Perfüze kalplerde ani intrinsik otonomik nöron aktivasyonunun kinetiğini ve kardiyak katekolaminerjik ve kolinerjik aktivite arasındaki etkileşimi araştırmak için değerli bir deneysel yaklaşım sunuyoruz. Perfüze fare kalpleri, sıcaklık, oksijenasyon ve perfüzat konsantrasyonu gibi ortamdaki değişikliklere karşı çok hassas olabilir. Daha büyük hayvan modellerinden daha yakından izleme gerektirirler.
Ek olarak, mikro LED, tutarlı sonuçlar elde etmek için ilk başta biraz deneme yanılma yapabilir. Sempatik ve parasempatik sistemler aynı anda aktive olduğunda kalpte neler olduğunu anlamak için çalışıyoruz. Yeni olan şey, kalbin içindeki kardiyak gangliyonları ve nöronları fotostimülasyon yapmak için optogenetik kullanarak bu konuyu inceliyor olmamızdır.
Burada gösterilen mikro LED düşük maliyetlidir ve kopyalanması nispeten basittir. Boyutu nedeniyle, mikro LED manevra kabiliyetine sahiptir ve kalbin bölgelerini daha büyük ışık kaynaklarından daha hassas bir şekilde hedefleyebilir. Başlamak için, iyi havalandırılan bir alanda diseksiyon mikroskobu altında, iki yalıtılmış bakır telin soyulmuş uçlarını 465 nanometrelik bir mikro LED'in temas noktalarına lehimleyin.
Mikro LED'i bir güç kaynağına bağlayın ve lehimlemeyi test etmek için açın. 200 mikrolitrelik filtreli pipet ucunun altını bir santimetre kesin. Küçük çaplı bir çubuk kullanarak filtreyi dışarı itin.
Mikro LED'i, bağlı kablolarla birlikte pipet ucuna, LED ucun ucuyla aynı hizada olacak şekilde yerleştirin. LED'i ve kabloları sabitlemek için pipet ucunun üst kısmındaki filtreyi yerine yerleştirin. Ardından LED'in kenarlarını pipet ucuna yapıştırın.
Süper yapıştırıcının kurumasını bekleyin. Silikon elastomer hazırlamak için, çözelti homojen hale gelene kadar baz ve kürleme maddesini karıştırın. Bir vakum odası kullanarak karışımdaki kabarcıkları çıkarın.
Ardından, 0,5 mililitrelik bir santrifüj tüpü alın ve LED'in çıkarılmasını kolaylaştırmak için yanları çizin. Sızıntıyı önlemek için santrifüj tüpünün dışını bantlayın. Tüpe yaklaşık 0,2 mililitre silikon elastomer dökün.
Mikro LED pipet ucunu, LED ile tüpün tabanı arasında en az bir milimetre boşluk olacak şekilde tüpe yerleştirin. Santrifüj tüpü mikro LED'i sekiz saat veya gece boyunca 50 derecelik bir fırına dik olarak yerleştirin. Elastomer sertleştikten sonra LED'i tüpten çıkarın.
Sertleştikten sonra, LED ucundaki fazla elastomeri hassas bir maket bıçağıyla bir milimetreden fazla kalmayacak şekilde kesin. Başlamak için, perfüzyon sistemine 175 mililitre Krebs-Henseleit veya KH çözeltisi ekleyin. Langendorff perfüzyon sistemine 10 mikrometrelik bir membran filtre yerleştirin.
Ardından dolaşıma başlayın. Su banyolarını açın ve perfüzat sıcaklığını 37 santigrat derecede tutacak şekilde ayarlayın. Akış ölçeri kalibre etmek için, bir vana kullanarak perfüzyon sistemindeki akışı durdurun.
Ardından kalibrasyonu gerçekleştirmek için debimetre üzerindeki sıfır düğmesine basın. LabChart veri toplama yazılımını açın. Yazılımı 12 kanal içerecek şekilde yapılandırın.
Kalp banyosu sıcaklığı, aort perfüzat sıcaklığı, ek hesaplanmış kablolar için bir ila üç EKG kablosu, kalp atış hızı hesaplaması, akış hızı ve LED darbelerini izlemek için bir fonksiyon üreteci çıkışı için kanallar ayarlayın. Ardından, kalp atış hızını hesaplamak için kalp atış hızı için belirlenmiş kanalı kullanın. Döngüsel ölçümler özelliğini etkinleştirin ve birinci kurşundaki fare EKG'sini algılayacak şekilde ayarlayın.
Birinci ve ikinci müşteri adaylarına göre üç aVR, aVL ve aVF müşteri adaylarını hesaplamak için LabChart'ın Kardiyak Erişim uzantısını kullanın. Fareyi uyuşturduktan ve ötenazi yaptıktan sonra, ksifoid işlemini bir çift forseps ile tutun ve cerrahi makas kullanarak karın boşluğuna kesin. Göğüs boşluğunu açmak için diyaframı dikkatlice kesin.
Ardından kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için kaburgaları kesin. Akciğerleri nazikçe tutun ve kalbi ve akciğerleri çıkarın. Kalbi heparinize KH çözeltisi içeren bir tabağa yerleştirin.
Akciğerleri ve büyük yağ birikintilerini çıkarın. Diseksiyon mikroskobu altında, 2x büyütmeye ayarlayın. Temizlenmiş kalbi ikinci bir heparinize KH çözeltisi kabına aktarın.
Aortu bulun ve ince forseps kullanarak kanül üzerinde kaydırın. 4-0 ipek dikiş ile kalbi kanüle sabitleyin. Daha sonra, koroner damarlardan kanı çıkarmak için kanülü bir heparinize KH bolusu ile yıkayın.
Kanüllü kalbi perfüzyon sistemine bağlayın ve perfüzatla doldurulmuş PDMS kabına yerleştirin. EKG iğne elektrotlarını Einthoven üçgenine göre PDMS kabına yerleştirin. Kalbi, sol atriyum erişilebilir olacak şekilde döndürün.
Sol atriyumda bir milimetrelik bir kesi oluşturmak için mikro kendiliğinden açılan makas kullanın. Sol ventrikülde sıkışan perfüzatın boşalmasını sağlamak için insizyona bir milimetre çapında bir tüp yerleştirin. Ardından, kalbi döndürün, böylece sağ atriyum yukarı bakacak ve sinoatriyal düğüm aydınlatma için erişilebilir olacaktır.
Sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için EKG elektrotlarını kalbe yaklaştırarak gerektiği gibi ayarlayın. Optogenetik aktivasyon için, mikro LED cihazını bir fonksiyon üretecine bağlayın ve 10 hertz frekansında, 30 milisaniye darbe genişliğinde ve tepeden tepeye 10 volt genlikte darbe dalgaları üretecek şekilde yapılandırın. Mikro LED'i nazikçe sinoatriyal düğüme yerleştirin.
Ardından fonksiyon üretecini açın ve fotostimülasyondan kaynaklanan kalp atış hızındaki değişiklikleri gözlemleyin. Kalp atış hızındaki ani değişiklikler etkili aktivasyonu gösterir. İşlev oluşturucuyu kapatın.
Kalp atış hızının aktivasyon öncesi seviyelere dönmesine izin verin. Optogenetik aktivasyon 100 BPM'den daha az bir kalp atış hızı değişikliğine neden olursa, sağ atriyumdaki nöronları aydınlatmak için mikro LED'i yeniden konumlandırın. ChAT nöronlarının optogenetik stimülasyonu, norepinefrin olmadan ışık stimülasyonu sırasında kalp atış hızını 100 BPM'nin üzerinde azalttı ve stimülasyon boyunca azalmayı sürdürdü.
2.000 nanomol norepinefrin ile kalp atış hızı 40 BPM düştü ve ışık kapatılmadan önce iyileşmeye başladı. ChAT nöron fotostimülasyonu ile kalp atış hızının optogenetik olarak baskılanması, yüksek norepinefrin dozlarının neden olduğu kalp atış hızı artışlarının üstesinden gelmede daha az etkiliydi, bu da daha kısa baskılama süreleri ve kalp hızında daha küçük düşüşler ile sonuçlandı.
