Protokol, kalp fonksiyonunun ışık kullanılarak karakterize edilebileceği ve kontrol edilebileceği Drosophila modelleri sunar. Bu, araştırmacıların Drosophila'daki insan kalp hastalıklarını sağlam hayvanları kullanarak incelemelerini sağlar. Bu yöntem, non-invaziv OCT görüntülemeyi ve Drosophila kalp fonksiyonunun optogenetik kontrolünü güvenilir bir şekilde sağlayabilir.
Yüksek verim ve kaliteye sahiptir. Optogenetik pacing, aritmik bozuklukları tedavi etmek için terapi olarak elektriksel pacing'e potansiyel olarak bir alternatif olabilir. OCT görüntüleme ve optogenetik pacing, kalp organoidleri, zebra balığı ve embriyonik boğaz ve kalp gibi diğer model sistemlere genişletilebilir.
Başlamak için, TM6 çift yumrulu bakire dişi üzerinde beş el GAL4'ü ve şişe başına UAS Ops ve Stocks'tan iki ila üç erkek sineği birleştirin. Ertesi gün, Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nin talimatlarına göre, 100 mililitre sakkaroz başına 5.14 gramı sıcak bir tabaktaki bir kaba ekleyerek yarı tanımlı yiyecekler hazırlayın. Sonra sürekli karıştırarak 60 santigrat dereceye kadar soğutun.
Daha sonra, her şişeye 50 mikrolitre 100 milimolar all-trans retinal etanol çözeltisi ekleyerek dar sinek şişeleri hazırlayın. Dar sinek kötülüğü başına beş mililitre sinek yemi atmak için serolojik bir pipet kullanın. 10 saniye boyunca maksimum hızda vorteksleme yaptıktan sonra, bu şişeleri takın ve ışıktan korumak için koyu renkli kumaşa sarın.
Ertesi gün, sinekleri sürekli olarak yumurtlayan yumurtaları, tüm trans retinal etanol içeren yiyeceklerle şişelere aktarın. Rafları şişelerle ışıktan koruyun. 24 ila 48 saat sonra, atılan yumurta sayısına bağlı olarak, şişe aşırı popülasyonunu önlemek için ebeveynleri atın.
Daha sonra, kalp görüntüleme için tubby olmayan dölleri toplayın. UAS seçeneği şişeden GAL4 larva veya pupa'yı seçin, bir mendil üzerine koyun ve bir boyama fırçası kullanarak ortamı vücut yüzeyinden yavaşça silin. Mikroskop slaytını ortada küçük bir çift taraflı bant parçası ile hazırlayın.
Daha sonra, larva veya pupa'yı sırt tarafı yukarı bakacak şekilde bant yüzeyine yavaşça yerleştirin ve bir fırça veya ince cımbız kullanarak slaytın uzun tarafına dik olarak yerleştirin. Larva veya pupa'yı bandın yüzeyine tutturmak için hafif basınç uygulayın. Şimdi, larva veya pupa aşağı bakacak şekilde görüntüleme aşamasında slaytı ayarlayın ve lazer kontrol yazılımı ile optik koherens tomografiyi veya OCT ışık kaynağını açın.
Özel yazılı spektral etki alanı OCT denetim yazılımını açın. Ardından, önizleme penceresine tıklayın. Ardından, spektral etki alanı OCT yazılımında tarama parametrelerini ayarlayın.
Sinek kalbini odak noktasına getirmek için numune aşamasını kontrol etmek için mikro manipülatörler kullanın. Sinek kütikülü yüzeyinden ışık yansımasını en aza indirmek için odak konumunu ayarlayın. Ayrıca, yansımayı en aza indirmek için larva veya pupa yüzeyine mineral yağ uygulamayı düşünün.
Ardından, M modu OCT görüntü alma için tarama parametrelerini ayarlayın ve dinlenme kalp atış hızını hesaplamak için kırmızı ışık stimülasyon darbeleri olmadan beş set kontrol verisi alın. Özel OCT kontrol yazılımında hız stimülasyonu için ışık darbesini tasarlayın. Bunun için, ayarlar sekmelerine tıklayın ve farklı stimülasyon protokollerine göre darbe frekansını, darbe genişliğini, stimülasyon süresini ve bekleme süresini kontrol etmek için tasarlanmış ışık darbesi dizilerini ekleyin.
Ardından kırmızı ışık darbeleri oluşturmak için ışık denetleyicisi yazılımını açın. Mod seçiminde darbe modunu seçin. Darbe profili ayarları için şekle çift tıklayın ve takipçi modunu seçin.
Kapalı yoğunluğu sıfırda tutun ve gerçek güç yoğunluğunu hesaplarken açık yoğunluk yüzdesini ayarlayın. OCT Control yazılımında Acquire (Elde Et) seçeneğine tıklayarak hafif stimülasyonlu Drosophila kalbinin M modu videolarını edinin. Görüntüleme alımı sırasında sinek kalbinden aşağı kırmızı ışık yanıp sönmelerini kaydedin.
Sinek kalbi fonksiyonunu kırmızıya kaydırılmış channelrhodopsin ve NPHR fly modelleriyle kontrol etmek için farklı hız ayarlarının gerekli olduğunu unutmayın. Özel geliştirilmiş fly heart segmentasyon yazılımını açın ve dosya seç'e tıklayın. Ardından, grafik kullanıcı arayüzünde analiz edilecek dosyayı seçin.
Kalp bölgesinin hem dikey hem de yatay sınırlarını üstteki metin kutularına piksel cinsinden girin. Yeniden boyutlandır'a tıklayın. Alttaki kaydırıcıyı kullanarak tüm kalp bölgesinin görünür olduğundan ve tüm koleksiyon için tüm kutuyu doldurduğundan emin olun.
Tahmin sekmesine tıkladıktan sonra, program koleksiyondaki her dilimden geçecek ve yaklaşık üç dakika içinde kalp bölgesini seçecektir. Tahmin tamamlandıktan sonra, kalp bölgesinin zaman içindeki grafiğini yeni bir pencerede görüntülemek için İK grafiğine tıklayın. Doğru tepe veya vadi alanlarını seçin, nabzı seçin ve ardından son bir rakam oluşturmak için İK sekmelerini seçin.
İşlevsel parametreler aynı anda CSV dosyalarına kaydedilir. El GAL4 sürücüsünün doku özgüllüğü, yeşil floresan protein ekspresyonu görüntülenerek doğrulandı. Larva ve pupa vücut kesitinin tipik OCT görüntüleri burada gösterilmiştir.
Farklı kalp rahatsızlıklarını taklit etmek için, dört tip ışık darbesi tasarlandı. Beş saniyelik bekleme süresinden sonra 10 saniye süren tek bir nabız, geri yüklenebilir kalp durması oluşturdu. İstirahat kalp atış hızından daha düşük frekanslarda kalp atış hızı için, dinlenme kalp atış hızının yarısına eşit tempo frekanslarına sahip iki ışık nabzı dizisi ve aralarında altı saniyelik bir bekleme süresi ile sekiz saniye süren dinlenme kalp atış hızının dörtte biri kullanılmıştır.
Kırmızıya kaymış kanalrodopsin aktivasyonu nedeniyle kalp atış hızını arttırmaya yönelik stimülasyon paterni, üç ışık darbesi dizisinden oluşuyordu. Işık sinyallerini takiben azalan kalp kasılma frekansı, larva ve pupada taklit eden daha yavaş bir kalp atış hızına neden oldu. Larvalara farklı stimülasyon frekanslarında bir dizi üç ışık nabız treni uygulandı ve pupa kalpleri, ışık darbelerini takiben artmış kalp atış hızını açıkça gösterdi.
Doğru döl seçiminin hazırlanması, numunenin montajı ve görüntüleme prosedürü esastır. Optogenetik pacing teknolojisini daha büyük hayvan modellerine aktarmayı, memeli kalp hastalıklarını incelemeyi ve aritmi tedavisinde yeni terapötik yaklaşımları keşfetmeyi umuyoruz.
