Nöroanatomik Analizler için Tüm Marmoset Beyninin Seri İki Fotonlu Tomografisi

Araştırmamız, insanlarda olanlar da dahil olmak üzere beyin fonksiyonlarının yapısal temelini araştırıyor. Ortak marmoseti bir model olarak kullanarak, türler arasında paylaşılan sinirsel bağlantıları ve primat cinsinin benzersiz bir şekilde dışında olanları belirleyerek primat beynini daha iyi anlamayı amaçlıyoruz. Marmoset beyninin prefrontal projeksiyonlarının kapsamlı bir haritasını çıkardık.

Seri iki fotonlu tomografi tekniğini kullanarak, tüm beynin son derece hassas 3D rekonstrüksiyonunu başardık ve bu da ilişkilendirme alanları arasında sağlam sütunlu projeksiyonlar ortaya çıkardı. Seri iki fotonlu tomografi, tüm beyin ölçeğinde nöral bağlantıyı anlamak için bir veri seti sağlar. Protokolümüz sadece marmoset beyinlerinin işlenmesini iyileştirmeye yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda diğer örneklerin işlenmesine ilişkin içgörüler de sunar.

Başlamak için, izole, sabit marmoset beynini alın ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede kollajenaz ile inkübe edin. Pamuklu bir bez kullanarak, pia mater ve diğer meninksleri soymak için beyin yüzeyini dikkatlice ovalayın. Kalan ayrılmış meninksleri çıkarmak için ince forseps kullanın.

Sodyum borhidrür tamponunu hazırlamak için, 0.2 gram sodyum borhidrürü 100 mililitre 50 milimol borat tamponunda çözün, önceden 40 santigrat dereceye ısıtın. 2.25 gram agaroz ve 0.21 gram sodyum periodatı 100 mililitre fosfat tamponunda iki ila üç saat karıştırarak oksitlenmiş agaroz hazırlayın. Çözeltiyi vakum emme kullanarak süzün ve üç değişiklik fosfat tamponu ile yıkayın.

Daha sonra, agarozu 50 mililitre fosfat tamponu içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, agarozu bir mikrodalga fırında tamamen eritin ve 60 ila 65 santigrat dereceye kadar soğumaya bırakın. Beyni özel yapım bir odaya yerleştirin ve beyni agarozun içine gömün, agarozun korpus kallozumun altındaki boşluğu doldurduğundan emin olun.

Agaroz jelin katılaşmasından sonra, hazneyi sökün ve agaroz bloğunu gece boyunca dört santigrat derecede sodyum borohidrür tamponuna daldırın. Şimdi, bir epoksi anında karışım kullanarak, dört neodimyum mıknatıs takarak bir sürgülü cam sahne oluşturun. Güçlü bir yapıştırıcı kullanarak agaroz bloğunu sahneye monte edin.

Tüm doku görüntüleme sistemini üreticinin talimatlarına göre çalıştırın. Tüm marmoset beynini koronal olarak anteriordan posterior uçlara doğru işleyin. Ardından, her iki uçtaki yüzey derinliklerinin 10 mikrometre içinde olduğundan emin olmak için bıçak açılarını ayarlayın.

Bunu yapmak için, piezo denetleyiciyi kullanarak hedefin konumunu değiştirerek üst yüzeyi arayın. Yoğun miyelinasyonu telafi etmek ve düzgün lazer penetrasyonu sağlamak için görüntüleme düzlemini yüzeyden yaklaşık 25 ila 35 mikrometre yüksekliğe ayarlayın. Seramik bir bıçak kullanarak, tüm beyni 50 mikrometre aralıklarla kesin ve yaklaşık 650 dilim elde edin.