنجاح على مدى العقدين الماضيين لإدخال جينات خارج الرحم في الخلايا في جنين الفرخ النامي. تسمح هذه التقنية بوضع العلامات على الخلايا النامية ، وتتبع مصير الخلية ، وتتبع هجرة الخلايا والمسالك المحورية ، بالإضافة إلى التعبير الجيني خارج الرحم للتحليل في الجسم الحي لوظيفة الجينات. تم تأسيس شروط التثقيب الكهربائي في البويضة للتعبير الجيني خارج الرحم الفعال في أجنة الكتاكيت^{بشكل جيد 1}،^2،3.

على الرغم من هذه المزايا ، كان عدم وجود تقنية مستقرة لفقدان الوظيفة لدراسات وظيفة الجينات بمثابة قيد تقني رئيسي لجنين الفرخ. في حين أن أجنة الكتاكيت المكهربة بالحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNAs)⁴ أو ناقلات التعبير للحمض النووي الريبي قصير الدبوس (shRNAs)⁵ تظهر ضربة قاضية للجين المستهدف ، فإن قمع الجينات في هذه الأساليب عابر لأن التأثيرات تختفي بمجرد أن تفقد الخلايا الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي المدخل. يمكن تحقيق قمع جيني أكثر استقرارا عن طريق توصيل siRNAs إلى أجنة الكتاكيت بواسطة RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) التكرار الطرفي الطويل (LTR) مع مستقبل Splice) نظام الفيروس القهقري⁶. يندمج الناقل الفيروسي في جينوم المضيف ، ويتم التعبير عن الجينات خارج الرحم بثبات. ومع ذلك ، لا يمكن للفيروس القهقري الاندماج إلا في جينوم الخلايا المنقسمة خلال المرحلة الانقسامية (M) من دورة الخلية ، مما قد يفرض قيودا على مراحل النمو و / أو أنواع الخلايا التي يمكن تطبيق نهج فقدان الوظيفة عليها. بالإضافة إلى ذلك ، يبدو التعبير عن جينات التحوير بواسطة RCAS أبطأ وأقل قوة من ذلك الناجم عن التثقيب الكهربائي للبيض ⁷.

الترانسبوزونات هي عناصر وراثية تنتقل من موقع على الجينوم إلى آخر. عنصر Tol2 هو عضو في عائلة العناصر القابلة للنقل hAT ويحتوي على جين داخلي يشفر ترانسبوزاز يحفز تفاعل الترانسبوزون لعنصر Tol2⁸. عندما يتم إدخال ناقل البلازميد الذي يحمل شريط تعبير جيني محاط بتسلسل الطرفين الأيسر والأيمن لعناصر Tol2 (200 bp و 150 bp ، على التوالي) في خلايا الفقاريات مع بنية تعبير Tol2 transposase ، يتم استئصال كاسيت التعبير من البلازميد ودمجه في جينوم المضيف ، والذي يدعم تعبيرا مستقرا للجين خارج الرحم (الشكل 1). لقد ثبت أن عنصر Tol2 القابل للنقل يمكن أن يحفز نقل الجينات بكفاءة عالية في أنواع الفقاريات المختلفة ، بما في ذلك الزرد⁹،10 ، والضفادع¹¹ ، والكتاكيت 12 ، والفئران ¹³ ، وبالتالي فهي طريقة مفيدة للتحوير الجيني والطفرات الإدراجية. تم استخدام نظام ترانسبوزون Tol2 بنجاح للضربة القاضية الشرطية للجين المستهدف عن طريق التكامل الجيني ل siRNA الذي تتم معالجته من الحمض النووي الريبي¹⁴ الطويل المزدوج الشريط.

يصف هذا البروتوكول نهج فقدان الوظيفة في جنين الفرخ الذي يتضمن إدخال الحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي (miRNAs) بواسطة نظام Tol2 transposon^15,16. في هذا النهج ، يتم استنساخ شريط تعبير لعلامة EmGFP (بروتين الفلورسنت الأخضر الزمردي) و miRNAs الاصطناعية ضد الجين المستهدف في ناقل ترانسبوزون Tol2. ثم يتم إدخال بنية ترانسبوزون Tol2 في شبكية العين الجنينية مع بناء تعبير Tol2 transposase بواسطة التثقيب الكهربائي للبيض. في خلايا الشبكية المنقولة ، يحفز transposase استئصال كاسيت التعبير من ناقل transposon واندماجه في الكروموسومات المضيفة ، مما يؤدي إلى التعبير المستقر عن miRNAs وبروتين EmGFP. في دراساتنا السابقة ، نجحنا في التخلص من تعبير نيل ، وهو بروتين سكري خارج الخلية يتم التعبير عنه في الغالب في الجهاز العصبي ، في شبكية العين النامية (انظر النتائج التمثيلية). تشير نتائجنا إلى أنه يمكن تحقيق قمع الجينات المستقر والفعال في البويضات بهذه التقنية.

1. بناء متجهات تعبير miRNA

ملاحظة: تم تحسين إجراءات إنشاء متجهات تعبير miRNA (الخطوات 1.1-1.3 ، 1.5-1.6.) لمجموعة تعبير miRNA ، مجموعة تعبير Block-iT Pol II miR RNA مع EmGFP ، كما هو موضح سابقا^15،16. توفر المجموعة متجه التعبير المصمم للسماح بتعبير miRNA (pcDNA6.2-GW / EmGFP-miRNA) ، ومتجه تحكم (pcDNA6.2-GW / EmGFP-miRNA-بلازميد التحكم السلبي) ، وكواشف الملحقات ، وتعليمات لإنتاج متجهات تعبير miRNA (انظر جدول المواد) ¹⁷.

1. تصميم oligos DNA مفردة الشريط ترميز ما قبل miRNAs ضد الجين المستهدف: تصميم oligos الحمض النووي أحادي الشريط ("oligos الشريط العلوي" (الهدف قبل miRNAs) و oligos "الشريط السفلي" (مكملات oligos) حبلا علوي)) باستخدام الأداة عبر الإنترنت ، مصمم RNAi (انظر جدول المواد). انظر الشكل 2 للحصول على الميزات المطلوبة للأوليجوس أحادي الشريط (الشكل 2 أ) وأمثلة على التسلسلات المستهدفة (الشكل 2 ب).
   ملاحظة: يوصى بإنشاء 5-10 تسلسلات ما قبل miRNA لجين مستهدف معين وفحصها بحثا عن أنشطة ضربة قاضية في المختبر (الخطوة 1.4).
2. تلدين القلة العلوية والسفلية لتوليد أوليجو مزدوج تقطعت بهم السبل
   1. قم بإعداد تفاعل التلدين التالي (الجدول 1) في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 0.5 مل.
   2. احتضان خليط التفاعل على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. قم بتلدين oligos العلوية والسفلية لتوليد oligo مزدوج تقطعت بهم السبل عن طريق السماح لخليط التفاعل بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5-10 دقائق. أجهزة الطرد المركزي العينة لفترة وجيزة (~ 5 ثوان).
      ملاحظة: يمكن تخزين oligos الملدن في -20 درجة مئوية دون تحلل لمدة عام على الأقل.
3. استنساخ oligos مزدوجة الشريط في ناقل تعبير miRNA (pcDNA6.2-GW / EmGFP-miRNA (متوفر في مجموعة تعبير miRNA)): استنساخ oligos الفردية مزدوجة الشريط في متجه تعبير miRNA الخطي ، وفقا لدليل^{الشركة المصنعة 17}.
4. تقييم آثار ضربة قاضية
   ملاحظة: يوصى باختبار تسلسل miRNA الفردي لكفاءة قمع الجينات في المختبر قبل تطبيقها في البيض. يمكن اختبار كفاءة ضربة قاضية عن طريق نقل بلازميدات تعبير miRNA إلى خط الخلية الذي يعبر عن الجين المستهدف. بدلا من ذلك ، يمكن نقل بلازميدات تعبير miRNA الفردية إلى خطوط الخلية مع بناء تعبير للجين المستهدف. بالنسبة للجينات المستهدفة التي تشفر البروتينات غير المثبتة على الغشاء في حالتها الأصلية (على سبيل المثال ، البروتينات القابلة للذوبان) ، يمكن استخدام بروتين اندماج الفوسفاتيز القلوي (AP) لمراقبة التعبير عن البروتين المستهدف. يمكن دمج تسلسل cDNA الذي يشفر البروتين المستهدف في الإطار مع الفوسفاتيز القلوي المشيمي البشري في ناقلات علامة AP (APtag-1- APtag-5 ؛ انظر جدول المواد) وإدخاله في الخلايا¹⁸. عند التعبير عنه في خلايا المزرعة (على سبيل المثال ، خلايا HEK293T) ، يتم إفراز البروتين المستهدف الموسوم AP بمستويات عالية في وسط الثقافة ، وبالتالي يمكن تقييم تأثيرات ضربة قاضية لتسلسل miRNA عن طريق قياس الانخفاض في نشاط AP في وسائط الثقافة للخلايا المنقولة ب miRNA (الخطوات الفرعية 1.4.1-1.4.4).
   1. HEK293T المزرعة الخلايا في صفيحة 24 بئرا (8 × 10⁴ خلايا / بئر) طوال الليل. نقل الخلايا بشكل عابر مع بنى تعبير miRNA الفردية مع بلازميد تعبير لبروتين مستهدف موسوم ب AP. استخدم بلازميد التحكم السلبي pcDNA6.2-GW / EmGFP-miRNA (المتوفر في مجموعة تعبير miRNA) كعنصر تحكم. (إذا تم استخدام خطوط الخلايا التي تعبر بثبات عن بروتين مستهدف يحمل علامة AP ، فقم بنقل الخلايا فقط باستخدام تركيبات تعبير miRNA الفردية.)
      ملاحظة: يستخدم كاشف شفط الدهون التقليدي (انظر جدول المواد) للنقل.
   2. اجمع الوسط المكيف بعد 48-72 ساعة من النقل والحرارة تعطل نشاط AP الداخلي في حمام مائي بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الحطام المنبثق في جهاز طرد مركزي صغير لسطح المكتب بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق.
   3. قم بتخزين المادة الطافية مؤقتا باستخدام 10 mM HEPES ، ودرجة الحموضة 7.0 وتمريرها عبر مرشح 0.45 ميكرومتر.
   4. خذ 100 ميكرولتر (للقياس في قارئ اللوحة) أو 500 ميكرولتر (لمقياس الطيف الضوئي) من المادة الطافية وأضف كمية متساوية من المخزن المؤقت للركيزة 2x AP (الجدول 2). تحقق من نشاط AP عن طريق قياس OD₄₀₅ في قارئ لوحة أو مقياس الطيف.
      ملاحظة: إذا كان نشاط AP للوسط المكيف مرتفعا جدا بحيث لا يمكن قياسه بدقة ، فقم بتخفيفه باستخدام محلول ملح HBAH المتوازن (HBSS) ، 0.5 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار ، 20 mM HEPES (درجة الحموضة 7.0)) أو مخزن مؤقت آخر يحتوي على بروتين حامل. لا تستخدم المخازن المؤقتة المحتوية على الفوسفات (على سبيل المثال ، PBS) لأن الفوسفات غير العضوي يعمل كمثبط تنافسي ل AP.
5. تسلسل تسلسل miRNA
   ملاحظة: يمكن تعزيز تأثيرات ضربة قاضية عن طريق ربط miRNAs مختلفة ضد نفس الجين المستهدف أو تكرار نفس miRNA. يدعم متجه تعبير miRNA تسلسل تسلسلات متعددة قبل miRNA وتعبيرها المشترك¹⁷.
   1. سلسلة تسلسلين مختلفين لما قبل miRNA (ضد نفس الجين المستهدف) يظهران أعلى أنشطة ضربة قاضية في المقايسات المختبرية (الخطوة 1.4) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة¹⁷.
   2. تقييم كفاءة قمع الجينات للتركيبات المتسلسلة باستخدام المقايسات في المختبر كما هو موضح في الخطوة 1.4. إذا أظهرت ثلاثة أو أكثر من تسلسلات ما قبل miRNA أنشطة ضربة قاضية عالية مماثلة ، فاختبر مجموعات مختلفة من تسلسلين واستخدم المجموعات التي تظهر أعلى نشاط ضربة قاضية (انظر النتائج التمثيلية).
6. نقل كاسيت تعبير EmGFP-pre-miRNA إلى متجه ترانسبوزون Tol2
   ملاحظة: يتم نقل شريط التعبير الذي يحتوي على EmGFP cDNA وتسلسلين قبل miRNA إلى متجه ترانسبوزون Tol2 (متجه pT2K-CAGGS ، انظر جدول المواد). تحقيقا لهذه الغاية ، يتم تضخيم شريط التعبير (الذي يشمل من الطرف 3 'لمروج CMV إلى موقع التمهيدي للتسلسل العكسي miRNA لمتجه تعبير miRNA) باستخدام الاشعال مع موقع إنزيم تقييد اصطناعي ، ويتم استنساخ منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل في ناقل ترانسبوزون Tol2. يحتوي ناقل Tol2 transposon على مروج CAGGS في كل مكان ، والذي يقود تعبير شريط التعبير المدرج. يحيط بمروج CAGGS وشريط التعبير تسلسلات Tol2 (الشكل 1).
   1. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لشريط تعبير EmGFP-pre-miRNA: اتبع إعداد التفاعل وظروف التدوير الحراري الموضحة في الجدول 3.
   2. قم بربط منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى بالهلام (حوالي 1.3 كيلو بايت) في ناقل ترانسبوزون Tol2 المهضوم بالإنزيم. قم بتحويل البلازميد إلى خلايا E. coli المختصة (انظر جدول المواد) وحدد المواد المؤتلفة (تركيبات pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA).
   3. تحضير البلازميد باستخدام مجموعة maxiprep التقليدية (انظر جدول المواد). تحقق من بنية وتسلسل البلازميد عن طريق تعيين التقييد وباستخدام البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، على التوالي.

2. تخزين البيض والحضانة

1. شراء بيض White Leghorn (Gallus gallus) المخصب من المزارع المحلية أو البائعين التجاريين.
   ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالبيض عند 12-16 درجة مئوية أو عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل الحضانة دون فقدان كبير للحياة أو تأخير في النمو أثناء الحضانة.
2. قم بتسمية البيض بتاريخ بدء الحضانة وحدد الجانب العلوي من البويضة (حيث سيتم وضع الجنين). احتضان البويضات المخصبة في وضع أفقي عند 38 درجة مئوية حتى تصل الأجنة إلى مراحل هامبرغر وهاملتون (HH) 10 (33-38 ساعة) -11 (40-45 ساعة) ¹⁹.

3. في التثقيب الكهربائي للبيض

1. التحضير ل في التثقيب الكهربائي للبيض
   1. تحضير محلول أخضر سريع بنسبة 0.25٪: قم بإذابة 25 مجم من Fast Green FCF في 10 مل من PBS. قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. يمكن تخزين الحل في RT.
   2. كوكتيل الحمض النووي: قم بإعداد محلول الحقن عن طريق خلط بلازميدات pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA الفردية (الخطوة الفرعية 1.6.3) مع بلازميد تعبير Tol2 transposase (ناقل pCAGGS-T2TP ؛ انظر جدول المواد) (5 ميكروغرام / ميكرولتر لكل منهما) بنسبة 2: 1. أضف حجم 1/10 من محلول أخضر سريع 0.25٪ لتصور المنطقة المحقونة.
      ملاحظة: قد يختلف تركيز الحمض النووي الأمثل اعتمادا على البنيات.
   3. إعداد جهاز الحقن الدقيق (الشكل 3 أ ، ب): يتكون جهاز الحقن المجهري مما يلي (انظر جدول المواد): حقنة هاملتون ، إبرة 18 جم (طول الإبرة = 2 ") ، أنابيب PVC (كلوريد البولي فينيل) (بطول 2 سم) ، إبرة Micropipette (يمكن صنعها عن طريق سحب الأنابيب الشعرية بألياف أوميغا دوت (1 مم OD × 0.75 مم ID) باستخدام مجتذب micropipite).
      1. املأ حقنة هاميلتون بالزيت المعدني الثقيل. قم بتوصيل إبرة 18 جم بالمحقنة واملأ المساحة الداخلية للإبرة بالزيت عن طريق الضغط على مكبس المحقنة.
      2. قم بتوصيل قطعة من أنابيب PVC بطول 2 سم بنهاية الإبرة واملأ الأنبوب بالزيت.
      3. قم بتوصيل إبرة micropipette مسحوبة بالأنبوب. اقطع طرف إبرة الماصة الدقيقة إلى قطر 10-20 ميكرومتر بواسطة ملقط دقيق لعمل فتحة صغيرة. املأ الإبرة بأكملها بالزيت.
         ملاحظة: يجب الحرص على عدم حبس أي فقاعات هواء في النظام ، لأنها ستمنع تدفق محلول الحمض النووي.
   4. ضع 5 ميكرولتر من كوكتيل الحمض النووي الملون (الخطوة الفرعية 3.1.2) على طبق بتري معقم. تحت المجهر التشريحي ، ضع طرف إبرة الماصة الدقيقة في محلول الحمض النووي على طبق بتري المعقم وارسم المحلول ببطء في الإبرة.
   5. انتظر حتى يتوازن الضغط داخل الإبرة وخارجها (لتجنب دخول الهواء إلى الإبرة) وأخرج طرف الإبرة من محلول الحمض النووي. احتفظ بطرف الإبرة مغمورا في برنامج تلفزيوني معقم في دورق صغير حتى الحقن.
   6. إعداد جهاز التثقيب الكهربائي (الشكل 3 أ ، ج):
      1. اضبط زوجا من الأقطاب الكهربائية البلاتينية مع حامل قطب كهربائي على معالج دقيق. اضبط التباعد بين طرف الأقطاب الكهربائية إلى 2 مم (الشكل 3C ، E).
      2. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمولد نبضي ذو موجة مربعة بالكابلات (انظر جدول المواد).
2. الحقن المجهري لمحلول الحمض النووي (الشكل 3 د)
   1. أخرج بيضة دجاج من الحاضنة وامسح سطح البيضة بورق مناديل منقوع في 70٪ من الإيثانول.
   2. قم بتوصيل إبرة 18 جم بحقنة سعة 10 مل. أدخل الإبرة من خلال الطرف الحاد للبيضة ، بزاوية لأسفل (45 درجة) لتجنب إتلاف صفار البيض.
   3. سحب 2-3 مل من الألبومين من البيضة. ختم الحفرة بقطعة من شريط سكوتش. تأكد من فصل الجنين وغشاء vitelline عن القشرة عن طريق "تشميع" البويضة بالضوء.
   4. قم بإزالة قطعة من قشر البيض (دائرة قطرها 2-3 سم) من أعلى البيضة باستخدام المقص والملقط لكشف الجنين. لا تقم بنافذة أكثر من خمس بيضات في وقت واحد لمنع جفاف الأجنة أثناء التثقيب الكهربائي.
      ملاحظة: إذا كان من الصعب فتح نافذة دون تكسير البيضة ، فيمكن تغطية الجزء العلوي من البيضة بالكامل بشريط Sellotape أو Scotch قبل إزالة قطعة من قشر البيض.
   5. أدخل طرف الإبرة في الحويصلة البصرية من جانبها القريب بزاوية 45 درجة وقم بحقن كوكتيل الحمض النووي عن طريق الضغط ببطء (أو النقر على) المكبس حتى يملأ المحلول الأزرق اللون التجويف (الشكل 3 د).
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام نظام الحقن المجهري بالضغط (انظر جدول المواد) لحقن محاليل الحمض النووي.
   6. اسحب الإبرة وضع طرفها مرة أخرى في برنامج تلفزيوني.
3. التثقيب الكهربائي (الشكل 3E)
   1. اضبط معلمات النبض للجهاز الكهربائي على النحو التالي: الجهد: 15 فولت, طول النبض: 50 مللي ثانية, الفاصل الزمني للنبض: 950 مللي ثانية, رقم النبض: 5
   2. أضف بضع قطرات من HBSS على غشاء vitelline فوق الجنين. قم بخفض الأقطاب الكهربائية في HBSS باستخدام micromanipulator ، عموديا على المحور الأمامي الخلفي للجنين.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن إجراء هذا الإجراء دون إضافة HBSS ، لأن الألبومين موصل كهربائي جيد يسمح بالتثقيب الكهربائي بكفاءة.
   3. ضع الأقطاب الكهربائية على كلا الجانبين (الجانب الأمامي (الأنفي) والجانب الخلفي (الصدغي)) من الحويصلة البصرية (الشكل 3E). تأكد من أن الأقطاب الكهربائية لا تلمس الجنين أو الأوعية الدموية. تطبيق المجالات الكهربائية النبضية.
   4. قم بإزالة الأقطاب الكهربائية ونظف الأقطاب الكهربائية برفق باستخدام قطعة قطن معقمة مبللة بالماء لتجنب تراكم الألبومين.
   5. أغلق النافذة بشريط سكوتش وأعد احتضان الجنين حتى مرحلة النمو المطلوبة.

بناء ترانسبوزون Tol2 ترانسبوزون للتعبير عن miRNAs الاصطناعية ضد نيل
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF) -Like ؛ المعروف أيضا باسم Nell2) هو بروتين سكري خارج الخلية. لديها أوجه تشابه هيكلية مع thrombospondin-1 ويتم التعبير عنها في الغالب في الجهاز العصبي^20,21. لقد أثبتنا سابقا أن نيل ينظم تمايز وبقاء خلايا العقدة الشبكية¹⁵ ويعمل كإشارة توجيه مثبطة لمحاور الشبكية²²،^23،24. في شبكية العين النامية ، تم الكشف عن تعبير نيل في ظهارة الصباغ المفترضة في HH15 (اليوم الجنيني (E) 2.5). في HH20 (E3.5) ، لوحظ تعبير نيل أيضا في خلايا العقدة الشبكية المتمايزة حديثا. يستمر التعبير القوي عن نيل في ظهارة الصباغ وخلايا العقدة الشبكية على الأقل حتى E18¹⁵.

لفحص وظيفة Nel في تطوير خلايا العقدة الشبكية ، تم هدم التعبير عن جين Nel عن طريق إدخال miRNAs الاصطناعية في شبكية العين النامية باستخدام التثقيب الكهربائي في البويضة ونظام Tol2 transposon^15,16. أولا ، تم تصميم أزواج من oligonucleotides DNA أحادي الشريط ل 10 تسلسلات مستهدفة محتملة في منطقة ترميز البروتين في الدجاج Nel cDNA (رقم انضمام GenBank: NM_001030740.1) باستخدام أداة تصميم RNAi عبر الإنترنت (انظر جدول المواد). تم تلدين أزواج قليل النوكليوتيدات واستنساخها بشكل فردي في ناقل تعبير miRNA. بعد ذلك ، تم نقل التركيبات الفردية إلى خلايا HEK293T تعبر بثبات عن Nel-AP ، وتم تقييم كفاءاتها الضربة القاضية عن طريق قياس نشاط AP في وسائط الثقافة. تم استخدام بلازميد التحكم السلبي pcDNA6.2-GW / EmGFP-miRNA كعنصر تحكم (الشكل 4 أ).

تم اختيار ثلاثة تسلسلات Nel pre-miRNA التي أظهرت أعلى تأثيرات الضربة القاضية (ضد النيوكليوتيدات 482-502 و 910-930 و 2461-2481 من الدجاج Nel cDNA ، على التوالي) ، وتم استنساخ تسلسلين قبل miRNA جنبا إلى جنب في ناقل تعبير miRNA (pcDNA6.2-GW / EmGFP-2x Nel pre-miRNA) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة¹⁷. تم تضخيم أشرطة التعبير التي تشفر اثنين من pre-miRNA و EmGFP بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام موقع EcoRI اصطناعي على كلا الطرفين (5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ و 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′) واستنساخها في متجه pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). تم تأكيد تسلسل شريط التعبير باستخدام البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل. pT2K-CAGGS-EmGFP-2x تم نقل تركيبات Nel pre-miRNA بشكل فردي مع ناقل تعبير Tol2 transposase (pCAGGS-T2TP) إلى خلايا HEK293T التي تعبر بثبات عن Nel-AP ، وتم تقييم التأثيرات المثبطة على تعبير Nel-AP من خلال قياس أنشطة AP في وسائط الثقافة. كما هو موضح في الشكل 4 ب ، تم تعزيز كفاءة ضربة قاضية بشكل كبير من خلال تسلسل تسلسلين miRNA. لوحظ قمع قوي لتعبير Nel-AP (أكثر من 90٪) على الأقل حتى 13 يوما بعد النقل (الشكل 4B).

قمع مستقر لتعبير نيل في شبكية العين النامية
تم نقل بنية pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA (التي تحتوي على تسلسلات مستهدفة للنيوكليوتيدات 482-502 و 2461-2481 من الدجاج Nel cDNA) مع ناقل تعبير transposase (pCAGGS-T2TP) إلى الجانب الصدغي أو الأنفي من شبكية العين عن طريق التثقيب الكهربائي للبيض في HH9-11 (الشكل 3 ، الشكل 5A). تم تحضير المقاطع من شبكية العين E4.5 أو E8 ، وتم تقييم التأثيرات على تعبير Nel بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية باستخدام الجسم المضاد^{ل Nel 22}. في E4.5 ، انخفض تعبير Nel في ظهارة صبغة الشبكية بشكل كبير في الخلايا المعبرة عن EmGFP (الشكل 5B-D). في E8 ، لوحظ أيضا انخفاض في تعبير Nel بوضوح في خلايا العقدة الشبكية (الشكل 5E-I). استمر قمع كبير لتعبير Nel على الأقل حتى E18 (البيانات غير معروضة). لم يؤثر إدخال miRNA للتحكم على تعبير Nel في شبكية العين (الشكل 5J-O).

الشكل 1: تبديل الحمض النووي المكمل ب Tol2 بواسطة الترانسبوزاز. رسم تخطيطي يوضح تبديل شريط تعبير Tol2 محاط ب EmGFP وتسلسل تسلسلين قبل miRNA (2x قبل miRNA) بواسطة transposase. عندما يتم إدخال ناقل Tol2 transposon الذي يحتوي على كاسيت التعبير (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA construct) في الخلايا ذات بنية تعبير Tol2 transposase (pCAGGS-T2TP) ، يتم استئصال شريط التعبير Tol2 من المتجه ودمجه في جينوم المضيف بواسطة نشاط transposase. التعبير عن EmGFP و miRNAs مدفوع من قبل المروج في كل مكان CAGGS. تم تعديل هذا الرقم من ناكاموتو وآخرين ¹⁵. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: هيكل ما قبل miRNA الهندسي. (أ) يعتمد تسلسل ما قبل miRNA المصمم على تسلسل الفئران miR-155¹⁷. يحتوي oligo الشريط العلوي (من نهاية 5 'إلى نهاية 3' ) على أربعة نيوكليوتيدات متدلية (TGCT (أزرق)) ، تسلسل هدف مضاد للحساسية (21 نيوكليوتيدات) ، تسلسل حلقة طرفية (أحمر) ، وتسلسل هدف الإحساس (19 نيوكليوتيد). يمثل تسلسل الهدف المضاد للمعنى تتابع miRNA الناضج. يحتوي oligo الشريط السفلي على أربعة نيوكليوتيدات 5 'متدلية (CCTG (أزرق)) وتسلسل مكمل عكسي ل oligo الشريط العلوي ولكنه يفتقر إلى نتوء النيوكليوتيدات الأربعة في نهاية 3 '(AGCA-3': مكمل عكسي ل 5'-TGCT من oligo العلوي حبلا). يفتقر تسلسل الهدف الحسي إلى النيوكليوتيدات 9 و 10 من التسلسل المستهدف. تشكل النيوكليوتيدات "الإضافية" في تسلسل الهدف المضاد للإحساس حلقة داخلية في بنية الحلقة الجذعية لجزيء miRNA الناضج ، مما يؤدي إلى معدل ضربة قاضية أعلى¹⁷. (ب) مثال على التسلسل المستهدف ضد دجاج نيل. يتم عرض تسلسلات الإحساس ومضادات الإحساس في الخيوط العلوية والسفلية لتسلسل مستهدف لجين دجاج نيل (رقم انضمام بنك الجينات NM_001030740.1 ، النيوكليوتيدات 482-502). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: في الحقن المجهري للبيض والتثقيب الكهربائي. (أ) محطة عمل للحقن المجهري للبيض والتثقيب الكهربائي. (1) تشريح المجهر. (2) جهاز الحقن. (3) جهاز التثقيب الكهربائي. (4) إضاءة مجهر معقوفة مزدوجة. (5) كهربائي. ب: جهاز الحقن. يتم توصيل حقنة هاملتون (6) بإبرة 18 جم (7) بأنابيب PVC (8) وإبرة ماصة مسحوبة (9) وتوضع على مناور دقيق (10). تمتلئ المساحة الداخلية للجهاز بالزيوت المعدنية الثقيلة. ج: جهاز التثقيب الكهربائي. يتم تعيين مجموعة من الأقطاب الكهربائية البلاتينية (11) مع حامل قطب كهربائي (12) على micromanipulator (13). يتم توصيل الأقطاب الكهربائية بالكهرباء باستخدام الكابلات (14). د: الحقن المجهري لمحلول كوكتيل الحمض النووي في الحويصلة البصرية عند HH 10-11. يتم إدخال إبرة الماصة الدقيقة المسحوبة في الحويصلة البصرية من جانبها القريب. يتم حقن محلول كوكتيل الحمض النووي مع الأخضر السريع (الأزرق) في الحويصلة البصرية حتى تملأ الصبغة التجويف بأكمله. ه: التثقيب الكهربي في الحويصلة البصرية. يتم وضع الأقطاب الكهربائية بالتوازي (المسافة بين الأقطاب الكهربائية 2 مم) وبطريقة بحيث تقع الحويصلة البصرية المحقونة بين الأقطاب الكهربائية: يقع أحد القطبين بالقرب من السطح الأمامي (الأنفي) للحويصلة البصرية ، والآخر في الجزء الخلفي من الجنين على مستوى الدماغ الخلفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التقييم في المختبر لتسلسلات ما قبل miRNA الفردية أو المتسلسلة لكفاءة قمع الجينات Nel. (أ) تأثيرات ضربة قاضية لتسلسلات فردية قبل الحمض النووي الريبوزي المرسال. تظهر نتائج خمسة تركيبات تمثيلية (تسلسلات هدف Antisense المقابلة لأرقام النوكليوتيدات 482-502 و 910-930 و 1106-1126 و 1663-1683 و 2461-2481 من الدجاج Nel cDNA (رقم انضمام GenBank: NM_001030740.1)). تم نقل تركيبات تعبير miRNA الفردية (pcDNA6.2-GW / EmGFP-Nel pre-miRNA) إلى خلايا HEK293T تعبر بثبات عن Nel-AP. تم استخدام بلازميد التحكم السلبي pcDNA6.2-GW / EmGFP-miRNA كعنصر تحكم. تم تقييم التعبير عن Nel-AP من خلال قياس أنشطة AP في وسائل الإعلام الثقافية بعد 48-96 ساعة من النقل. أظهرت ثلاثة تركيبات تعبير Nel pre-miRNA (ضد النيوكليوتيدات 482-502 و 910-930 و 2461-2481 على التوالي) قمعا كبيرا لتعبير Nel. (ب) تأثيرات ضربة قاضية لتسلسلات ما قبل الحمض النووي الريبوزي المرسال بالسلاسل. تم استنساخ اثنين من أقوى ثلاثة تسلسلات ما قبل miRNA (ضد النيوكليوتيدات 482-502 و 910-930 و 2461-2481) جنبا إلى جنب في متجه pcDNA6.2-GW / EmGFP-miR ، وتم نقل شريط التعبير (الذي يحتوي على تسلسلين ما قبل miRNA و EmGFP cDNA) إلى ناقل pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). تم نقل تركيبات pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA بشكل فردي مع متجهات التعبير ل Tol2 transposase (pCAGGS-T2TP) إلى خلايا HEK293T تعبر بثبات عن Nel-AP ، وتم تقييم تعبير Nel-AP عن طريق قياس أنشطة AP في وسط الثقافة من 2 إلى 13 يوما بعد النقل. أظهرت جميع المجموعات الثلاث (482-502 / 910-930 ، 482-502 / 2461-2481 ، 910-930 / 2461-2481) أنشطة قمع محسنة مقارنة بتسلسلات ما قبل miRNA الفردية غير المقيدة. لوحظ قمع كبير لتعبير Nel-AP من اليوم 2 إلى اليوم 13 على الأقل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: ضربة قاضية مستقرة لتعبير نيل في شبكية العين النامية عن طريق التكامل بوساطة Tol2 transposon لجين miRNA التحوير. بنية ترانسبوزون Tol2 تحتوي على شريط تعبير لتسلسلين من تسلسل Nel pre-miRNA و EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) أو بنية تحكم تعبر عن miRNA غير ذي صلة و EmGFP (J-O) تم نقلها بشكل مشترك مع ناقل تعبير transposase (pCAGGS-T2TP) إلى النصف الصدغي أو الأنفي من الحويصلة البصرية بواسطة البويضة التثقيب الكهربائي في HH9-HH11 (E1.5). تم تحضير أقسام الشبكية عند E4.5 (B-D ، J-L) أو E8 (E-I ، M-O) ، وتم فحص كفاءة قمع جين Nel بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية باستخدام الأجسام المضادة ل Nel (الأحمر). نظرا لأن الحمض النووي سالب الشحنة ، يتم تحويل جينات التحوير بالكهرباء إلى الأنسجة الموجودة على جانب الأنود. وبالتالي ، تم تصنيف نصف شبكية العين فقط ب EmGFP (جانب النقل (TF) ، أخضر). أ: التعبير عن جين علامة EmGFP في النصف الصدغي من الشبكية عند E4.5. يمثل الشق البصري (السهم الأبيض) الحد الفاصل بين الجوانب المنقولة وغير المنقولة (التحكم). (ب-ط) ضربة قاضية RNAi لتعبير نيل في شبكية العين النامية. (ب-د) في E4.5 ، يتم تقليل تعبير Nel بشكل كبير (B ، D) في خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (PE) التي تعبر عن EmGFP (C ، D). لاحظ النمط التكميلي للتلطيخ المناعي لنيل وتعبير EmGFP في D. NR ، شبكية العين العصبية. (E-I) في E8 ، ينخفض تعبير Nel (E ، G) في ظهارة صبغة الشبكية وطبقة الخلايا العقدية (GCL) على جانب النقل (F ، G). (ح، أنا) مناظر تكبير أعلى لمنطقة نقل ومنطقة تحكم مقابلة في E (يشار إليها بمستطيلات صغيرة) ، على التوالي. (د، ز) دمج الصور من الصورتين الأيسرتين. (J-O) التعبير عن السيطرة miRNA. لا يؤثر إدخال بنية التحكم السلبي على تعبير Nel في شبكية العين E4.5 (J-L) أو E8 (M-O). (L,O) دمج الصور من الصورتين الأيسرتين. يشار إلى الحد الفاصل بين جانبي النقل والتحكم بخط منقط في أشرطة المقياس C و F و K و N. ، 50 ميكرومتر. تم تعديل (A) و (B-I) من Nakamoto و M. & Nakamoto و C 16 و Nakamoto et^al.15 على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: إعداد تفاعل التلدين

الجدول 2: 2x AP الركيزة العازلة. يجب تخزين المحلول في القسمة عند -20 درجة مئوية وحمايته من الضوء لأن p-nitrophenylphosphate حساس للضوء.

الجدول 3: إعداد التفاعل وظروف التدوير الحراري.

يوفر هذا البروتوكول دليلا مفصلا لإسكات الجينات في شبكية العين النامية عن طريق التعبير المعدل وراثيا عن miRNAs الاصطناعية باستخدام التثقيب الكهربائي للبيض ونظام Tol2 transposon.

العوامل التالية لها أهمية حاسمة في أداء هذه التقنية بنجاح. أولا ، من الأهمية بمكان استخدام تسلسلات miRNA التي تم تأكيدها لممارسة تأثيرات ضربة قاضية قوية. قبل تطبيقها على التثقيب الكهربائي في البويضة ، اختبر تسلسلات ما قبل miRNA الفردية لكفاءة قمع الجينات في المقايسات المختبرية (الخطوة 1.4) وسلسلة تسلسلين قبل miRNA يظهران أعلى أنشطة ضربة قاضية (الخطوة 1.5). ثانيا ، من المهم عدم إتلاف الحويصلة البصرية والأنسجة العصبية المحيطة عند إدخال إبرة الماصة الدقيقة لحقن محلول الحمض النووي. يمكن أن يؤدي الضرر المفرط للأجنة إلى تشوه الجنين والموت. لتجنب تلف الأنسجة ، أدخل الماصة الدقيقة في الحويصلة البصرية في الاتجاه الصحيح. من شأن الأطراف الأصغر والأكثر حدة لإبرة الماصة الدقيقة أن تجعل اختراق الحويصلة البصرية أكثر سلاسة وتؤدي إلى تلف أقل للأنسجة. ومع ذلك ، فإن الإبر ذات النصائح الصغيرة جدا تواجه صعوبة في تحميل وإطلاق محلول الحمض النووي. في الدراسة الموصوفة هنا ، تم استخدام الإبر ذات فتحة طرف قطرها 10-20 ميكرومتر. ثالثا ، تأكد من ملء الحويصلة البصرية بأكملها بمحلول الحمض النووي (كما هو موضح في انتشار اللون الأخضر السريع). رابعا ، ضع الأقطاب الكهربائية في المواضع المثلى لاستهداف الحمض النووي في المنطقة المرغوبة من الحويصلة البصرية (على سبيل المثال ، الجانب الصدغي ، الجانب الأنفي). ستتحرك جزيئات الحمض النووي سالبة الشحنة نحو جانب الأنود ؛ لذلك فإن الموضع الدقيق وتوجيه الأقطاب الكهربائية يؤثر بشكل كبير على النتائج النهائية. أخيرا ، استخدم تركيزات الحمض النووي المثلى ومعلمات التثقيب الكهربائي.

إذا لم يتم ملاحظة أي إشارة فلورية بعد 24 ساعة من التثقيب الكهربائي ، فيجب مراعاة ما يلي: (1) تأكد من أن البلازميدات المكهربة لها تسلسلات صحيحة. (2) إعادة فحص تركيز ونقاء البلازميدات الفردية. (3) تأكد من أن محلول الحمض النووي يملأ تجويف الحويصلة البصرية ولا ينتشر بعيدا في الأنبوب العصبي. (4) تحقق من صحة معلمات التثقيب الكهربائي المستخدمة. (5) تأكد من أن الأقطاب الكهربائية على اتصال بغشاء vitelline أثناء تطبيق النبضات الكهربائية.

يوفر الجمع بين التثقيب الكهربائي في البويضة وطريقة تكامل الجينات بوساطة الترانسبوزون في هذا البروتوكول العديد من المزايا المميزة. أولا ، يدعم الإنتاج المستقر لل miRNAs وبالتالي القمع المستمر للجينات المستهدفة. يبدأ تطور شبكية العين عند E1.5 ويستمر حتى الفقس (يتم إنتاج خلايا العقدة الشبكية خلال الفترة من E2 إلى E9). لتحليل فقدان وظيفة الجين ، يجب الحفاظ على التعبير عن miRNAs الاصطناعية بثبات خلال هذه الفترة. التعبير عن تتابعات RNAi باستخدام متجهات التعبير التقليدية عابر بشكل عام لأن بنية التعبير تفشل في الاندماج بكفاءة في الكروموسومات. ومع ذلك ، في الطريقة الموضحة هنا ، يتم التوسط في التكامل الكروموسومي لتعبير الكاسيت من خلال نشاط transposase المصاحب كهربائيا ، مما ينتج عنه تعبير مستقر لجينات التحوير.

ثانيا ، في هذه الطريقة ، يحفز نفس مروج CAGGS التعبير المشترك للسيرونيك لتسلسلات miRNA المتعددة وعلامة EmGFP في الخلايا المنقولة ، وبالتالي التحايل على خطر تدخل المروج ، وهو أحد المضاعفات الشائعة مع النواقل الفيروسية القهقرية التي تحتوي على اثنين من المروجين لتحقيق التعبير الجيني^{المزدوج 25}.

أخيرا ، على عكس ناقلات الفيروسات القهقرية ذات الكفاءة المتماثلة ، لا يتم نقل جين التحوير الذي يتم كهربه بهذه الطريقة إلى الخلايا المجاورة. لذلك ، يمكن التحكم في منطقة النقل بشكل أكثر دقة باستخدام الأنواع المناسبة من الأقطاب الكهربائية ووضعها في المواضع الصحيحة.

على الرغم من المزايا الموضحة أعلاه ، فإن الطريقة الحالية لها أيضا قيود متأصلة في التثقيب الكهربائي للبيض . على سبيل المثال ، قد تختلف معدلات النقل وقمع الجينات بين الأجنة ، وقد يحتاج عدد كبير نسبيا من الأجنة إلى نقلها لتحليلها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التثقيب الكهربائي في شبكية العين الجنينية في البويضة في مراحل النمو اللاحقة (على سبيل المثال ، E4-E5) له صعوبات تجريبية لأن العينين تقعان على مقربة من القلب في تلك المراحل ، مما يزيد من خطر السكتة القلبية بعد التثقيب الكهربائي.

يسمح النظام الموصوف هنا بقمع الجينات بسرعة وقوة في شبكية العين النامية. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج على أجزاء أخرى من جنين الفرخ ، بما في ذلك الأنسجة العصبية وغير العصبية. لذلك ، نتوقع أن يساهم هذا النظام في توضيح الآليات الجزيئية لتطور الفرخ.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تم توفير نواقل pT2K-CAGGS و pCAGGS-T2TP من قبل يوشيكو تاكاهاشي (جامعة كيوتو ، كيوتو ، اليابان) وكويتشي كاواكامي (المعهد الوطني لعلم الوراثة ، ميشيما ، اليابان) ، على التوالي. نشكر مايكل بربر أوغلو على قراءته الحاسمة للمخطوطة. تم دعم هذا العمل بمنح من الجمعية الملكية ومجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BBSRC) (المملكة المتحدة) إلى M.N.