Bu prosedürün genel amacı Drosophila'nın yetişkin bacağı için diseksiyon yöntemlerini göstermektir. Bu teknik, lütikül'ün bir kısmını temizler ve alttaki dokuyu nöronal ve kas mimarisini koruyacak şekilde açığa çıkarır. Bu prosedür, standart immünosik kimyasal teknikler kullanarak, tanımlanmış motor nöron çardaklar için nöromüsküler kavşağı karakterize etmemizi sağlar.
Diseksiyon özellikle nispeten uzun süreler boyunca meydana gelen yavaş dejeneratif değişikliklerin incelenmesi için yararlıdır. Zaman yönü önemli bir husustur, çünkü Drosophila larvalarının iyi karakterize edilmiş nöromüsküler kavşağı metamorfozun başlangıcından yaklaşık beş ila yedi gün önce stabildir. Tersine, yetişkin nöronlar yetişkin bir sineğin ömrü boyunca, vahşi tip, laboratuvarda yetiştirilen bir Drosophila melanogaster için yaklaşık 90 gün boyunca bulunur.
Teknik esnektir ve farklı hastalık modelleri için bir dizi genotipe uygulanabilir ve drosophila için bir model sistemi olarak mevcut bir dizi antikor kullanabilir. Bu prosedürün genel amacı Drosophila'nın yetişkin bacağı için diseksiyon yöntemlerini göstermektir. Bu teknik, kütikülün bir kısmını temizler ve alttaki dokuyu nöronal ve kas mimarisini koruyacak şekilde açığa çıkarır.
Bir boya fırçası kullanarak, yaklaşık 30 saniye ila bir dakika boyunca bir cam kuyuda veya tabakta soğuk metanollere uçar. Metanol, kütiküler hidrokarbonları çözünür ve sinekler artık sulu çözeltilerde yüzmek yerine batırılabilir. Kanatlarla, sinekleri PBS'ye dikkatlice aktarın.
Fazla metanol gidermek için buz gibi PBS'de üç kez durulayın ve pbs'deki sinekleri diseksiyon ve fiksasyona kadar buzda tutun. Bu noktada, sinekler mümkün olan en kısa sürede, tercihen 30 dakikadan daha az bir sürede parçalanmalı ve sabitlenmelidir. Soğuk PBS ile dolu silikon bir elastomer diseksiyon kabına uçar.
Beş numaralı Dumont tokaları iki çift kullanarak coxa metatorasik bacakları çıkarın veya Vannas makası ile bacakları kesin. Bacakları plastik bir kuyuya, bir mil PBS ile doldurulmuş 24 kuyu plakasına aktarın ve tüm bacaklar çıkarılıp kuyulara transfer edilene kadar plakayı buzda tutun. Genellikle kuyu başına 20 bacak kullanırız.
PBS çözümünü bir mililitre FA çözeltisi ile değiştirin ve bir somun makinesinde 30 dakika döndürün. Somun makinesi ayarı orta hızda ayarlanacaktır. Bu süre zarfında bacakların çözeltiye tamamen batırıldığından emin olun.
SK çözümünü çıkarmak için, bir mil PBS'yi üç kez hızlı bir şekilde yıkayın, ardından her biri bir mil PBS'de beş dakika boyunca ek üç yıkama yapın. Diseksiyon adımlarından önce ve sırasında dokuları buz üzerinde bir mil PBS'de tutun. Drosophila bacak anatomisine kısa bir genel bakış sağlamak için, coxa, trochanter, femur, kaval kemiği ve beş tarsal segment dahil olmak üzere bacak segmentleri belirtilir.
Burada, arka tarafta bulunan çıplak kütikül yerine duyusal kılların varlığı ile tanınan bacağın ön görünümünü görüyoruz. Proksimal-distal eksen ve dorsal-ventral eksenin yönelimi de endikedir. Bu diseksiyon prosedürü, proksimal uyluk kemiğinden küçük bir parça kütikül çıkarır, böylece kaval kemiği alakasal kasını içselleştirerek dorsally proje yürüten akson çardaklar çalışılabilir.
Önceki çalışmamız, tahminen nöroblast göz soyundan kaynaklanan belirtilen çardak üzerinde yoğunlaştı. İşlemin bu bölümünde, kütikülleri uyluk kemiğinin ön tarafından çıkarırız. Diseksiyon forsepsleri başarı için kritiktir ve beş numaralı süper ince forseps sonunda hafif bir bükülmenin, kütiküllerin dürtmek yerine yüzeysel olarak ele geçirildiğini sağlayan bir eğim sağladığını ve bu da dokuyu mahvedebileceğini bulduk.
Bacakları diseksiyon için PBS'deki silikon elastomer kabına aktarın. Bir çift toka kullanarak kaval kemiği segmentini sağ tarafta gösterildiği gibi silikon elastomer kabına sabitle. Diğer pervaneleri kullanarak eğim tarafı aşağı tuttu, uyluk kemiğinin distal ucunda bir parça kütikül alın ve trokantere doğru proksimal yönde çekin.
Uyluk kemiğinin proksimal ucu boyunca çıplak kas görünene kadar manikürden metodik olarak çıkarmaya devam edin. Tüm bacaklar parçalandıktan sonra, PBS'yi FA çözeltisi ile değiştirerek bacakları 30 dakika boyunca orta hızda bir somunu titreterek postalayın. Daha sonra, numuneleri bir mil PBS'de üç kat hızlı bir şekilde ve ardından PBT çözeltisinde her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
Dokuları bloke etmek için, bir mil PBT'yi PBT'de seyreltilmiş bir milyon% 5 normal keçi serumu içeren blokaj çözeltisi ile değiştirin. Parçalanmış bacakları oda sıcaklığında dört saat veya gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Blokaj çözeltisini çıkarın ve blokaj çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikorla değiştirin.
Burada, bir ila 200 seyreltmede büyük anti diskler kullanıyoruz. Tabakları bir çalkalayıcıya geri koyun ve bir gecede dört derecede kuluçkaya yatırın. Primer antikor inkübasyonunu takiben, primer antikorları bir mil PBT'de üç kez kısa bir süre ve ardından her biri 15 dakika boyunca üç kez yıkayın.
Dokuları bir değirmende tekrar bloke edin oda sıcaklığında en az iki saat veya dört santigrat derecede gece boyunca% 5 normal keçi serumu. Bloklama çözeltisini çıkarın ve uygun seyreltilmiş floresan konjuge ikincil antikorlardan 300 mikrolitre ekleyin. Ek olarak, kas etiketlemek için floresan konjuge phalloidin bir ila 2000 seyreltme ekleyin.
Kuluçkaya yatmak için kuyuları laboratuvar sızdırmazlık bandı ve kapakla kapatın. Ayrıca, floroforları ışıktan korumak için plakaları alüminyum folyoya sarın. Oda sıcaklığında altı ila sekiz saat veya dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın.
İlişkisiz ikincil antikoru çıkarmak için, birincil antikoru yıkarken daha önce açıklanan şekilde PBT ile yıkamalar gerçekleştirin. Bu adımdan sonra, numuneler artık monte edilip görüntülenebilir. Bacakları ön tarafa yerleştirin ve gerekirse ek montaj ortamı ile örtün.
Bir kapak kaymasının köşelerini bir kil topu boyunca hafifçe kazıyın. Elde edilen kil, slayt ve kapak kayması arasında bir ara parça görevi görecektir, böylece dokular ezilmez. Kapak fişini bacakların üstüne değene kadar bastırın.
Kenarları oje ile kapatın ve görüntülemeye kadar dört derecede saklayın. Yazılı protokolün dördüncü bölümünde açıklanan görüntüleme parametreleri kullanılarak konfokal mikroskopi ile görüntü. Diseksiyon protokolünü doğrulamaya yardımcı olmak için, düşük büyütmede faz kontrastı mikroskopisi ile ilk görüntü bacaklarınız.
İşte A panelinde solda iyi bir diseksiyon ve sağda kas liflerinin bozulduğu kötü bir diseksiyon örneği. Panel C, kasın bozulmadığı iyi bir diseksiyonun konfokal görüntüsünü gösterir. Buna karşılık, D paneli, okta belirtildiği gibi, kas liflerinin eksik olduğu diseksiyon sırasında hasar görmüş bir bacak gösterir.
Burada, nöronal süreçleri tespit etmek için anti yaban turpu peroksidazlı görüntülenmiş bacakları lekeledik, burada yeşil, anti disklerde büyük, postynaptik glutamat reseptör kümelemeyi kolaylaştıran, kırmızı ile gösterilen ve phalloidin kas etiketlemek için mavi ile gösterilen. İletilen bir ışık kanalı ile 20X büyütmede yakalandığında, parçalanmış bölgeyi görmek kolaydır. Antikorların kısmen ayrışmış bölgelere nüfuz ettiğini ve beyaz okla belirtildiği gibi lütikülden görülebileceğini unutmayın.
Bacak motor nöronlarının her biri kası içselleştirirken kalıplaşmış projeksiyonlar yapar. Çalışmalarımız, burada kutulu bölge olarak gösterilen ve beyaz okla gösterilen kaval kemiği alakatı kasını içselleştiren motor nöronlara odaklanmıştır. Sağ üstte 2X yakınlaştırmalı daha yüksek büyütme 60X'te, yeşil renkte gösterilen boutonları ve kırmızı renkte gösterilen DLG'yi etkili bir şekilde görüntüleyebilyiz.
Yakınlaştırmayı daha da artırmak veya 100X hedefine adım atmak, sağ altta gösterildiği gibi bouton boyutunun ve morfolojisinin ölçülmesine izin verir. İmmünostiymya ile birlikte bu diseksiyon tekniğini kullanarak, burada yaşlı H71Y bacaklarında gösterilen ALS'nin bir sod1 mutant modelinde, oklarda belirtilen vahşi tip kontrollere kıyasla H bağımlı bouton şişmesi olduğunu bulduk. Bouton boyutları sağdaki arı sürüsü arsasında ölçülür.
Ayrıca, H71Y mutantlarının zayıf lekeli HRP aksonlarında kırmızı renkte gösterilen aktif bölge işaretleyici Bruchpilot'ta bir azalma bulduk. Nörodejenerasyon incelemek için, her yerde bulunan protein agregaları genellikle FK2 antikoru tarafından tespit edilir ve burada FK2 pozitif puncta olarak gösterilir, yaşlı sod H71'in aksonlarında ve kaslarında oklarla gösterilen sağ tarafta uçar. Son olarak, mitokondriler, kaval kemiği alakateri kası içinde kırmızı renkte gösterildiği gibi, anti ATP5a monoklonal antikor kullanılarak immünositokimya ile görselleştirilebilir.
Mitokondrilerin H71Y mutantlarında yaşla birlikte genişlemiş olduğunu bulduk. Ustalaştıktan sonra, parçalanmış bacak hazırlığı ve ilişkili antikor lekeleme, çeşitli zaman noktalarında tercih ettiğiniz mutant için yetişkin nöromüsküler kavşaktaki moleküler değişiklikleri analiz etmenizi sağlayacaktır.
