Bu protokol, farelerin spontan nöbetler geliştirdiği temporal lob epilepsisi için yeni bir model oluşturur ve epileptogenez mekanizmalarını araştırmak ve ayrıca yeni tedavileri taramak için çok yararlı olmuştur. VGAT-Cre farelerinde bu prosedür, kemokonvülzanlar veya sürekli elektriksel stimülasyon ile tetiklenen status epileptikustan sonra sıklıkla görülen yaygın hipokampal hücre ölümüne neden olmadan spontan tekrarlayan elektrografik ve motor ve motor kompozit nöbetlere güvenilir bir şekilde yol açar. Kulaklık üretmeye başlamak için, 3,5 santimetre uzunluğundaki politetrafloroetilen kaplı paslanmaz çelik teli kesin ve yalıtım kaplamasının yaklaşık bir milimetresini telin her iki ucundan çıkarın.
Bir mengene tutucusuna iki pim yerleştirin, pimin alt kısmı aşağı bakacak şekilde daha uzun bir yarığa sahiptir. Ardından, telin soyulmuş uçlarına ve pimlerin üst kısımlarına akı uygulayın. Telin soyulmuş kısmını ve pimlerin üst kısmını, yanlara taşmadan kaplamak için yeterli lehimle kalın.
Telin soyulmuş uçlarından birini, lehim erirken mümkün olduğunca derin bir pime yerleştirin. İkinci pim için işlemi, telin diğer soyulmuş ucuyla tekrarlayın. Pimleri soğuttuktan ve lehimledikten 10 saniye sonra, pimleri mengene tutucusundan çıkarın ve ardından tel ile pimler arasındaki bağlantının güçlü olduğundan ve tuttuğundan emin olmak için pimlerin üzerine çekin.
Pimleri soğuk suda durulayın, ardından kurutun. Daha sonra, bir pim ile ikinci pim arasındaki iletkenliği doğrulamak için bir ohmmetre kullanın. Telin ucundaki pimleri paralel ve yakın tutmak için bir araya getirin.
Bir hemostatı telin ortasına sıkıştırın ve teli sıkıca döndürmek için hemostatı döndürün. Hemostatı çıkardıktan sonra, teli 90 derecede bükmek için forsepsleri pimlerin iki milimetre altındaki bükülmüş tel üzerine sıkıştırın. Teli forsepslerin üzerinden 90 derece geriye doğru itin ve ilkinden bir milimetrede bir bükme daha oluşturun.
Bükülmüş teli virajın 45 derece ve 3,5 milimetre altında kesmek için küçük, keskin makas kullanın. Her kulaklık için iki adet bipolar veya çift pimli bükümlü elektrot hazırlayın. Bir referans elektrodu hazırlamak için, her iki ucunda lehimlenmiş pimli bir teli ikiye bölün.
Ardından, teli yedi milimetrede kesin ve telin ucunu ucun bir milimetre altında bükün. Telin bükülmüş bir milimetrelik ucunu forseps ile örtün ve bir milimetre çapında küçük bir halka oluşturmak için teli forsepslerin etrafında sıkıca döndürün. Ardından, tel ucunun tekrar dışa bakmasını sağlamak için halkayı telin düz kısmına dik olarak bükün.
Tüm elektrotları, iki bipolar elektrot arasında altı milimetrelik bir mesafe ile altı pimli kaideye yan yana monte edin. Referans elektrotunu orta dış deliğe yerleştirin. Ameliyata devam etmeden önce, sekiz haftalık VGAT-Cre farelerinin ağırlığını kaydedin.
Ardından, anesteziyi indüklemek için hayvanı bir indüksiyon odasına yerleştirin. Anestezi uygulanan fareyi 37 santigrat derecede bir ısıtma yastığına yerleştirin. Geri bildirim kontrollü bir sıcaklık sistemi kullanıyorsanız, ameliyat sırasında sıcaklık izlemesi için sıcaklık probunu hayvanın rektumuna yerleştirin.
Ameliyata başlamak için, inhalan anestezi akışını burun konisine yönlendirin ve ön üst dişleri kesici uca yavaşça yerleştirerek ve koniyi burnuna hareket ettirerek hayvanı stereotaksik çerçeveye monte edin. Ardından, kulak çubuklarını kulaklara yerleştirin ve stereotaksik çerçeveye yapıştırın. Hayvanın başının düzleştirildiğinden ve ortalandığından ve hafifçe incelendiğinde hareket ettirilemediğinden emin olun.
Hayvan monte edildikten sonra, hidrasyon için farelere 0,5 mililitre Normosol enjekte edin ve kornea kurumasını önlemek için oküler yağlayıcı uygulayın. Bir arka bacak pençesini sıkıştırarak anestezi derinliğini izleyin. Geri çekilme refleksi hayvanda yoksa, farenin kafa derisi kıllarını cerrahi alanın etrafına çıkarmaya devam edin.
Tamamlandığında, temiz cilt bölgesini alternatif bir etanol ve iyot uygulamasıyla üç kez dezenfekte edin, iyotla bitirin ve deri altından% 0.25 0.25 bupivakain 0.05 mililitre enjekte edin. Bir neşter kullanarak kafatası üzerinde bir kesi yapın ve ardından kafatasını açığa çıkararak cildin bir kısmını cerrahi makasla kesin. Kafatasını pamuklu çubukla altta yatan tüm dokulardan temizlemeden önce cildi bir kenara itin.
Steril pamuklu çubuklar kullanarak kafatasını hidrojen peroksit ile temizleyin ve kafatası dikişlerini, bregma'yı ve lambda'yı görünür hale getirin. Stereotaksik olarak monte edilmiş matkapla, matkap ucunu sıfır X, Y ve Z koordinatlarında bregma üzerine hareket ettirin. Ardından, kafanın düz olup olmadığını belirlemek üzere koordinatlarını belirlemek için matkabı kaldırıp lambda'ya taşıyın.
Kafatasını iyice kuruttuktan sonra, aplikatör ile bir damla kendinden aşındırmalı diş yapıştırıcısı uygulayın. Diş yapıştırıcısını 40 saniye boyunca diş UV ışığı ile kürlemeden önce 60 saniye bekleyin. Parlak bir yüzey, yapıştırıcının kafatası ile etkili bir şekilde çapraz bağlandığını gösterir.
0,031 inçlik bir matkap ucunun yardımıyla, kafatasına dakikada 5.000 rotasyonda veya RPM'de iki taraflı olarak iki çapak deliğini dikkatlice delin ve beyne delinmekten kaçının. Çapak deliklerinin delinmesini arttırmak için tuzlu su damlası uygulayın. Hipokampal derinlikteki elektrotların implantasyonu için, bregma'dan üç milimetre posterior ve üç milimetre yanal olarak delin.
Lambda'nın arkasındaki beyincik üzerindeki referans elektrodu için bregma'dan altı milimetre posterior ve sıfır milimetre yanal olarak bir çapak deliği açın. Daha sonra, altı pimli kaideyi monte edilmiş elektrotlarla stereotaksik çerçevedeki elektrot tutucuya monte edin. Elektrotları karşılık gelen çapak deliklerinin üzerine hizalayarak, iki bipolar elektrot ucunu sol ve sağ hipokampal çapak deliklerinin hemen üstüne yerleştirmek için kulaklığı yavaşça indirin ve gezinin ve gerekirse referans elektrodunu beyincik üzerindeki deliğin üzerinde duracak şekilde ayarlayın.
Hipokampal büküm elektrotları deliklerin hemen üzerinde olduğunda, Z eksenini sıfırlayın ve elektrodu yavaşça sağ ve sol hipokampusa eksi üç milimetreye indirin ve referans elektrotunu beyinciğin üzerindeki deliğe yönlendirin. Toz ve sıvıyı bir karıştırma kabında karıştırarak diş çimentosunu hazırlayın. Ardından, kafatası yüzeyini, elektrotları ve kafatası yüzeyi ile kaidenin tabanı arasındaki boşluğu diş çimentosu ile örtün.
Çimento kuruduktan ve sertleştikten sonra, elektrot tutucuyu stereotaksik koldan ayırın, kolu kaldırın ve tutucuyu kaideden çıkarın. Fareyi deri altından ketoprofen ve Normosol ile uyguladıktan sonra, hayvanı vivaryum kafesindeki ısıtılmış pedin üzerine taşımak için hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın. Tamamen uyandıktan sonra, tek hayvanı vivaryum kafesine geri getirin, hayvanı yumuşak yiyeceklerle besleyin ve ameliyattan 72 saat sonrasına kadar günlük kilo kaybını izleyin.
Temsili keman arsasında, farelerin yakılmış durum kriterine ihtiyaç duyduğu stimülasyonların sayısı gösterilmiştir. Fareler tipik olarak kindled duruma ulaştı veya 15 stimülasyondan sonra beş bilateral tonik-klonik motor nöbeti geçirdi. Spontan tekrarlayan nöbetlerin veya SRS'nin gecikmesi 10.7 olarak bulundu ve nöbetlerin ortalama sıklığı günde 1.3 nöbet idi.
Güvenilir SRS dağılımı, farelerin yaklaşık 23 gün boyunca epileptik olduğunu gösterdi. Temsili görüntülerde, hipokampus ve entorinal korteksin çeşitli alt alanlarında anti-NeuN pozitif nöronların veya nöronal ölümlerin sayısı görülebilir. İki bipolar elektrotun iki çapak deliğine sorunsuz bir şekilde girmesi önemlidir, bu nedenle çapak deliklerinin hemen üzerinde olmaları gerekir.
Ayrıca, diş çimentosunu dikkatlice uygulamak ve elektrot tutucuyu çıkarmadan önce tamamen sertleşmesine izin vermek önemlidir. Bu teknik, epileptik fareler üretmemizi ve bunları EEG kaydı ve aynı zamanda video kaydı ile sürekli izlememizi sağlar. Ve yaptığımız deneylerle, nöbetlerin sıklığını, süresini ve şiddetini azaltmak için gen terapisi gibi yeni tedavi stratejilerini test edebiliriz.
