Bu basit protokol, EV'leri etiketlemeye ve konfokal mikroskopi ile izlemeye izin verir. Örneğin, EV görüntüleme, terapötiklerde kullanılırken EV dağılımını değerlendirmede yardımcı olabilir. Bu teknik, herhangi bir özel işleve sahip olmadan konfokal mikroskopi ile EV göçünü ve kıkırdak eksplantlarında alımı kolayca izlemenizi sağlar.
Aynı protokol TÜP BEBEK veya in vivo deneyler için DEE'ler için de kullanılabilir. Sütunların önceden hazırlandığından ve ÇEV'lerin başlangıç hacminin, arınma adımı sırasında parçacıkların yaklaşık% 10'unun kaybolacağını göz önünde bulundurarak istenen nihai parçacık konsantrasyonuna ulaşmak için yeterli olduğundan emin olun. Hücre dışı veziklikten veya EV'den, numuneden ve kontrolden konsantre olarak başlayın.
Numuneleri, EV örneğinin başlangıç hacmine bağlı olarak 15 mililitre veya 500 mikrolitre konsantre tüpüne yerleştirin. Neredeyse kuru bir numune elde edilene kadar tüpleri üreticinin talimatlarına göre santrifüjlayın. Konsantre EV örneklerini 200 mikrolitre ile ve kontrol grubunu 100 mikrolitre seyreltici C ile yeniden askıya alın ve yeni 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.
EV örneğini her biri 100 mikrolitrelik iki aliquot'a ayırın. Aliquotlardan birini boya ile işaretleyin ve tedavi olarak kullanın. Diğerini işaretsiz bırakın, ancak EV örneği gibi işleyin ve nanopartikül izleme analizi ile EV konsantrasyonu ölçmek için kullanın.
2x boya çözeltisi hazırlayın, böylece seyreltici C'de elde eden PKH26 çözeltisi konsantrasyonu sekiz mikromolardır. Numunede 125 mikrolitre seyreltici C başına bir milimoler PKH26 bağlayıcı mikrolitre karıştırın. Örneklere eklemek için gereken hacmi 1:1 oranında hazırlayın.
1x boya konsantrasyonu ve dört mikromoler PKH26 konsantrasyonu elde etmek için PKH trombosit lysate türevi EV'lere 2x boya çözeltisi ekleyin ve numuneleri 1:1 oranında kontrol edin. NTA trombosit lisat türevi EV örneğine aynı pbs hacmini ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yaslanın.
Örneklere 1:1 oranında %5 sığır serum albümin-PBS çözeltisi ekleyin ve son hacmin yaklaşık 400 mikrolitre olduğundan emin olun. Etiketli EV'leri sütunla ilişkisiz boya ve spesifik olmayan boya etkileşimlerinden ayırmaya devam edin. Kapağı sütundan çıkarın, 400 mikrolitre PKH trombosit lisat türevi EV, NTA trombosit lysate türevi EV'ler ekleyin veya elde edilen tüm sıvıları kontrol edin ve atın.
Sonraki adıma geçmeden önce örneğin sütunu tamamen girmesini bekleyin. 600 mikrolitre PBS ekleyin ve tüm eluted sıvıyı atın. Bir sonraki adıma geçmeden önce PBS'nin sütunu tamamen girmesini bekleyin.
600 mikrolitre PBS ekleyin ve 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünde 600 mikrolitrenin bir kısmını toplayın. Yeni bir sütun için, protokolün başında belirtilen örneklerin konsantrasyonunu içeren adımları yineleyin. Sütuna daha önce elflenmiş 600 mikrolitre EV ekleyin ve eluted birimi atın.
Ardından 400 mikrolitre PBS ekleyin ve tüm zorlanmış birimleri atın. Sütuna 600 mikrolitre PBS ekleyin ve 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünde 600 mikrolitrenin bir kısmını toplayın. Kıkırdağı PBS ile iki kez yıkayın ve steril koşullar altında üç milimetre çapında biyopsi zımbası kullanarak kesin.
Eksplantları, 37 santigrat derecede%1 penisilin streptomisi, %5 CO2 ve %80 nem ile desteklenmiş DMEM-F12 orta boy 96 kuyu kültür plakalarına yerleştirin. İnflamasyon odaklı bir OA modeli oluşturmak için, hücre kültürü ortamını mililitre onkostatin M başına 10 nanogram ve tümör nekroz faktörü-alfa mililitresi başına iki nanogram ile destekleyin. Eksplantları PKH trombosit lizat türevli EV'lerin kuyusu başına 1 kez 10 ila 9. parçacıklarla tedavi edin veya onkostatin M ve tümör nekroz faktörü-alfa ile desteklenmiş hücre kültürü ortamında kontrol edin.
Ortamı kıkırdak eksplantları içeren 96 kuyu hücre kültürü plakalarından çıkarın. Her birine, el yazmasında açıklandığı gibi 200 mikrolitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Tüp bebek testini her saat sıfırdan beş saate kadar durdurun.
Kıkırdak eksplantlarını içeren hücre kültürü kuyularını 200 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın. Dört santigrat derecede üç saat boyunca düzeltmek için dokuya% 4 paraformaldehit 100 mikrolitre ekleyin. PFA'yı çıkarın, 100 mikrolitre PBS ekleyin, sabit dokuyu dört santigrat derecede saklayın ve örnekleri 48 saat içinde işleyin.
Farklı zaman noktalarında çekilen görüntüler, EV'lerin kondrositlere ulaşana kadar dokuya nasıl girdiğini ve zamanla kondrositlere nasıl girdiğini gösterir. Etiketli EV'ler, bir saatlik inkübasyondan sonra kondrositlerin etrafında zaten yerelleştirilmişti. EV'lerin ilk hacminin istenen son parçacık konsantrasyonuna ulaşmak için yeterli olduğundan emin olun.
Unutulmaması gereken bir diğer önemli şey de etiketli EV'leri önümüzdeki 24 saat içinde kullanmaktır. 24 saat içinde kullanılmazsa floresanlarda azalma meydana gelebilir. Bu teknik, araştırmacıların EV görüntülemesini geliştirmelerine ve biyoloji ve terapötiklerdeki EV'leri incelemelerine yardımcı olacaktır.
