Bu, rutin laboratuvar ekipmanlarını kullanarak kök sistemi mimarisini ölçmek için invaziv olmayan bir hidroponik yöntemdir. Bu protokol, bitkinin tüm kök sisteminin manuel olarak yayılarak tamamen görselleştirilmesini sağlar. RSA analizinin ana avantajlarından biri, istenmeyen elementel kontaminasyona neden olabilecek ihtiyaç duymadan bitki kök sisteminin incelenmesine izin vermesidir.
Bu yöntem, bitki sistemlerinin RSA'sı ile hormonal, besin maddeleri ve iklim koşulları dahil olmak üzere doğrudan çevresel etkileşimi kaydedebilir. Arabidopsis tohumlarının yüzey sterilizasyonuna, yaklaşık 100 tohumdan oluşan küçük bir kepçeyi oda sıcaklığında damıtılmış suya batırarak başlayın. 30 dakika sonra, bir masa üstü santrifüj kullanarak tohumları beş saniye boyunca 500 G'de kısaca santrifüj edin.
Daha sonra, suyu boşaltın ve tüpü birkaç saniye vortekslemeden önce 700 mikrolitre% 70 etanol ekleyin. Tohumları tekrar santrifüj edin. Gerekirse,% 70 etanol tedavisinin üç dakikayı geçmemesini sağlayarak vorteks ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.
Üç dakika sonra, hemen tohumları steril suyla durulayın. Daha sonra, tohumları yedi dakika boyunca bir damla ARA 20 içeren seyreltilmiş ticari ağartıcı kullanarak tedavi edin. Tüpleri sekiz ila 12 kez hızla ters çevirerek tohumları ağartıcı çözeltisi ile karıştırın.
Kısa bir santrifüjlemeden sonra, süpernatantı bir mililitrelik pipet kullanarak boşaltın ve aynı vorteks prosedürünü izleyerek tohumları steril suyla en az beş kez durulayın. Yüzeyde sterilize edilmiş tohumları suda bırakın ve tabakalaşma için dört santigrat derecede iki ila üç gün boyunca inkübe edin. Yarısı damıtılmış suyla doldurulmuş standart macenta kutusunu otoklavlayın.
Otoklavlanmış polikarbonat levhayı, dikdörtgenin yarısından fazlasına kadar çentikli bir orta noktaya sahip dörde sekiz santimetrelik dikdörtgenler halinde kesin, böylece iki dikdörtgen bir X şekli oluşturmak için birlikte yuvalanabilir. 250 mikrometre gözenek boyutundaki polipropilen ağı altı x altı santimetre kareye kesilmiş halde tutmak için bu kurulumu kullanın. Laminer hava akımı kabininde, polipropilen ağın alt kenarına ulaşmak için her kutuya vitamin artı %1,5 sakkaroz içeren steril yarım MS bazal ortam ekleyin.
Yüzey sterilize edilmiş tohumları ağ üzerine hidroponik olarak ekin ve üç gün boyunca büyütün. Üç gün sonra, fideleri 500 mikrometre gözenek büyüklüğünde bir ağa aktarın ve iki gün boyunca büyümelerine izin verin. Daha sonra, fideleri kontrol ortamına ve deney ortamına aktarın ve tohumların yedi gün boyunca büyümesine izin verin.
Petri plakasına 10 ila 20 mililitre otoklavlanmış filtrelenmiş musluk suyu ekleyin. Fideleri 500 mikrometrelik ağdan yavaşça çekin. Yuvarlak bir sanat fırçası yardımıyla, su dolu plakaya bitki benzeri kökler yayın ve suya batırın.
Suyu çıkarmak için plakayı hafifçe eğin. Bu Petri plakalarını uygun şekilde tarayın veya fotoğraflayın. Ücretsiz olarak kullanılabilen ImageJ yazılımını kullanarak kök sistem mimarisini veya RSA özelliklerini ölçün, ardından analiz edilecek dosyayı açın.
Ölçeği ayarladıktan sonra, ölçek çubuğunun ana hatlarını çizen bir çizgi seçimi oluşturmak için düz çizgi aracını kullanın. Sağ tıklayarak, çift tıklayarak veya başlangıçtaki kutuyu tıklatarak anahatları tamamlamayı bitirin. Bilinen ölçek çubuğunun uzunluğunu piksel cinsinden ölçmek için, analiz et'e ve ardından araç çubuğunda ölçüye tıklayın.
Piksel uzunluğunu not edin. Analiz sekmesindeki ölçeği ayarla sekmesini tıklatarak ölçeği ayarla iletişim kutusunu açın. Piksel cinsinden uzaklık alanındaki piksel uzunluğunu kontrol edin.
Ardından, ölçek çubuğu değerini bilinen uzaklık alanına girin ve uzunluk birimini milimetre olarak ayarlayın. Tamam'a tıklayarak bu görüntünün ölçeğini kilitleyin. Kök uzunluğunu özetleyen bir çizgi seçimi için bölümlenmiş çizgi aracını kullanın.
Anahattı bitirdikten sonra, anahat boyunca küçük siyah beyaz tutamaçları tıklatıp sürükleyerek çizgi seçimini ayarlayın. ImageJ'nin analiz sekmesi altında, ölçü komutunu seçin ve kök uzunluğunu ölçün. Sonuçlar penceresini sağ tıklayarak, açılır menüden Tümünü kopyala'yı seçerek, e-tabloya geçerek ve verileri yapıştırarak ölçülen verileri bir e-tabloya aktarın.
RSA özelliklerinin ölçümü ve hesaplanması için, hipokotil birleşim ile kök uçları ucu arasındaki birincil kök uzunluğunu ölçün. Daha sonra birinci dereceden yanal kökleri veya bir derece LR uzunluğunu ve ikinci dereceden yanal kökleri veya iki derece LR uzunluğunu ölçün. İşiniz bittiğinde, tüm ölçümleri kopyalayıp e-tabloya yapıştırın.
Birincil kökün veya BZPR'nin, ilk yanal kök çıkış noktasından son yanal kök çıkış noktasına kadar uzanan dallanma bölgesini ölçün ve kaydedin. Benzer şekilde, BZPR sınırları içinde ortaya çıkan yanal köklerin sayısını kaydedin. Ardından, birinci ve daha yüksek dereceli yanal köklerin ortalama uzunluğunu ölçün.
Birincil lateral köklerin toplam uzunluğunu, birincil lateral köklerin toplam sayısına bölerek birincil lateral köklerin ortalama uzunluğunu elde edin. Daha sonra, ikinci dereceden yanal köklerin ortalama uzunluğunu ölçmek için, ikincil yanal köklerin toplam uzunluğunu, ikincil yanal köklerin toplam sayısına bölerek ikincil yanal köklerin ortalama uzunluğunu hesaplayın. Birincil lateral kök yoğunluğunu, birincil lateral kök sayısını BZPR'nin uzunluğuna bölerek ölçün.
Daha sonra, bireysel yanal köklerin dallanma bölgesini ölçün ve ikincil yanal kök sayısını, ikinci dereceden yanal kök uzunluklarının dallanma bölgelerinin uzunluğuna bölerek ikincil yanal kök yoğunluğunu hesaplayın. İşiniz bittiğinde, toplam kök uzunluğunu veya TRL'yi ölçün. Bu, birincil köklerin ve birincil ve ikincil yanal kök uzunluklarının toplamıdır.
Bu deneyde kullanılan hidroponik sistem, inorganik fosfat eksikliği ve yeterli koşullar altında belirgin zıt fenotipi yansıtan iyi çalıştı. Çeşitli RSA özellikleri, hidroponik koşullarda kontrastlı inorganik fosfat rejimleri altında analiz edildi. İnorganik fosfat eksikliği tedavisi, inorganik fosfat yeterli durumuna kıyasla daha kısa, daha sığ ve daha az dallanmış bir RSA sergileyen bir kök fenotipini çağırdı.
Primer kök uzunluğu, inorganik fosfat eksikliği durumu altında önemli ölçüde zayıfladı. 1.25 milimolar inorganik fosfat veya kontrol ortamı varlığında primer kök uzunluğundaki anlamlı ve hızlı kazanım, hidroponik sistemin etkinliğini gösterdi ve fizyomorfolojik değişiklikleri yeterince yansıttı. Dallanma bölgesi, inorganik fosfat eksikliği durumu altında önemli ölçüde azaldı.
Birincil lateral kökün ortalama uzunluğu, pi eksikliği durumunda önemli ölçüde azaldı. Ortalama ikincil lateral kök uzunluğu, fosfat eksikliği durumu nedeniyle benzer şekilde azaltılmıştır, ancak ortalama birincil lateral kök uzunluğundan miktar olarak daha düşüktü. Primer ve sekonder lateral köklerin sayısı, fosfat eksikliği durumunda, 1.25 milimolar inorganik fosfat durumuna kıyasla büyük ölçüde azalmıştır.
Primer lateral kök yoğunluğu, fosfat eksikliği durumunda, kontrole göre, 1.25 milimolar inorganik fosfat koşulu altında değişmedi. İkincil lateral kök yoğunluğu, RSA plastisitesi hakkında fikir edinmek için lateral kök yoğunluğunun önemini gösteren önemli bir değişiklik göstermedi. Fideleri cımbız kullanarak ağdan yavaşça çıkardım.
Kökleri yuvarlak bir fırça kullanarak su dolu bir plakaya, tüm birincil kökleri yaydım ve düz bir şekilde yaydım, yanal kökleri simetrik olarak yaydım, birinci dereceden yanal köklere bağlı ikinci dereceden yanal kökleri yaydım. Arabidopsis bitki uçlarının kurum alanını hesaplamak için benzer bir yöntem kullanılabilir. Arabidopsis yaprakları diğer plakaya yayılabilir, ardından kurum alanını belirlemek için serbestçe kullanılabilen ImageJ yazılımı kullanılarak görüntü yakalama ve analiz edilebilir.
Bu protokol, çevrenin kök sistemi plastisitesi üzerindeki etkisi hakkındaki soruları cevaplamak için kullanılabilir.
