Bu protokol, insan akciğer hastalığını ve bir tabaktaki gelişimi modellemek için indüklenmiş pluripotent kök hücreleri akciğer hücrelerine ayırt etmek için kullanır. Bu protokol önemlidir, çünkü birincil insan akciğer dokusunu elde etmek ve kültüre etmek zordur. Akciğer hücrelerini pluripotent kök hücrelerden ayırt ederek temel avantajları, insan akciğer gelişimini ve hastalığını incelemek için sürekli olarak belirli akciğer hücrelerinin tedarik edilmesidir.
Bu hücreler hücre kültüründe uzun süre korunabilir, gelecekteki uygulamalar için kriyoprezizonlanabilir ve gen mutasyonlarını incelemek için genetik olarak manipüle edilebilir. Prosedürü gösteren rachel McVicar olacak, laboratuvarımdan bir doktora adayı. Deneye başlamadan önce, azaltılmış bir büyüme faktörünü veya GFR'yi buz üzerinde bodrum membran matris ortamını yavaşça çözün ve eşit miktarda soğuk DMEM F12'de seyreltin.
P1000 uçlarını kullanmadan önce soğuması için dondurucuya yerleştirin. Daha sonra, 12 kuyu plakasının her kuyusunu% 50 GFR bodrum membran matris ortamının 500 mikrolitresi ile kaplayın ve fazla orta karışımı ve kabarcıkları kuyulardan çıkarın. Kuyu plakalarını 20 dakika ayarlamak için ıslak buzun veya dört santigrat derecede bir buzdolabının üzerine yerleştirin, ardından plakayı bir gecede 37 santigrat derece inkübatöre taşıyın.
Yüksek PSE'ler %70 izdiah süresine ulaştığında, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere 10 mikromoler ROCK inhibitörü Y27632 ekleyin ve ayrışmadan önce bir saat bekleyin. Ortamı emiş edin ve hücreleri PVS ile bir kez yıkayın. Kuyu başına 500 mikrolitre hücre ayırma ortamı ekleyerek IPSC'leri ayrıştırın ve %5 karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra kuyu başına 500 mikrolitre kök hücre geçirme ortamı ekleyin. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için P1000 ucu kullanarak hücreleri hafifçe pipetler. Daha sonra ayrışmış hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe ve santrifüje 300 kez G.Santrifüjasyonu takiben beş dakika boyunca aktarın, ortamı epire edin ve hücre peletini 10 mikromoler ROCK inhibitörü ile desteklenmiş bir mililitre mTeSR Plus medya ile yeniden biriktirin.
Hücreleri saydıktan sonra, 12 kuyu GFR orta kaplamalı plakanın her kuyusuna beşinci IPSC'lere iki kez 10 ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kesin endoderm veya DE indüksiyon ortamı eklemeden önce mTeSR Plus'ı aspire edin. İkinci ve üçüncü günlerde DE indüksiyon medyasını değiştirin.
Dördüncü gün, DE indüksiyon ortamını serumsuz bazal ortamla değiştirerek AFE indüksiyona başlayın. Altıncı günün sonunda AFE verimliliğini analiz etmeden önce üç gün boyunca AFE ortamını günlük olarak değiştirin. Yedinci günde, GFR bodrum membran matris ortamını daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde çözün.
Aynı zamanda, AFE medyasını aspire ederek ve kuyuları PVS ile yıkayarak akciğer progenitör hücre farklılaşmasına devam edin. Kuyuya bir mililitre hücre müfreze çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücre ayırma çözeltisi içeren Kuyulara bir mililitre söndürme ortamı ekleyin.
Yukarı ve aşağı hafifçe pipetleme yaparak hücreleri agrega olarak tutun. Tüm hücrelerin yerinden olduğundan emin olun, ancak beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleme için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için. Üstnatant çıkarın ve hücre peletini LPC indüksiyon ortamında yeniden diriltin.
Hücreleri sayın ve 100 mikrolitre soğuk GFR bodrum membran matrisi ortamına beşinci hücrelere 2,5 çarpı 10 ekleyin ve iyice karıştırın. Bir damlayı 12 kuyulu bir tabağa yerleştirin ve 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, kuyu başına bir mililitre LPC ortamı ekleyerek orta düşüşün tamamen suya batırılıp gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatmasını sağlayın.
Sekizinci günde, ROCK inhibitörü Y27632'yi çıkarmak için LPC ortamını değiştirin. Medyayı her gün değiştirmeye devam edin ve 16. 17. günde kuyuları yıkayın ve mililitre dispaz başına iki mikrogramdan 500 mikrolitre ekleyin.
Dispaz karışımını bir P1000 pipet ile pipetleyin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın, ardından karışımı pipetleyin ve 15 dakika daha kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, kuyuları içeren dispaziye söndürme ortamlarından bir mililitre ekleyin ve hücreleri konik tüplere aktarın. Santrifüjleyin ve peleti bir mililitre soğutulmuş PVS'de yeniden diriltin, ardından santrifüjü tekrarlayın.
Daha sonra peleti bir mililitre hücre ayırma ortamına yeniden ayırın. Hücreleri 37 santigrat derecede 12 dakika kuluçkaya bırakın, ardından eşit miktarda söndürme ortamı ve santrifüj ekleyin. Peletin bir mililitre söndürme ortamı ve 10 mikromoler ROCK inhibitörü Y27632'de yeniden dürt.
Kuyu başına sekiz kez 10 ila dördüncü hücreleri elde etmek için gereken birimi hesaplamak için bir hücre sayısı gerçekleştirin. Daha sonra aliquot, 1,5 mililitre mikro santrifüj tüplerine LPC hücre agregalarının hacmini ve 300 kez beş dakika boyunca santrifüj gerektirir G.Hücre peletini karıştırmadan fazla süpernatantı çıkarın ve 10 mikrolitre artık ortam bırakın. Hücre peletini 200 mikrolitre soğuk GFR bodrum membran matrisi ortamına yeniden depoleyin ve hücreleri hücre kültürü membran uçlarına aktarın.
30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Kuluçkadan sonra, kesici ucun bazolateral odasına bir mililitre 3D organoid indüksiyon ortamı ekleyin ve altı gün boyunca her gün taze ortamla değiştirin. 23. günde, ortamı 3D dallanma ortamına geçirin, ardından altı gün boyunca her gün ortamı değiştirin.
29. günde, 3D olgunlaşma ortamına geçin ve önümüzdeki altı gün boyunca ortamı iki günde bir değiştirmeye devam edin. DE indüksiyonunun dördüncü gününde, bağlı hücreler kompakt bir parke taşı morfolojisi gösterir. Çekirdekle kaplanmış kesin endoderm belirteçleri CXCR4 ve SOX17 ifade edildi ve endodermal farklılaşma doğrulandı.
Ön ön indüksiyon, daha sıkı sıkıştırılmış hücreler gösteren morfoloji ile yedinci günde doğrulandı ve FOXA2 ve SOX2 belirteçleri çekirdekle kaplandı. 3D akciğer progenitör hücrelerinin üretimi 3D sferoidler ve bir muhabir hücre hattında NKX2-1 GFP'nin endojen ekspresyonu ile doğrulandı. Üç haftalık bir farklılaşmadan sonra tüm akciğer organoidlerine, akciğer belirteçleri immünostokimya ile analiz edildi.
Organoidlerde çekirdeklerin kaplatığı morfogenez SOX2 ve SOX9 dallanma belirteçleri gözlendi. Bazal hücrelerin her ikisi de belirteç olan proksimal akciğer belirteçleri P63 ve KRT5, kulüp hücreleri için bir belirteç olan SCGB3A2 ile birlikte başarıyla tespit edildi. Distal akciğer belirteçleri Alveolar Tip II hücreleri için Pro SPC ve SPB belirteçlerini indükler.
Ve Alveolar Tip I hücrelerinin HOPX işaretleyicileri. Ek olarak, NKX2-1 ve ZO1 çekirdeklerle kaplanmış olarak ifade edildi. Sox9 ile birlikte ifade edilen fibroblastlar için bir belirteç olan Mezenkime akciğer hücresi belirteçleri PGFR Alpha distal mezenkimi temsil etti.
Vimentin de ifade edildi ve akciğere dağıldı. Bu işlemden sonra akciğer organoidlerine indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş endotel ve immün hücreler ile yatırım yapılabilir. Akciğer gelişimi ve hastalığı, epitel ve mezenkimal hücre popülasyonları arasında bir sinyalle ortaya çıkar, aynı zamanda endotel hücrelerinden ve makrofajlardan da kaynaklanır.
3D akciğer dokusu modeli sistemi klinik olarak insan hastalığı ve terapötikleri incelemekle ilgilidir.
