Bu protokol önemlidir, çünkü bir hasta örneğinin patojenik antikorlar içerip içermediğini belirlememize izin verdi. Bu tekniğin temel avantajı, diğer yöntemlerle kolayca ayırt edilemeyen yüzey ve hücre içi antijenler arasındaki reaktiviteyi ayırt etme yeteneğinde yatmaktadır. Kültürel hipokampal nöronlar yeni antikorları tanımlamak için kullanılır.
Bu yeni antikorların tanımlanması sonunda hasta sonuçlarını iyileştirmek için monoterapilerde spesifik bir şeyin başlatılmasına izin verir. Bu teknik önemlidir, çünkü nöronal yüzey proteinlerine yönlendirilen patojenik antikorlarla ilgili hastalıkların tüm alanına genişletilebilir. Embriyo kafasını ince kavisli forsepslerle tutarak, yörüngeleri 45 derecelik bir açıyla bir çift ince düz forseps ile delin.
Ardından ince kavisli forsepsleri serbest bırakın. Ameliyat makası yardımıyla oksipital kemikten başlayarak frontal kemiğe kadar cildi ve kafatasını diseke edin. Daha sonra beyni bir çift ince kavisli forseps ile çıkarın ve kış uykusuna yatma artı B27 ile altı santimetrelik bir tabakta toplayın.
Tüm embriyoların beyinleri kurtarıldıktan sonra, telensefalonları sagital olarak ayırmak için ince düz forseps kullanın. Daha sonra, bir daire içinde bir santimetre mesafeye hazırda bekletme ve B27 damlaları yerleştirerek 10 santimetrelik bir tabak hazırlayın ve diseksiyon kapsamını 1.25 X büyütmede görselleştirmek için damla başına bir telensefalon yerleştirin. Mikroskop altında çalışırken, talamusu dikkatlice çıkarın ve hipokampüsü daha iyi görselleştirmek için meninksleri soyun.
Daha sonra hipokampüsü hassas yaylı makasla disseke edin. Ve hazırda bekletme artı B27 ve istrate iki ile 3,5 santimetrelik tabağa yerleştirin. Tüm hipokampusları toplamak için prosedürü tekrarlayın.
Hipokampusun enzimatik ayrışması için, hipokampusu içeren 50 mililitrelik tüpe bir mililitre% 2.5 tripsin ekleyin. Tüpteki hacmi HBSS ile beş mililitreye getirdikten sonra, tüpü 37 santigrat derecede su banyosunda 15 dakika boyunca inkübe edin. Tripsini daha da seyreltmek için, 10 mililitre önceden ısıtılmış HBSS ekleyin ve tüpü beş dakika boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış su banyosuna geri yerleştirin.
Daha sonra, mukus kütlesi olarak görünen hipokampusu 50 mililitrelik bir tüpe aktarmak için 1000 mikrolitrelik bir mikro pipet kullanın. Ve gösterildiği gibi, dokuyu beş dakika boyunca altı mililitre önceden ısıtılmış HBSS ile inkübe edin. Dokuyu mekanik olarak ayırmak için, hipokampal kütleyi konik tabanlı iki mililitrelik bir tüpe aktarın.
Bir mililitre önceden ısıtılmış DMEM ortamı ekledikten sonra, peleti 1000 mikrolitrelik bir mikro pipetle hafifçe yukarı ve aşağı aspire ederek homojenize edin. Kabarcık oluşturmadığınızdan emin olarak, karışım yarı saydam olana kadar ucu tüpün konik tabanına temas eden önceden çekilmiş bir cam pipetle yukarı ve aşağı aspirasyonu 10 ila 20 kez tekrarlayın. Hücreleri, çapraz sallama hareketleriyle 3,5 santimetrelik bir kaba eşit olarak dağıtmadan önce sayın.
İşiniz bittiğinde, çanağı% 5 karbondioksit ile inkübatöre yerleştirin. 14 günlük in vitro hücrelerin floresan immünoboyaması için, Anti-NMDAR antikorları içeren numuneyi kapak fişlerine ekleyin ve 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Bir saat sonra, numuneyi beş dakika boyunca oda sıcaklığında bir fiksasyon çözeltisi olarak% 4 formaldehit ve PBS ile muamele edin.
Daha sonra numune itme kuvvetini PBS ile her biri beş dakika boyunca yıkayın, ardından ikincil antikor keçi anti-insan Alexa Fluor 488'in oda sıcaklığında bir saat boyunca bir ila 1000 seyreltmede eklenmesiyle yıkayın. Ardından, numuneyi içeren kapak fişlerini sıvı montaj ortamıyla monte edin ve kalan sıvıyı aspire edin. Floresan görüntüleme ile nöronları görselleştirin.
Kalsiyum görüntüleme için, kapak fişlerinde yetiştirilen 14 ila 18 günlük in vitro hücreleri kullanın. Görüntülemeden önce, hücreleri beş ila yedi gün boyunca mililitre başına 2.5 kez 10 ila 10. genom kopyalarında pAAV2 CAG GCaMP 5G için kodlayan viral vektörle tedavi edin. Görüntülemeden bir gün önce, hücreleri hasta örneğiyle 24 saat boyunca inkübe edin.
Görüntüleme gününde, kurulumu hazırlayın ve mikroskop hücresi odasını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Şeridi damıtılmış suyla doldurun, hücre fizyolojik koşullarını korumak için% 5 karbondioksit ile demleyin. Hücreleri hücre dışı fizyolojik çözelti ile kapladıktan sonra, mikroskop hücre odasına aktarın.
AMPA ve KA reseptörlerini bloke etmek için 10 mikromolar NBQX ekleyin ve NMDA reseptör yanıtını görselleştirin. Her 100 milisaniyede bir kaydedilen karelerle dört dakikalık filmi edinin. Satın almaya başladıktan kısa bir süre sonra, yemeğe stimülasyon çözeltisi ekleyin.
Stimülasyon üzerine, kontrol ve hastanın beyin omurilik sıvısı veya BOS örnekleri ile inkübe edilen kültürden zaman içinde floresan sinyalini çıkarın Görüntü J.It gibi işleme yazılımı kullanılarak hücrelerin in vitro olarak eşit olarak dağıldığı ve hücre gövdesi etrafında gelişen bir lamel ve küçük nöritlerin uzamaya başladığı plakaya yapıştığı gözlendi. Kültürde birkaç gün sonra, nöritler kısa bir mesafe uzadı ve hücreler önemli bir polarizasyon gösterdi. Nöronal ağ büyümeye devam etti ve karmaşık hale geldi.
18 günde, nöronlar olgundu, birbirine bağlıydı ve nöronal ağı inşa etti. Temsili floresan görüntüler, seçici belirteçler kullanarak 18 günde olgun nöronları göstermektedir. Kültürlerin hasta örnekleri ile inkübasyonu, nöronların yüzeyinde bulunan NMDA reseptörünü tanıyan otomatik antikorları içerdiğinden yoğun bir floresan sinyali üretti.
Buna karşılık, kontrol örnekleri nöronal kültürlere uygulandığında floresan sinyali üretmedi. NMDA uygulaması, hücre içi yeşil floresandaki bir değişiklikle gösterildiği gibi floresan yoğunluğunu arttırdı. Stimülatör uygulandığında, kontrol BOS örneği ile tedavi edilen nöronlar, floresan yoğunluğunda, hasta BOS örneği ile tedavi edilen hücrelerden daha yüksek bir fark göstermiştir.
Hipokampusun özellik tanımlaması ve diseksiyonu, kültürlerin saflığını belirler. Hücre agregasyonu, özellikle kültürleri görüntüleme amacıyla kullanırken önemli bir faktördür. Ek olarak, kültürlenmiş hipokampal nöronlar, immünopresipitasyon ve kütle spektrometrisi teknikleriyle birleştirildiğinde yeni antikorları ve hedef antijenlerini tanımlamak için kullanılabilir.
Bu teknik, yeni bir antikor aracılı hastalık kategorisinin karakterizasyonuna izin vermiştir. Bu nedenle, nano immünolojinin yeni alanının incelenmesinde esastır.
