Bu protokol, şu anda kullanılan maya metabolomiklerine göre birçok avantaja sahiptir, çünkü yüksek özgüllüğe, yüksek hassasiyete sahiptir ve ayrıca izorik, izobarik, hidrofilik ve hidrofobik moleküller de dahil olmak üzere birçok farklı metabolit sınıfının profilini oluşturabilir. Bu protokolde kullanılan söndürme yöntemi tüm enzymatic reaksiyonları durdururken, metabolitlerin hücrelerden sızıntısını önemli ölçüde azaltır. Bu iletişim kuralında oluşturulan MS1 kitaplığı çeşitli MS2 çalıştırmalarındandır.
Dakikada 30 santigrat derece ve 200 devirde geceleme kültüründen sonra, kültürün mililitresi başına maya hücrelerinin sayısını belirleyin ve şişe başına 45 mililitre otoklavlı YP ortamı içeren iki Erlenmeyer şişesinin her birine beş mililitre sterilize edilmiş% 20 stok glikoz çözeltisi ekleyin. Her şişeye yedinci maya hücrelerine beş kez 10 eklemek ve maya hücrelerini dakikada 200 devirde 30 santigrat derecede en az 24 ek saat büyütmek için steril bir transfer pipet kullanın. Metabolit ekstraksiyonu için, kültürden sonra, maya hücrelerini santrifüjleme ile toplayın ve süpernatantı hızla çıkarın.
Tüpü kuru buza yerleştirin ve hücrelere eksi 20 santigrat derece kloroform, eksi 20 santigrat santigrat derece metanol mililitre, bir mililitre buz soğuk nano saf su ve 425 ila 600 mikron asit yıkanmış cam boncuktan oluşan 200 mikrolitre ekleyin. Boncuklar eklendiğinde, alüminyum folyo ile kaplı tüpü bir tutucu ile köpük tüp tutucu kitine yerleştirin ve metabolit ekstraksiyonu kolaylaştırmak için numuneyi dört santigrat derecede orta hızda 30 dakika boyunca girdaplayın. Daha sonra, üst sulu fazın orta döküntü ve proteinden ayrılmasına ve daha düşük organik fazlara izin vermek için numuneyi santrifüjlemeden önce tüpü buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya bırakın.
Üst sulu fazın yaklaşık 400 mikrolitresini, eksi 20 santigrat derecelik 800 mikrolitre içeren yıkanmış ve etiketli 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir mikropipette kullanın. Daha sonra numuneyi santrifüjlayın ve sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi analizine kadar sıfır derece depolama için süpernatantın üst kısmının 800 mikrolitresini etiketli bir kütle spektrometresi şişesine aktarın. Çıkarılan metabolitleri ayırmak için, numune şişesini 15 dakika ultrasonicate, ardından oda sıcaklığında üç adet 10 saniyelik girdap.
Girdaptan sonra, şişeyi sıvı kromatografın kuyu plakasına yerleştirin ve sütunu dakikada 0,25 mililitre akış hızıyla 45 santigrat dereceye ve kuyu plakasını sıfır santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, analiz için sıvı kromatografi gradyanlarını ayarlamak için tabloyu kullanın. Ayırmadan sonra, suda çözünen metabolitleri tanımlamak ve ölçmek için ısıtılmış elektrospray iyonizasyon ile donatılmış bir kütle spektrometresinde hem elektrospray iyonizasyon pozitif hem de negatif modlarda enjeksiyonun 10 mikrolitre numune hacmini kullanın.
Analizin sonunda, ham verileri uygun bir bileşik analiz yazılım programında açın ve analizde tanımlanan metabolitlere açıklama eklemek için kütle spektrasını eşleştirmek için kütle spektral parçalanma kitaplığını kullanın. MS1 ve izotop desenlerinin tam kütleleri, çevrimiçi veritabanlarını kullanarak metabolitlerin ek açıklamasına izin vermek için de tanımlanabilir. Ardından, ham verilerin MS2 spektrumunu aramak için veritabanları ve spektrumlar kitaplığını kullanın.
Ertesi gün, maya hücrelerini söndürdkten sonra, hücreleri 15 mililitre ABC tamponu ile iyice yıkayın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peleti bir mililitre taze ABC tamponunda yeniden kullanın ve hücrelere propidium iyot çözeltisinin 500 mikrolitresini ekleyin. Örneği girdap başına 10 saniye boyunca üç kez girdaplayın ve hücreleri ışıktan korunan buzda 10 dakika kuluçkaya bırakın.
Kuluçkanın sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri yıkama başına bir mililitre taze ABC tamponu ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, peletin 300 mikrolitre taze ABC tamponunda yeniden ıslatın ve elde edilen hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini bir mikroskop slaydına ekleyin. 593 nanometrelik bir ekscitasyon dalga boyunu ve 636 nanometre emisyon dalga boyunu ayarlamış filtrelerle hücrelerin diferansiyel girişim kontrastını ve floresan mikroskopi görüntülerini yakalamak için floresan mikroskobu kullanın.
Daha sonra parlak alan ve floresan görüntülerdeki hücrelerin toplam hücre sayısını saymak ve tek tek hücreler için boyamanın floresan yoğunluğunu belirlemek için uygun bir görüntü analiz programı kullanın. Modifiye hücre söndürme yöntemi, plazma zarı ve hücre duvarında eksi 40 santigrat derece söndürme yönteminde tamponlanmamış %80 metanolden önemli ölçüde daha düşük hasara neden olur. Gerçekten de, değiştirilmiş yöntem kullanılarak söndürmeye tabi tutulan hücrelerin neredeyse tamamı, plazma zarının ve hücre duvarının zarar görmediği maya hücrelerinin özelliği olan kırmızı floresan emisyonu sergiler.
Buna karşılık, 40 santigrat derecede tamponlanmamış% 80 metanol kullanılarak söndürmeye maruz kalan hücrelerin neredeyse tamamı, plazma zarının ve hücre duvarının önemli ölçüde hasar gördüğü maya hücrelerinin özelliği olan yeşil floresan emisyonu gösterdi. Modifiye hücre söndürme yöntemi ayrıca maya hücrelerinden suda çözünür metabolitlerin sızmasına eksi 40 santigrat derece söndürme yönteminde tamponlanmamış% 80 metanolden önemli ölçüde daha düşük neden olur. Suda çözünür metabolit standartlarının tutma süresi kayma değerleri önemli ölçüde daha düşüktür ve tepe şekilleri zwitterionic faz sütunu için ters faz sütununa kıyasla önemli ölçüde daha keskindir.
Sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi yönteminin bir diğer avantajı, farklı suda çözünür metabolitleri çeşitli yapısal, fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip verimli bir şekilde ayırmak için zwitterionic faz sütununu kullanma yeteneğidir. Propidium iyodür'ün karanlıkta durduğunuzdan emin olun ve orta fazı bozmazken üst fazı topladığından emin olun. MS2 spektral kitaplığının olmaması nedeniyle herhangi bir MSP'ye açıklama eklenemezse, bu yapıyı göstermek için bir NMR kullanın.
