Protokol, jeotermal kaynaklardan ağır metale dayanıklı mikropların taranması ve izolasyonu için kolaylaştırılmış bir yaklaşım tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, biyosensing ve biyoremediasyon alanında uygulama için dünya çapında artan ilgi alanına sahip bir araştırma alanını temsil etmektedir. Burada açıklanan yöntem, mikropları su, gıda, toprak veya tortu gibi çeşitli çevresel kaynaklardan izole etmek için kolayca değiştirilebilir.
Dirençli bir mikrobu tanımlamak için minimum inhibitör konsantrasyonu, yeni türleri veya suşları karakterize etmek için hızlı bir stratejidir. Bu protokolün uygulanması kolaydır ve sadece temel mikrobiyoloji teknikleri ile manuel beceri ve deneyim gerektirir. Başlamak için, toplanan iki gram numuneyi, pH'ı dört veya yedi olan taze hazırlanmış Luria-Bertani ortamının 50 mikrolitine aşılayın.
Bu numuneyi, örnekleme alanının sıcaklığında artı veya eksi beş santigrat derece kuluçkaya yatırın. Luria-Bertani agar üzerindeki numunenin 200 mikrolitresini pH'ı dört veya yedi olan bir plaka haline getirin ve 48 saat boyunca 55 veya 60 santigrat derecede statik bir durumda tutun. Kuluçkadan sonra, tek kolonileri izole edin ve bu çizgi kaplama döngüsünü en az üç kez tekrarlayın.
Bir mililitre dondurulmuş hücre stoğu hazırlamak için, bir gecede yetiştirilen hücrelere% 20 gliserol ekleyin. Hızlı donma için aseton ve kuru buz karışımı kullanın. Bir gliserol stoğundan bir inokülum hazırlamak için, 50 mililitre Luria-Bertani'de 50 mikrolitre aşılayın.
Bir büyüme profili elde etmek için, bu ön kültürü 10 mikrolitre Luria-Bertani içinde seyreltin. Optik yoğunluğu 0.1'e ayarlamak için 600 nanometre ekleyin. Bu hücreleri yörüngesel çalkalayıcıda 55 veya 60 santigrat derecede 16 saat boyunca büyütün.
Optik yoğunluğu 30 dakikalık aralıklarla 600 nanometrede ölçün. Bu verilerden X ekseninde zamanla ve Y ekseninde 600 nanometrede optik yoğunlukla eğri. Laboratuvar koşulları için en uygun pH'ı belirlemek için kültür ortamının değişen pH'ı ile benzer büyüme eğrilerini çizin, gliserol stoğundan çizgilenen izolatı 50 mikrolitre Luria-Bertani ortamında aşılayın ve gece boyunca inkübe edin.
Bu gece yetiştirilen kültürü 5.000 kez G'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın, ardından süpernatantı atın ve kültür paletini hasat edin. Kullanımdan hemen önce 20 milimolar Tris-HCL, iki milimolar EDTA,% 1.2 Triton X-100 ve% 1.2 Triton X-100 ve mililitre lizozom başına 20 miligramdan oluşan 10 mililitre bakteri lizis tamponu hazırlayın. Peleti 180 mikrolitre bakteriliz tamponunda tekrar askıya alın.
Saflaştırma kitinde belirtildiği gibi genomik DNA ekstraksiyonu ve genomik DNA'yı ve saflığını UV-Vis ile ölçün. Saflığı değerlendirmek için 260 ila 280 ve 260 ila 230 optik yoğunluk oranlarını belirleyin. Her bir numunenin 200 nanogramını% 0.8'lik bir agaroz jeli üzerine yükleyerek ve boyut dağılımını bir yükseklik, ağırlık moleküler belirteci ile karşılaştırarak genomik DNA'nın bütünlüğünü değerlendirin.
Gliserol stoğundan izolatı 200 mililitre Luria-Bertani optimal pH ve sıcaklık koşullarında büyütün. 600 nanometrede 0.1'lik bir optik yoğunluk elde etmek için her bir ön kültürü beş mililitre Luria-Bertani ortamında artan konsantrasyonlarda ağır metal ve antibiyotik içeren 50 mililitre polipropilen tüplerde seyreltin. Hücreleri, 55 veya 60 santigrat derecede dakikada 180 devir ile yörüngesel bir çalkalayıcıda 16 saat boyunca büyütün.
Mikrobiyal büyümenin gerçekleşmediği tüplerdeki konsantrasyon değerlerini tanımlayarak antibiyotikler veya ağır metaller için minimum inhibitör konsantrasyonunu hesaplayın. Luria-Bertani agar plakaları üzerinde minimum inhibitör konsantrasyonlarda yetiştirilen kültürün 200 mikrolitresini kaplayarak ve gece inkübasyonundan sonra kolonilerin varlığını doğrulayarak konsantrasyonun inhibitör olduğunu ve hücreler için ölümcül olmadığını kontrol edin. Bu protokol, asit sülfürik jeotermal bir ortam olan Piscarelli bölgesinden bakteri örneklerini test etmek için kullanıldı İzole edilmiş mikroorganizmaların fenotipik karakterizasyonu, izole edilenin arsenat ve vanadat için daha yüksek toleransa sahip olduğunu ve kadmiyuma dirençli olduğunu gösterdi.
Karşılaştırmalı veriler, birinin izole edilmesinin pentavalan arseniğe karşı güçlü bir dirence sahip olduğunu, iki izolatın ise üç değerlikli arseniğe karşı direnci olduğunu göstermektedir. Antibiyotik direnç testleri, düşük konsantrasyonlar kullanıldığında bile izole edilen tüm antibiyotiklere karşı oldukça hassas olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, iki izolat, kloramfenikol ve tetrasiklin hariç test edilen tüm antibiyotiklere dirençlidir.
Mikroorganizma muhtemelen aşırı çevresel koşullarda seçici bir avantajı temsil eden rastgele mutasyonlar veya yatay gen transferi nedeniyle antibiyotik direnci kazanmıştır. Bu çalışma, kirleticileri etkisiz hale getirebilecek ve zararsız ürünlere dönüştürebilecek çevresel mikroorganizmaları seçmek için bu tür yöntemlerin yararlılığını göstermektedir.
