Sabit hücrelerin floresan mikroskopi görüntülerinde mitokondrileri analiz etmek için simülasyon denetimli bir makine öğrenme aracının kullanımını gösteriyoruz. Mikroskopi görüntülerinde mitokondrileri segmentlere ayırmak için mevcut yöntemler, Ostu veya manuel segmentasyon gibi otomatik eşik tabanlı yöntemleri içerir. Eşik tabanlı teknikler, sinyal-arka plan oranının düşük olduğu yerlerde düşük performans gösterir.
Tipik olarak, morfolojik analiz için görüntüler çok sayıda mitokondri içerir ve bu da manuel segmentasyonu sıkıcı hale getirir. Denetimli derin öğrenme yöntemleri, segmentasyonu yüksek doğrulukla gerçekleştirir, ancak eğitim için çok sayıda girdi temel-doğruluk çifti verisi gerektirir. Bu yaklaşım, mikroskopi görüntüleri çiftleri ve bunların 2D yer-doğruluk şekil maskesini oluşturmak için fizik tabanlı bir simülatör kullanır, böylece manuel ek açıklama ihtiyacını ortadan kaldırır.
Simüle edilmiş görüntüler üzerinde eğitilen model daha sonra gerçek mikroskop görüntülerinde mitokondrileri segmentlere ayırmak için kullanılır. Bu görevin yüksek doğrulukla otomatikleştirilmesini sağlayan ve eğitim için açıklamalı bir temel doğruluk veri kümesi gerektirmeyen derin öğrenme tabanlı bir segmentasyon aracı kullanıyoruz. Simülasyon, şekil oluşturma için parametrik eğriler kullanarak geometri oluşturma ile başlar.
Yayıcılar eşit olarak dağıtılır ve üretilen şeklin yüzeyine, yoğunluk deneysel değerlerle eşleşecek şekilde rastgele yerleştirilir. Mikroskobun 3D PSF'si Gibson-Lanni modeli kullanılarak hesaplanır. Simüle edilmiş görüntüler ve deneysel görüntüler arasında fotogerçekçilik elde etmek için, hem karanlık hem de çekim seslerini taklit ediyoruz.
Fizik temel-gerçeği, ikili bir harita şeklinde üretilir. CCCP tedavisinin konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenen sabit kardiyommiyoblastların mitokondri morfolojisi üzerindeki etkisini değerlendiriyoruz. Hücre kültürü.
Steril bir laminer akış davlumbazında çalışan hücreleri, 12 kuyucuklu bir kuyucuk içine her deneysel durum için bir kapak kayması yerleştirerek tohumlamaya hazırlanın. Her bir kuyucuğa uygun hacmi dağıtmadan önce santrifüj tüpünün içeriğini birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek seyreltilmiş hücre süspansiyonunun düzgün bir şekilde karıştırıldığından emin olun. Deneysel prosedür.
12 kuyucuklu plakanın kuyucuklarından hücre kültürü ortamını aspire edin, ardından kontrol kuyularına ve önceden ısıtılmış ortama 10 mikromolar CCCP çözeltisi ile önceden ısıtılmış taze medyayı test durumu kuyularına hızlı bir şekilde uygulayın. 37 Santigrat hücre inkübatöründe iki saat boyunca inkübe edin. Hücre kültürü ortamını kuyucuklardan aspire edin ve önceden ısıtılmış fiksasyon çözeltisini uygulayın.
Hücrelerin örtü kaymalarına boyanması ve monte edilmesi. Bir kapak kayması monte etmek için hazırlanmış bir cam slaydına 10 mikrolitrelik montaj ortamı ekleyin. Cımbız kullanarak kapak kaymasını 12 kuyucuklu plakadan alın ve kenara ve kapağın arkasına hazırlanan tiftik içermeyen kağıt havluya kısa bir süre dokunarak kapak kaymalarından nemi alın.
Montaj ortamının bekleyen damlacığı üzerindeki kapak kaymasını yavaşça indirin. Mikroskop ve görüntüleme. Okülerleri kullanarak, numunenin odaklanması için Z seviyesini manuel olarak ayarlayın.
Yazılım içinde edinilen sekmeye geçin. Görüntüleme için kullanılacak floresan kanalını seçmek için akıllı kurulumu kullanın. Kapak kapağının ortasında ortalanmış dizi, görüntülenecek toplam 12 pozisyon ile.
RA'yı kapak kaymasının ortasına ortalanmış olarak konumlandırın. Birden fazla konumu otomatik bir şekilde görüntülemek mümkündür. Simüle edilmiş eğitim verileri oluşturma.
Kodu indirin ve içeriği açın. Yönergeleri izleyin ve ortamı ayarlamak için benioku adımlarını izleyin. src"Bir kopya oluşturun veya 2 klasörünü kullanın.
mitokondri simülasyonu havadar"ve yeniden adlandırın. Bu klasör, eğitim verilerinin simülasyonuyla ilgili tüm dosyaları içerir. Simülasyon için ayarlanacak üç parametre kümesi vardır.
İlk olarak, toplu yapılandırma dosyasında simülatör için mitokondri sayısı, çap aralığı, Z ekseni aralığı ve florofor yoğunluğu parametrelerini ayarlayın. Ardından, dosya mikroskobuPSFmode'da sayısal diyafram, büyütme ve veri kümesinin minimum dalga boyunun optik parametrelerini ayarlayın. py"Yangın generate_batch_parallel piksel boyutu ve emisyon dalga boyu için istenen değeri ayarlayın.
py"Çıktı görüntülerinin boyutu, her görüntüdeki kutucuk sayısı ve dosya generate_batch_parallel toplam görüntü sayısı gibi çıktı veri kümesiyle ilgili üçüncü parametre kümesini ayarlayın. py"Dosyayı generate_batch_parallel çalıştırın. py" simülasyonunu başlatmak için.
Son boyutlu görüntüyü elde etmek için, 5 adlı klasörün bir kopyasını oluşturun. Veri hazırlama ve eğitim/veri hazırlama" ve içine gidin. Toplu iş numarası parametrelerini ve parti başına görüntü sayısını, dosyaya eklenecek gürültü aralığını Data_generator ayarlayın.
py"Dosyayı Data_generator çalıştırın. py"montaj görüntülerini oluşturun. image" ve segment" adlı klasörleri datatrain/train" klasörüne kopyalayın.
Derin öğrenme tabanlı segmentasyon. Yeni bir mikroskop görüntü ayarı için segmentasyon modelini eğitmek için, train" adlı klasöre gidin ve bach boyutu, segmentasyon için omurga modeli, çağların sayısı ve train_unet adlı dosyanın içindeki eğitim için öğrenme hızı parametrelerini ayarlayın. py"Dosyayı train_unet çalıştırın.
py" eğitimine başlamak. Eğitim süreci, simüle edilmiş doğrulama kümesindeki segmentasyon modelini değerlendirmek için metriği görüntüler. Eğitim tamamlandıktan sonra, model best_model olarak kaydedilir.
h5"in train" adlı klasörde, modeli mikroskop görüntüleri üzerinde test etmek için, görüntülerin tren modeli tarafından istenen boyuta bölünmesi gerekir. Bunun için 6 adlı klasöre gidin. Test verilerini hazırlayın "ve verilerin PNG formatındaki dosyalarını PNG klasörüne kopyalayın" ve dosyayı split_1024_256 çalıştırın.
py"Bu, veri klasöründeki görüntülerin 256 x 256 boyutlarında kırpmalarını oluşturacaktır. Görüntü kırpmalarını segmentlere ayırmak için 7 adlı klasöre gidin. Segmentasyonu test et" seçeneğini belirleyin ve segment adlı dosyayı çalıştırın.
py", kullanılacak kaydedilen modelin adını ayarladıktan sonra. Segmentlere ayrılmış görüntüler çıktı klasörüne kaydedilir. Morfolojik analiz.
make_montage adlı dosyayı yerleştirin. py" adlı klasöre 7. Segmentasyonu test et" seçeneğini kullanın ve parçalanmış çıktıyı görüntünün orijinal boyutuna geri dikmek için dosyayı çalıştırın.
9 adlı yeni bir klasör oluşturun. Morfolojik Analiz"kaynak klasörde ve içine gidin. Pip install seaborn skan" komutunu kullanarak skan ve seaborn kütüphanelerini kurun "Segmentasyon maskeleri, bireysel mitokondrinin topolojisini analiz etmeyi sağlamak için skan" adlı kütüphane kullanılarak iskeletleştirilir.
Dosyayı 9 klasörüne yerleştirin. Morfolojik Analiz"Deneyin farklı gruplarının görüntülerini 7 klasörünün içindeki farklı klasörlere yerleştirin. Test segmentasyonu"Analiz için grafikler oluşturmak üzere dosyayı çalıştırın. Sonuç -ları.
Yapılacak nicel analiz, araştırma sorularına veya hipotezine bağlıdır. Deneyimizde, mitokondrinin üç farklı morfolojisiyle, yani noktalarla ilgilendik: noktalar "küçük mitokondri bitleri, çubuklar" lif benzeri veya mitokondri benzeri dizeler ve çok dallı ağlar "Morfolojiyi tanımlamak için, önce segmentasyon çıktısını iskeletleştiriyoruz ve farklı sınıfların dal bağlantılarını analiz ediyoruz. İki grup galaktoz uyarlanmış hücre, kontrol grubu ve CCCP ile tedavi edilen grup için analiz sonuçlarını gösteriyoruz.
CCCP'ye maruz kaldığında şişen mitokondri göz önüne alındığında, beklenen noktaların ortalama dal uzunluklarında önemli bir artış görüyoruz. Hem çubukların hem de ağ sınıflarının bireysel uzunluklarındaki mitokondri yüzdesi, hücreler CCCP ile tedavi edildiğinde kontrole göre önemli ölçüde azalır, böylece hipotezimizi doğrular. Yöntemimiz için zorlu bir senaryo, görüntünün yoğun bir şekilde mitokondri paketlediği zamandır.
Pembe renk, görüntüde tespit edilen en uzun tek mitokondriyonu gösterir ve bu da segmentasyon sonuçlarındaki artan hatadan kaynaklanır. Bu başarısızlık vakaları, mitokondri uzunluklarının kontrolü ve morfolojik operatörler kullanılarak tespit edilebilir. Uygulamamız, mitokondriyal morfolojinin analizini nasıl yaptığımızın bir örneği olsa da, etrafındaki böyle bir analiz ve araştırma sorularının mitofajinin ve ilgili biyolojik deneylerin çeşitli yönleri için formüle edilebileceğine inanıyoruz.
