Embriyo kurtarma protokolü, farklı Cucurbita türleri arasındaki interspesifik haçlardan türetilen olgunlaşmamış embriyoların rejenerasyonu için zorunludur. En yaygın olarak Cucurbita moschata ve Cucurbita pepo arasındaki haçlar için kullanılır. Bu tekniğin temel avantajı basitliğidir.
Protokol sadece antibiyotik içeren MS ortamını kullanır. Bu nedenle, herhangi bir laboratuvar tarafından kolayca çoğaltılabilir. Bu tekniği, interspesifik veya interjenerik hibridizasyonun önündeki farklı engelleri araştırmak için değiştirmek mümkün olacaktır.
Her adımda detaylara dikkat etmek başarılı bir sonuç için faydalı olacaktır. Cucurbita bitkilerini ekmeye başlayarak, her biri kilogram başına 1.38 gram azot, fosfor ve potasyum içeren tam azot, fosfor ve potasyumlu gübre ile desteklenmiş saksı ortamı kullanarak 25 x 50 santimetrelik 50 hücreli başlangıç düzlüklerini doldurun. Daha sonra, tohumları uzunluklarına eşit bir derinliğe ekin ve saksı ortamıyla örtün.
Daireleri durgun su oluşturmadan sulayın ve günde bir kez sulayarak ortamı nemli tutun. İkinci gerçek yaprak aşamasının sonunda, fideleri tencere başına üç çorba kaşığı tam gübre ile desteklenmiş 30 santimetre çapında saksılara nakledin. Her yedi günde bir, her tencereyi bir galon suya eklenen bir gramda 20, 20, 20 azot, fosfor ve potasyum içeren 500 mililitre sıvı gübre ile gübreleyin.
Seradaki bitkileri doğal ışık rejimi altında 22 ila 28 santigrat derece arasındaki sıcaklıklarda tutun. Vining genotipleri için, serada destekleyici bir kafes sağlayın. Kontrollü hibridizasyonu veya tozlaşmayı, bitkiler tohumlamadan altı ila sekiz hafta sonra çiçeklenmeye başlar başlamaz gerçekleştirin.
Yaprakları üzerinde sarı bir renk tonu olan açılmamış çiçekleri kontrol edin ve Cucurbita pepo ve Cucurbita moschata çeşitlerinin erkek çiçeklerini ve dişi çiçeklerini tanımlayın. Kazara böcek tozlaşmasını önlemek için, maskeleme bandı kullanarak kapalı çiçeği üste yavaşça bantlayın. Ertesi sabah, erkek ve dişi çiçeğin bantlanmış üst kısmını nazikçe çıkararak saat 10: 00'dan önce tozlaşmayı gerçekleştirin.
Yaprakları erkek çiçekten ayırmak ve panteri dişi çiçek damgasına hafifçe sürtünerek polenleri aktarmak. Tozlaşmadan sonra, tozlaşan dişi çiçeği hemen maskeleme bandı ile kapatın ve tozlaşma tarihini kaydetmek ve haçta kullanılan baba ve anne ebeveynlerini belirtmek için bir etiket kullanın. Genişlemiş bir yumurtalık tarafından belirtilen başarılı bir haç, bir hafta içinde küçük bir meyve oluşturacaktır.
Meyveyi 45 ila 55 günlük tozlaşmadan sonra hasat edin. Bir sefotaksim stoğu hazırlayın. Steril bir 0.22 mikron şırınga filtresinden süzün.
Ve eksi 20 santigrat derecede saklamadan önce mililitre sefotaksim başına 250 miligramlık 0.5 mililitre alikot yapın. Benzer şekilde, ampisilin stoğu hazırlayın. Steril bir 0.22 mikron şırınga filtresinden süzün ve eksi 20 santigrat derecede saklamadan önce mililitre ampisilin başına 100 miligramlık bir mililitre alikot hazırlayın.
Murashige ve Skoog veya MS ortamını, bir litrelik bir şişede 500 mililitre damıtılmış suda 2.45 gram ortamını çözerek hazırlayın. MS ortamına 1,5 gram gellan sakızı ekleyin ve 20 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklav yapın. Şişeyi 50 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirerek ortamı soğutun.
Laminer akış kabininin içindeki antibiyotik stoklarını çözün. Orta şişeyi laminer akış başlığına aktarın ve uygun karıştırma ile ortama 0,6 mililitre sefotaksim stoğu ve 0,25 mililitre ampisilin stoğu ekleyin. Ortamın yaklaşık yedi mililitresini 60 x 15 milimetre steril Petri kabına dökün.
Ortamın Petri kaplarında yaklaşık 15 ila 20 dakika katılaşmasına izin verin. Petri bulaşıklarını sızdırmazlık sargısı ile kapatın ve daha fazla kullanana kadar oda sıcaklığında bir saklama kutusuna yerleştirin. Kabak meyvesini ana asmayı keserek hasat edin ve% 0.3 kloroksilenol gibi sıvı bir deterjan kullanarak yüzeyini laboratuvar lavabosunda yıkayarak meyveyi dezenfekte edin.
Meyveyi bol musluk suyuyla durulayın ve meyveyi laminat hava akış dolabına aktarmadan önce temiz kağıt havlularla kurulayın. Kabin içindeki meyve yüzeyini% 70 etanol püskürterek sterilize edin. Meyveyi steril bir bıçakla ikiye bölün ve tohumları çıkarın.
Tohum kabuğunu aseptik olarak açmak için steril forseps veya steril eldivenli eller kullanın ve olgunlaşmamış embriyoları antibiyotik takviyeli MS Medium içeren bir Petri kabına yerleştirmeden önce ortaya çıkarın. Petri plakalarını sarma filmi kullanarak kapatın ve 25 santigrat derece sıcaklığa, 16 saatlik fotoğraf süresine ve% 70 bağıl neme sahip bir büyüme odasına yerleştirin. Kontaminasyon durumunda, kontamine edilmemiş embriyoları derhal aynı ortama sahip yeni bir plakaya yerleştirin.
Kökler 10 ila 14 gün sonra geliştirildikten ve kotiledonlar 15 ila 21 gün sonra geliştirildikten sonra, bitki yavrularını Petri bulaşıklarından çıkarın ve musluk suyu kullanarak köklerin etrafında bulunan ortamı nazikçe yıkayın. Temizlenmiş bitki yavrularını 14 x 9 x 4 santimetrelik plastik bir kaba yerleştirin ve kökleri ıslak kağıt havlularla örtün. Kabı örtün ve gerektiğinde kağıt havluları tekrar nemlendirin.
Plastik kapları 25 ila 28 santigrat derecede ve kağıt havluların nemli durumunu korurken plantletleri iklimlendirmek için 16 saatlik bir fotoğraf süresinde tutun. 7 ila 10 günlük iklimlendirmeden sonra, üç ila dört santimetre uzunluğundaki fideleri, gübre ile değiştirilmiş ticari saksı karışımı içeren 50 hücreli düzlüğe aktarın ve seraya taşıyın. Çürümeyi önlemek için aşırı sulamadan kaçının ve gerektiğinde hücre başına yaklaşık 10 ila 20 mililitre su ekleyin.
İkinci ila üçüncü gerçek yaprak aşamasında, fideleri gübre ile değiştirilmiş saksı ortamıyla doldurulmuş 25 santimetre çapında saksılara nakledin ve bitkiler çiçeklenmeye başladığında kontrollü hibridizasyon gerçekleştirin. Seradaki bitkileri doğal ışık rejimi altında 22 ila 28 santigrat derecede tutun. Ve bitkileri meyve ve tohum özellikleri açısından değerlendirin.
Spesifik hibridizasyon için dört Cucurbita pepo ve 11 Cucurbita moschata seçildi. Denenen 24 interspesifik çapraz kombinasyondan, meyve setinde% 92'den fazla başarıyı temsil eden 22 haç için bir meyve seti elde edildi. Cucurbita moschata ve Cucurbita pepo arasındaki O ve M genotiplerini ve E ve J genotiplerini içeren haçlar olgun meyve üretmedi.
Cucurbita moschata ve Cucurbita pepo arasındaki F ve J genotiplerini içeren haç ise altı meyve üretti. Farklı çapraz kombinasyonlar için tozlaşan çiçek sayısı 1 ila 11 arasında değişiyordu. Ve tozlaşmanın başarı oranı% 0 ila% 100 arasında değişiyorduTüm çapraz kombinasyonlardan üretilen 44 meyveden, Cucurbita moschata ve Cucurbita pepo, genotip C ve J arasındaki bir haçtan sadece bir meyve, kurtarılabilecek olgunlaşmamış embriyolar üretti.
Bu zayıf gelişmiş embriyoların gelişimi için, embriyo kurtarma ortamı kullanılarak kültüre alındılar ve bu da embriyo kurtarma için% 80'lik bir başarı oranıyla sonuçlandı. En önemli iki prosedür, Cucurbita moschata ve Cucurbita pepo olmak üzere iki tür arasındaki uyumlu haçları ve başarılı embriyo rejenerasyonunu tanımlamaktır. Embriyo kurtarma tekniği basit ve kolayca çoğaltılabilir olduğundan, dünya çapındaki kabak yetiştiricileri bu tekniği, farklı Cucurbita türleri arasındaki interspesifik haçlardan türetilen olgunlaşmamış embriyoları kurtarmak için kullanabilirler.
