Aptamer tabanlı hedef tespiti, 3 aşamalı G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu ile kolaylaştırılmıştır

Bu yöntem, bağlama olaylarından gelen sinyali, düşük kaynak kullanımı için görsel olarak algılanabilen veya absorbans tabanlı enstrümantasyon kullanılarak ölçülebilen bir forma yükseltmenin bir yolunu sunar. Bu, aptamerin hedefinin ilgilenilen bir örnekte varlığını belirlemek için nispeten hızlı, tek potlu bir protokoldür. Niceleme isteniyorsa sonuçlar standart bir kalibrasyon eğrisiyle karşılaştırılabilir.

Yetersiz karıştırma olumsuz sonuçlara yol açacağından, çözeltileri aktarırken ve karıştırırken bireyler çok hassas olmalıdır. Ayrıca, arka plan sinyalini en aza indirmek için reaktiflerin ve çözeltilerin kullanılana kadar soğutulmuş halde tutulduğundan emin olun. Bir PCR tüpüne beş birim T4 polinükleotid kinaz ekleyerek ribozim bölünme ürünlerini aktive ederek başlayın.

Ardından, her numune tüpüne bir mikrolitre önceden hazırlanmış 5X ribozim tamponu ekleyin. Özgüllüğü görsel olarak göstermek için, test numuneleri olarak her numune tüpüne 1,5 mikrolitre iki milimolar teofilin veya iki milimolar kafein ekleyin ve her numuneyi beş ila 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın. Daha sonra, her numune tüpüne hedefe özgü bir aptamerik alan içeren iki mikrolitre 600 nanomolar RNA ekleyin, ardından bileşenleri hızlı bir şekilde karıştırmak için pipetleme yapın.

Şimdi, arka plan sinyalini en aza indirmek için tüpü soğuk bir bloğa yerleştirin. Tüm reaksiyon tüplerini hazırladıktan sonra, her bir numuneyi oda sıcaklığında tam olarak üç dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, numune tüplerini derhal buza geri döndürün.

Her numune tüpüne 3,5 mikrolitre nikaz polimeraz enzim karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, her bir numune tüpüne şablon nükleotidleri ve reaksiyon tamponu içeren 31,5 mikrolitre EXPAR reaksiyon karışımı ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Tüm numuneler hazırlandıktan sonra, hazırlanan numuneyi bir zamanlayıcı kullanarak beş dakika boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra numune tüplerini derhal buza geri getirin. Renk gelişimi için her numune tüpüne iki mikrolitre hemin çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, her bir numune tüpüne ticari olarak temin edilebilen TMB çözeltisinden 58 mikrolitre ekleyin, iyice karıştırın ve renk gelişimi için inkübe edin.

Numuneleri kalitatif olarak gözle okuyun veya makalede açıklandığı gibi bir absorbans plakası okuyucu kullanarak sonuçları ölçün. Optimize edilmiş yapı, 30 dakika içinde 500 nanomolar teofilin kadar az tanıyabilir. Hedefe maruz kalan numune preparatları mavi bir renk üretirken, hedef içermeyen numuneler renksiz kalır.

30 dakikalık renk gelişiminden sonra A450'de ölçülen sinyalden standart bir eğri hazırlandı. Kuluçkaları gerçekleştirmezken numuneleri buz üzerinde tutmak önemlidir, çünkü optimize edilmiş RNA bile hala düşük bir arka plan aktivite seviyesi sergileyecektir.