Bu protokol, In Vivo İki Foton mikroskopinin uzun süreler boyunca aynı beyin yerinde hücresel dinamiklerin tekrarlayan görselleştirmesi için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu tekniğin avantajı, cns farklı hücre tipi arasındaki düzenleme, morfoloji ve fiziksel etkileşimler de dahil olmak üzere beynin hücresel elemanları, uzun vadeli değişiklikler görüntü mümkün kılar. Bu teknik özellikle hücre-hücre etkileşimleri, hücre dinamikleri ve beyin plastisite sırasında morfolojik değişiklikler ve nörodejenerasyon ortaya çıkarmada yararlı olabilir.
Bir çocuk veya genç yetişkin hazırlayarak başlayın, dört ila 10 haftalık, bir CX3CR1 GFP heterozigot fare, bu ağırlığında 17-25 gram, bir kafatası pencere implantasyonu için. Fareyi anestezi ettikten sonra, saç düzeltici kullanarak kafasındaki saçı, kulakların arasında, yaklaşık olarak göz seviyesinden boyun bölgesinin tepesine kadar tıraş edin. Fareyi stereotaktik cerrahi istasyonuna, burun konisine taşıyın ve kulak çubuklarını kullanarak başını stabilize edin.
İşlem boyunca fareyi ısıtma yastığında saklar. Her iki gözü yağ merhemiyle yağlayın, sonra 100 mikrolitre %0,25 bupivacaine enjekte edin ve 100 mikrolitre mililitre deksametazon başına dört miligram, subkutan olarak kesi yerinde. Devam etmeden önce en az beş dakika bekleyin.
Üç alternatif betadin ve %70 alkol le tıraşlı başı tazmaz. Sonra bir cerrahi bıçak veya makas ile bir orta hat kafa derisi kesi olun. Kafatası bölgesinin arkasından, kulaklar arasında, gözler arasındaki ön bölgeye kadar uzanır.
Kafatasını ortaya çıkarmak için kalan deriyi kesin. Kafa derisi ve altta yatan kafatası arasında bulunan bağ dokusunu %3 hidrojen peroksitle tazyir ve stereotaktik koordinatlarla görüntülenecek beyin bölgesini lokalize edin. Bir diş matkap ucu kullanarak kafatasıiçine yaklaşık dört milimetre, dairesel bir delik delin.
Delme sırasında, düzenli olarak beyin soğutmak için steril tuzlu ve pamuklu bezler ile kafatası nemlendirilir. Kemik enkazını temizleyin ve kafatası kemiğini yumuşatın. Bittiğinde, dikkatle sivri forceps ile kafatasının bu kısmını çıkarın.
Kafatası çıkarıldıktan sonra, dikkatle kraniyotomi tuzlu ile nemlendirilmiş küçük bir kapak cam yerleştirin. Steril bir mendil kullanarak fazla tuzlu eti kurutun. Sivri bir aplikatör kullanarak, pencere nin etrafına siyanoakrilat tutkal uygulayın ve beyin ve kafatası eklemek için izin.
Kafatasının geri kalanına astar tutkal uygulayın ve 20 ila 40 saniye boyunca bir kür ışığı ile tedavi. Son tutkal ile pencerenin etrafında bir kuyu oluşturun ve 20 ila 40 saniye boyunca bir kür ışığı ile tedavi. Kafatası üzerine küçük bir kafa plakası tutkal, kontralateral hemisfer üzerinde, kraniyotomi, astar tutkal ile, ve sonra son tutkal ile, 20 ila 40 saniye için her ikisi de kür.
Fare uyandıktan sonra, postoperatif analjezi olarak buprenorfin SR bir deri altı doz enjekte, hangi için yeterli olacaktır 72 saat. Sağlıklı bir iyileşme kolaylaştırmak için ekstra tuz gıda ile fare canlandırmak. İmplantasyon ameliyatından iki hafta sonra görüntüleme yapılabilir.
Bir ısıtma plakası ile 35 santigrat derecede muhafaza edilmelidir iki foton mikroskop aşamasında baş plaka monte etmek için vida kullanın. Fareye 100 mikrolitre kan damarı boyası enjekte edin, rhodamine B.Gent kranial pencerenin yüzeyini %70 etanolle dabbed pamuklu bir bezle temizleyin. Pencereye birkaç damla su veya tuzlu su koyun ve objektif lensi çözeltiye indirin.
Amaç alçaltılırken lazerin kapalı olduğundan emin olun ve mercek ten bakarken ana kan damarı simgelerini göstermek için bir rota haritası çizin. İki fotonlu görüntüleme sırasında belirli bölgeleri tanımlamak için bu çizimi kullanın. İki foton görüntüleme kullanarak floresan hücrelerin ve damarların görüntülerini toplayın.
Görüntüleme parametreleri için metin el yazmasına bakın, kesin bölgelerin sonraki bir görüntüleme için tekrar ziyaret edilebilmesini sağlamak için uygun koordinatlarla dikkatli notlar alın. Bu ilk görüntüleme oturumunda birkaç görüş alanı gibi çizin, görüntülemenin sonunda fareyi sahneden alın, anesteziden uyanmasına izin verin ve ev kafesine geri götürün. Sonraki seanslarda alanların yeniden görüntülenmesi için elde edilen notları ve görüntüleri kullanın.
Bu protokol, Tayvan YFP-H hat farelerinde Microglial Dynamics In Vivo'da görselleştirmek için kullanılmıştır. Özel dendritler, beyin bölgelerinin ince haritalama için istikrarlı dönüm noktası olarak görev yaptı. Dendritler stabil olmakla birlikte, bazı mikroglialar günlük hareket eder.
Tek transgenik CX3CR1/GFP fareler, sekiz haftaya kadar mikroglia takip etmek için kullanıldı. Rhodamine B enjeksiyonları, her görüntüleme seansı sırasında vaskülatür etiketlemek için kullanılmıştır. Vaskülatür stably sabit kalırken, mikroglia dinamiktir.
CX3CR1/GFP fareleri, şiddetli nöbetler öncesi ve sonrası mikrogliayı takip etmek için kullanıldı. Vasküler yatak yapısı korundu, ancak mikroglial hücresel ağ ve pozisyon manzara geçici oldu. Nöbetlerden sonraki 24 ila 48 saat içinde daha büyük değişiklikler gözlendi.
Çift transgenik CX3CR1/GFP ve NG2DS-Kırmızı fareler, mikroglia izlemek için kullanıldı, ve NG2 pozitif hücrelere In Vivo. Vaskülatür etiketlemeden, mikroglia yanı sıra damar ilişkili parazitler, ve oligodendrosit öncühücreleri, ya da OPCs, tespit edildi. Parazitler vasküler duvar boyunca takip uzun süreçler var, ve OPCs genellikle beyin parankim içinde bulunan büyük hücre organları göstermek, uzak vaskülatür.
Rhodamine B kullanıldığında, parazitlerin parlak floresansı, görüntüleme sırasında benzer uyarmalara rağmen, luminal rhodamine'nin sönük floresansından ayırt edilebilir. Günlük görüntüleme parazitlerin stably konumlandırılmış olduğunu gösterdi, OPCs ve mikroglia dinamik iken. Alanın görselleştirildiğine dair dikkatli bir gözlem yapmak, mümkün olduğunca doğru bir temsili harita çizmek ve başlangıç noktasına göre diğer yerlere ulaşmak için atılan adımları belirtmek önemlidir.
Sonraki görüntüleme oturumlarında, bu adımlar, elle çizilmiş haritalar ve daha önce çekilen görüntüler, aynı konumların tekrar tekrar tanımlanmasında kritik öneme sahip olacaktır. Bu teknik, araştırmacıların hem sağlık hem de patolojide uzun süreli nöron-glial etkileşimleri, nöro-immün etkileşimleri ve nöro-hücre dinamiklerini açıklığa kavuşturmasına olanak sağlamıştır.
