İş akışı, kesinlikle kontrol edilen çevre koşullarında büyüyen hücrelerden oluşur, eriyen su / buz kullanarak hızla soğutur ve önceden optimize edilmiş formaldehit ve kuluçka süresi konsantrasyonu ile sabitler. Fiksasyon reaksiyonu daha sonra glisine veya tryps gibi birincil amino grup içeren bileşiklerin fazlalığı kullanılarak söndürülür. Hücreler toplanır, yıkanır ve dondurularak saklanabilir.
Sabit hücreler mekanik veya kimyasal olarak lize edilebilir ve lizat, ribozomal fraksiyonların moleküler boyutlarına, tortulama özelliklerine veya benzeşim belirteçlerine göre ayrılması için kullanılır. Yaklaşım, elektron mikroskopisinde spesifik faktörler içeren komplekslerin zenginleştirilmesi ve immün destekli saflaştırma ve tespiti için kullanılabilir çok yönlü malzeme ile sonuçlanır. Çapraz bağlantılı derin blokaj, RNA amplifikasyonu veya hibridizasyon bazlı analizler üzerine RNA dizilimi ve kütle spektrometresi mümkün hale gelir.
600 nanometrede 0,05 emici üniteden fazla olmayan başlangıç optik yoğunluğuna sahip bir yörüngesel çalkalayıcıda bir litrelik maya kültürü kurun ve 30 santigrat derecede pepton ve dekstroz ortamı kullanın. Dört santigrat derecede 5000 G'deki maya hücrelerinin sıvı süspansiyonunun peletlenerek uyumlu rotor ve santrifüj şişeleri ile bir hazırlık santrifüjü kurun. Büyüyen hücrelerin optik yoğunluğunun kaydını tutun.
Üstel büyüme aşaması ilgi çekiciyse, toplama sırasında 0,6 ila 0,8 emici ünite ve 600 nanometre arasında olmalıdır. Hücreler hazır olduğunda, kimyasal duman kaputunun içine 250 gram temiz ezilmiş su buzu içeren bir fırıncı ile bir buz kutusu kurun ve ayrıca 25 mililitre tripsin ve yeni satın alınan metanol stabilize 37% formaldehit çözeltisini kaputun içinde gösterin. En son hücre kültürünü buzu içeren fırıncıya dökün.
Daha sonra hacim üzerinde% 2.2 ağırlık üzerinde son konsantrasyona 75 mililitre% 37 formaldehit ekleyin, buz eriyene kadar karışımı yoğun bir şekilde karıştırın. Buz eridikten sonra, 10 dakika süreyle bir zamanlayıcı kurun 10 dakika kuluçkadan sonra, kültürü önceden soğutulmuş santrifüj şişelerine aktarın ve hücreleri dört santigrat derece, beş dakika boyunca 5000 G'de santrifüjleme ile peletleyin. Dönüş sırasında, 50 mililitrelik bir tüpü önceden soğutun ve buzda kalan formaldehitleri nötralize etmek için taze hazırlanmış glisin içeren A tamponunu saklayın.
Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüplerini buzla temas eden pelet tarafı ile buza yerleştirin. Tüpleri duman kaputuna getirin ve süpernatantı formaldehit atık kabına atın. 25 mililitrelik bir şerit kullanarak ve 50 mililitrelik bir tüpe aktararak eski tüplerden gelen hücre peletini 20 mililitrelik A tamponunda yeniden askıya alın.
A tamponu ile hacmi 40 mililitreye kadar yapın ve yıkama hücrelerini dört santigrat derece, beş dakika boyunca 5000 G santrifüjleme ile toplayın. Süpernatant atın ve hücre peletini 40 mililitre tampon A'da yeniden askıya alın, bu da glisin kontaminasyonunu gidermek için glisin içermeyen A tamponudur. Hücreleri tekrar 4 santigrat derecede santrifüjlemeyle peletleyin, 5000 G beş dakika.
Yıkamaları A tamponu ile bir kez daha tekrarlayın. Süpernatant atın ve hücre peletini buza yerleştirin. Tüpü peletle tartın, ıslak hücre kütlesi hücre kültürünün bir litresi başına yaklaşık bir gram olmalıdır.
Polistireni sıvı azotlu alüminyum folyo ile kaplı kutudan yaklaşık üç santimetre derinliğe kadar doldurun. Kutuya 50 mililitrelik tüpe dik olarak yerleştirin. Peletin 550 mikrolitre tampon A iki'de 10 saniye boyunca pipetleme ve girdaplama ile yeniden askıya alın.
Mikrolitre RNaz inhibitörü başına 40 üniteden oluşan 10 mikrolitre ve 10 saniye boyunca tekrar girdap ekleyin. Bir mililitre pipet kullanarak, hücre süspansiyonu sıvı nitrojen içeren 50 mililitrelik ikiye damlatın. Bir sonraki adıma hazırlanmak için, kuru buz üzerinde 1,5 mililitre çekirdeksiz tüpleri ve 10 mililitre paslanmaz çelik taşlama kavanozlarını önceden soğutun.
Donmuş hücre süspansiyon damlacığı temiz bir steril spatula kullanarak kavanozlara aktarın. Taşlama kavanozlarını bir dakika boyunca sıvı nitrojene batırın ve sıvı fazın bağlantının üzerinde kalmasını sağlayın. Bir dakikalığına ajitasyon için 27 Hertz'de bir Cryo karıştırma değirmeni kurun.
27 Hertz'deki mühürlü taşlama kavanozlarını mikser fabrikasında bir dakika ajite edin. Kavanozları daha önce olduğu gibi sıvı nitrojende yeniden soğutun ve bir dakika daha çalkalayın. Kavanozları 1,5 mililitre çekirdeksiz tüplerle birlikte kuru buz içeren buz kutusuna aktarın.
Küçük bir çelik spatula kullanarak, yastıklı öğütme tarihindeki sonuçları tüplere aktarın. Sonra tüpleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. İki T175 Şişesinde HEK 293 hücresi %60 ila %70 birışıklığa ve Dalbeko'nun modifiye Eagle orta ve %10 fetal sığır serumu 37 derece ve %5 karbondioksite kadar büyütür.
İstenilen sabitleme süresinden en az üç saat önce, T175 şişesinin medyasını tam olarak 30 mililitre önceden ısıtılmış komple ortamla değiştirin. Ezilmiş su buzu ile ağzına kadar bir buz kutusu hazırlayın ve gerekli tamponlar ve aynı zamanda bir buz ile birlikte duman kaputunda tutun. Hücreleri soğutmak için, T175 şişesini inkübatörden çıkarın ve maksimum yüzey teması sağlamak için resmen buza bastırın.
Kimyasal duman kaputunun içinde, matarayı yan tarafına yatırın, böylece ortam hücrelerin karşısındaki tarafta toplar. Pipet 168 mikrolitre 37% hacim formaldehit tarafından doğrudan havuzlanmış ortama tartılır. %0.2 formaldehit konsantrasyonu vermek.
Hemen karıştırın. Şişeleri 10 dakika daha buzda kuluçkaya yatır. Ortamı, hücrelerin karşısındaki şişe tarafından uygun bir atık kabına dökün.
Bir striptiz kullanarak, Dalbeko'nun fosfat tamponlu salinin 30 mililitresinde kalsiyum ve magnezyum iyonları olmadan pipet ve ayrıca hücrelerin karşısındaki tarafta hafifçe 50 milimoler glisin içerir. Şişeyi sallayarak karıştırın, flaşı yatay konuma getirin ve buzda 10 dakika daha kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi hücrenin karşısındaki şişe tarafından dökün ve hücreleri ayırmak ve yeniden askıya almak için yedi mililitre standart% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.
Şişeyi oda sıcaklığında beş, maksimum 10 dakika kuluçkaya bırakın. Şişeyi dikey olarak ve bir striptiz kullanarak bulun, şişe duvarlarından kalanları hafifçe yıkayarak müstakil hücreleri toplayın ve süspansiyonu buz üzerinde kurulu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Toplanan süspansiyon çözeltisini hemen 20 mililitre tam ortamla tamamlayın ve tüpü hafifçe çevirerek karıştırın.
Tüpü 100 G'de beş dakika ve dört santigrat derece santrifüjleyarak hücreleri peletleyin. Hücre peleli açıkça görülebiliyor olmalıdır. Medyayı dökün ve peleti 10 mililitre Dalbeko'nun fosfat tamponlu salininde glisinsiz olarak hafifçe yeniden askıya alın.
Tüpü beş dakika ve dört santigrat derecede tekrar 100 G'de santrifüjleyin Yıkama tamponunu dökün ve peletin 800 mikrolitre buz gibi Dalbeko'nun glisin içermeyen, ancak magnezyum ve kalsiyum iyonları içeren fosfat tamponlu salininde yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne yeni bir düşük protein bağlamaya aktarın. Tüpü 100 G'de 4 santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin.
Bir mililitre pipetter kullanarak süpernatantı dikkatlice atın. Bu aşamada, hücre pelezi eksi 80 santigrat derecede dondurulabilir veya hücre liziz adımına ilerleyebilir. Bir biyogüvenlik kabininde, iyonik olmayan, denatüre olmayan deterjana dayalı 300 mikrolitre lizis tamponu ve yedi mikrolitre arginaz inhibitörü ekleyin ve bir mililitre ucu kullanarak pipetleme yaparak iyice karıştırın.
Bir ila üç mililitre şırıngaya 25 kalibrelik bir iğneyi dikkatlice takın ve en az yedi yavaş yukarı doğru alım ve hızlı aşağı egzoz darbeleri kullanarak karışımı kuvvetlice pipetleyin. Şırıngayı ve iğneyi keskinin kutusuna atın ve işlemi 31 kalibrelik bir iğne ve 0,3 mililitre şırınga ile tekrarlayın. Şırıngayı ve iğneyi kesicinin kutusuna atın.
Hücre kalıntılarını gidermek için tüpü 12.000 G'de 4 derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir düşük protein bağlayıcı 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın. Hem hücre kalıntılarını hem de lisatları eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Çeviri kompleksleri tamponların iyonik bileşimine duyarlıdır. Magnezyum klorürün atlanması ve EDTA'nın eklenmesi yüksek sedimentasyon özelliklerini yok etti ve kalsiyum klorür daha iyi sonuç zirveleriyle sonuçlanırken, iyileşme marjinaldi. Böylece tampon 1'i seçtik.
Hacim formaldehit tarafından% 2.2 ağırlık polizomları mükemmel bir şekilde korudu ve hacim formaldehit tarafından% 4 ağırlığa kıyasla genel verimi düşürmedi. Memeli hücrelerinde, hacim olarak% 0.2 ağırlıkta çok daha düşük bir formaldehit konsantrasyonu kullanılmıştır. Daha yüksek konsantrasyonlar önemli poliribozomal malzeme kaybına neden oldu.
Lizate eklenen 15 milimoler EDTA ve sonraki tüm tamponlar, sabit hücrelerden elde edilen polizomal fraksiyonlar üzerinde belirgin şekilde daha az istikrarsızlaştırma etkisi gösterdi. Ve bu etki kısmen 50 milimolar EDTA ile% 4 sabit hücreden gelen malzeme ile çoğaltıldı, direndi, daha iyi açıldı. Glikoz tükenmesi maya üzerindeki en dramatik ve hızlı çevirisel inhibitör etkilerden birini ortaya çıkarır.
Hem sinir eklendi hem de lokal olarak neden olduğu durumlar neden oldu polizom demontajı hafifçe, ancak açıkça daha fazla polisomes düşük ilave glikozda tutuldu. Daha da önemlisi, sabit hücrelerden elde edilen polizomal malzeme, aç ve aç olmayan hücreler arasında, formaldehit fiksasyonunun dinamik çeviri süreçlerindeki farklılıkları korumaya uygunluğunu gösteren yüksek bir ayrım göstermektedir. Tacy paysake gibi yaklaşımlarda, iki aşamalı bir ultrasantrifüjleme kullandığımız tam rizomlarla iyi yerleşmeyen küçük ribozomal alt ünlemlerin kaldırılması, SSU, LSU, RS, RNaz dirençli diazomlar, DS ve sabit fraksiyonların elektron mikroskopisi ile onaylanan yüksek sıralı polizomların izolasyonunu sağlamak da anlayışlı olabilir.
Sabit olmayan hücrelerle karşılaştırıldığında, sabit hücrelerden elde edilen malzeme, en hızlı çökelten ribozomal fraksiyonlarda labile eIF4A'nın yüksek varlığını gösterdi. Manyetik IDG boncuklu kompleksler içeren eIF4A'yı yakalamak ve zenginleştirmek için eIF4A tapi suşundan sabit malzeme kullanarak, EIF4A'nın SSU ve RS'deki beta-aktinin ile karşılaştırıldığında seçici zenginleştirilmesini gözlemleyebildik, ancak RNase'nin bir sökülmesinde ikinci degradeden LSU fraksiyonlarını gözlemleyemedik. Diğer çevirisel dinlenme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, hücre zarları arasında formaldehit eyleminin hızlılığı ve çapraz bağlantıların ayrımsız doğası, çeviri karmaşık aralarının maksimum çeşitliliğinin korunmasını vaat eder.
Bulgularımız, çevresel değişikliklere veya stres koşullarına hızlı hücresel yanıt senaryolarında son derece geçici kompleksleri ve kanıtların yararlılığını stabilize etmek için hızlı formaldehit fiksasyonunun kullanılabilirliğine uygundur.
