Bu protokol, yetişkin zebra balıklarında ölçeklenebilir künt cisim travmatik beyin hasarına neden olmak için basit, hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu künt cisim travmatik beyin hasarına maruz kalma eden yetişkin zebra balığı, insanlarda gözlenen ve künt bir kuvvet TBI'sından muzdarip birçok özelliği gösterir. Prosedürü gösterenler Bay James Hentig ve Bayan Kaylee Cloghessy olacak.
Bir Petri kabını modelleme kili ile doldurarak başlayın. Daha sonra ek modelleme kili ile yükseltilmiş bir platform oluşturmak için parmakları veya bir çift forsepsin arkasını kullanın. Yükseltilmiş platformu uzunlamasına bir jilet kullanarak yaklaşık eşit iki yarıya bölün.
İki yarıyı, yetişkin bir balığın uzunluğunu barındıracak şekilde bir kanala dönüştürün. Balık vücudunun 2/3'lerini başı açıkta sabitlemek için duvarlar inşa etmek için ek kil kullanın. Yaralanma üzerine başın dönmesini veya geri tepmesini önlemek için duvarlara dik olarak maruz kalan baş bölgesinde küçük bir destek kalıplama.
Kanalın kenarlarının düşen ağırlığı engellemediğine emin olun. 22 kalibrelik çelik yanıp sönen 3 milimetrelik çelik disk oluşturmak için mini delik delme kullanın. Uyuşturulmış bir balığı, dorsal tarafı yukarı olacak şekilde kanal içindeki kil kalıbına kuyruk sıkışmasına tepkisiz yerleştirin, böylece vücudu yanlara sabitlenmiştir.
3 milimetrelik 22 kalibrelik çelik diski, istenen darbe noktasının üzerine ortalanmış olarak kafaya yerleştirin. Kafasının bir tarafa eğilmemesi için balığı dik olarak hizalayın, bu da düzensiz bir darbeye neden olabilir. Çelik veya plastik boruyu sabitlemek için standart bir halka standı ve kol kelepçesi kullanın, böylece borunun tabanı zebra balığının başının 1,5 santimetre üzerindedir.
Çelik plakanın üzerine hizalı olduğundan emin olmak için boruya bakın. İstenilen yaralanma şiddetine göre uygun bilyalı rulmanı seçin. Bilyalı rulmanı önceden belirlenmiş bir yükseklikten borunun aşağısına çelik plakaya bırakın.
Daha sonra yaralı balıkları izlenecek kurtarma tankına yerleştirin. Bir Petri kabını modelleme kili ile doldurun ve diseksiyon sırasında vücudu desteklemek için küçük bir boşluk oluşturun. Balıkları sırt tarafı yukarı olacak şekilde kil kalıbına yerleştirin.
Biri vücudun ortasından, diğeri de başın tabanının arkasına yaklaşık 5 milimetre olacak şekilde iki diseksiyon pimi yerleştirin. Optik siniri açıkça kesmek ve gözleri çıkarmak için bir çift 5 Dumont tokadı kullanın. 5 yabanarı bir ucunun sağ parietal plakanın altına yerleştirin.
Rostral uca doğru hareket eden kasıtlı bir makas hareketi yapın ve sağ ön plakayı çıkarın. Daha sonra balığı saat yönünde 90 derece döndürün. 5 ön ucun bir ucunun sol parietal plakanın altına yerleştirin ve sol parietal ve ön plakaları çıkarmak için aynı makas hareketini kullanın ve beynin tüm dorsal yönünü açığa çıkarın.
Maksillayı, koku ampullerinin korunacağı ve zarar görmeyeceği şekilde açıkça transekte etmek için 5 tokmak kullanın. Aynı kümesleri kullanarak, doğru opercle, preopercle, interopercle ve subopercle çıkarın. Daha sonra omuriliği açığa çıkarmak için kalvaryumun kaudal ucundaki kasları açıkça resect.
Kürsüleri kullanarak omuriliği açıkça transekte edin. Beynin altına dikkatlice yerleştirin ve beyni yavaşça calvarium'dan çıkarın. Metin el yazmasındaki talimatları kullanarak tüm beyni veya ilgi bölgesini parçalara ayırın ve beyni bıçaklamamaya veya kazımamaya dikkat ederek ince tokalar kullanarak beyni hemen küçük bir tartım teknesine yerleştirin.
Beyni katranlı kurutma tartı teknesine aktarın ve beynin ıslak ağırlığını kaydedin. Beyinleri, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde tartım teknesine düz bir şekilde yatırmak için yönlendirin. Daha sonra beyni ve kurutma tartım teknesini sekiz saat boyunca 60 santigrat dereceye ayarlanmış bir melezleme fırınına yerleştirin.
Beyni kurutulur sonra yeni bir katranlı küçük tartı teknesine aktarmak için, ince toparlayıpları birleştirin ve beynin ventral tarafından başlayarak yukarı doğru bir hareketle kepçeleyin. Islak bir sünger üzerinde kısmi bir kesi yapın. Ventral tarafı yukarıda olacak şekilde açıklığa her seferinde bir balık yerleştirin ve balığın vücuduna yaklaşık 40 milimolar EdU mikrolitre enjekte etmek için 30 kalibrelik bir iğne kullanın.
Daha sonra balıkları sistem suyuyla dolu tutma tankına geri verin. Beyinleri daha önce de belirtildiği gibi toplayın ve bir parçaya% 100 etanolden% 37 formaldehite kadar 2 mililitre içeren 9 mililitrelik bir cam şişeye grup olarak yerleştirin. Beyni bir rocker platformunda 4 santigrat derecede sabitle.
Beyinleri TFM'ye kuru buzun üzerine istediğiniz yönde gömmek için kriyostat aynası kullanın. Vasküler yaralanmanın bu model ile başarılı yaralanmayı tanımlamak için en kolay ve en belirgin patolojilerden biri olduğu bulunmuştur. Göstergeyi tanımlama yeteneği, yaralanma sırasında kullanılan balıkların suşu ile değişti.
Ab tipinde vasküler hasarın tanımlanması, pigmentasyon nedeniyle hafif veya orta derecede TBI ve hasarsız kontrol balıklarını ayırt etmek zordu. Yaralanmanın ardından, hafif TBI balıkları minimum yüzey aşınması gösterirken, ılımlı TBI balıkları sınırlı beyin kanaması gösterdi. Yaralanmanın boyutu şiddetli TBI balıklarında belirgindi.
Buna karşılık, albino veya Casper balığı kullanırken damar hasarı kolayca tespit edilebilir. Beyinkeninin yaralanmaya bağlı şişmesi ödem kullanılarak değerlendirildi. Buna karşılık, hem ılımlı TBI hem de şiddetli TBI anlamlı ödem, 1 dpi ve 3 dpi'ye sahipti, ancak hem ılımlı TBI hem de şiddetli TBI'nın akışkan içeriği 5 dpi hasarsız kontrollere benzeyen seviyelere geri döndü.
Bu künt cisim yaralanması, nöroaksileri kapsayan sağlam bir hücre çoğalması tepkisine neden oldu. Hasarsız kontrollere kıyasla forebranın ventrikül ve subventriküler bölgelerinde artmış EdU etiketlemesi gözlendi. Yaralı beyinler periventriküler gri bölgede, optik tekektal loblarda ve ön hipotalamusun yönlerinde hasarsız balık beynine kıyasla artan EdU etiketlemesi gösterdi.
Şiddetli TBI'ı takiben, arka beyindeki nörojenik bölgeler hasarsız beyne kıyasla hücre çoğalmasında artış gösterdi. Yaralanmanın uygun şekilde indüksiyonu için, balıkların kalıpta sabit ve stabil olduğundan ve merkez dışı darbeyi önlemek veya ağırlık düşürme yörüngesini değiştirmek için borunun düz olduğundan emin olun. Bu prosedür, özellikle tekrarlanan kafa travması veya yaralanmaya bağlı rejeneratif çalışmalar için geçerli olacak rejeneratif bir modele uygulanan hızlı ve uygun maliyetli bir künt cisim yaralanması indüksiyon yöntemi sağlar.
