Bu protokol, canlı ve yaşlanan C.elegans ilgi bir protein in bozulması izleme ve nicelik sağlar. Bu in vivo ve noninvaziv teknik, Dendra2'yi parlak ve kararlı bir florofora güvenilir bir şekilde dönüştürmek için kurulmuş sadece küçük bir mikroskobu gerektirir. Bu yöntem memeli sistemlerine ve zebra balıklarına uyarlanabilir.
Çalışma, proteostatis ağı içinde ciro koymak yanı sıra ulaşım ve kaçakçılık. Mavi ışık lazeri ile tarama yaparken Dendra2'nin istenmeyen dönüşümlerini kışkırtmamaya ve her sistem ve füzyon proteini için edinme ayarlarını ve dönüşüm ayarlarını test etmeye ve optimize etmeye özen. Deney için istenilen yaşa 20 santigrat derece yaş uyumlu nematodlar büyüyerek başlayın.
Görüntüleme deneyi günü, çift distile suda % 3 konsantrasyonda genel sınıf agarose eritin. Agarose soğurken, erimiş agarose yaklaşık 400 mikrolitre aspirasyon kolaylaştırmak için bir mililitre pipet ucu ucu kesti. Dikkatle temiz bir cam slayt üzerine agarose birkaç damla ekleyin ve hemen iki cam parçaları arasında agarose ince bir yastık oluşturmak için damla üstüne başka bir slayt yerleştirin.
Agarose kuruduğunda, dikkatlice üst slayt çıkarın. Yeterli slayt hazırlandığında, konfokal mikroskop yazılımını açın ve uyarma ve emisyon için ışık yolunu ayarlayın. Yeşil Dendra2 için 486 ila 553 nanometre ekleyin ve kırmızı Dendra2 için 580 ila 740 nanometre ekleyin.
Florofor yoğunluğuna göre her iki kanalın gücünü ve kazancını ayarlayın ve iğne deliğini tamamen açacak şekilde ayarlayın. Sıralı bir kanal modu seçin ve parçayı her kareyi değiştirecek şekilde ayarlayın. Bir satır adım ile 1024 tarafından 1024 olarak çerçeve ve çerçeve boyutu olarak tetkik modu ayarlayın.
Ortalamayı ikiye ve tek yönlü çizginin ortalama yöntemine ve moduna göre ayarlayın. Bit derinliğini sekiz bitolarak ayarlayın. Dendra2'nin dönüştürülmesi için çok boyutlu edinme ayarını tanımlayın.
Dönüştürme ve ağartma için, 405 nanometre diyot lazer% 60 enerji gücü ayarlayın kullanın. Döngüler ve normal bir başlangıç ve durdurma arasında 0,0 milisaniyelik bir aralık ile iki döngüden oluşan bir zaman serisi seçin. Ağartmayı iki kişiden birini tarayadıktan sonra başlayıp 30 yineleme için tekrarlayacak ve yoğunluk %50'ye düştüğünde duracak şekilde ayarlayın Sonra, dönüşüm için hızlı ve anlık bir görüntü yakalamak için ortama dönüştürme için edinme pikselinin hızını tanımlayın.
Nematodları slaytların üzerine monte etmek için, her slaytta agarose pedin in zıttı üzerinde dört kareiçeren bir pencere çizmek ve numaralandırmak için kalıcı bir işaretçi kullanın. Agarose pedin ortasına 15 mikrolitre levamisole ekleyin ve damlacık içine yaşa uygun nematodlar için aktarmak için bir stereo mikroskop ve tel çekme kullanın. Yavaşça kare bir pencereiçine her nematode taşımak için bir kirpik toplama kullanın.
Tüm nematodlar yeniden konumlandırıldığında, görüntüleme sırasında nematodları etkisiz hale getirmek için sıvının üzerine bir kapak kayma koymadan önce solucanların hareket etmesini bekleyin. Daha sonra, confocal mikroskop aşamasına slayt yerleştirin. Yeşil Dendra2 dönüşüm için, ilk nematod bulmak ve baş veya kuyruk odaklanmak için yeşil floresan altında 20 X hedefinin gözlük kullanın.
Konfokal moduna geçin ve doymuş, ancak aşırı pozlanmış olmayan bir görüntü elde etmek için kazancı ve lazer gücünü artırın veya azaltın. Seçilen nöronun etrafına ilgi alanı çizin ve ilk ilgi bölgesini içeren kuyruğun etrafına ikinci bir daha büyük ilgi bölgesi çizin. Edinilecek, ağartılacak ve analiz edilecek ilk bölgeyi ayarlayın.
Satın alınacak ve analiz edilecek, ancak ağartılmayan ikinci ilgi bölgesini ayarlayın. Tarama hızını maksimuma ayarlayın ve seçilen Dendra2 nöronları dönüştürmek için taramayı başlatın. Dönüşümden hemen sonra, kırmızı kanalda Dendra2 görselleştirmek ve dönüştürülmüş nöron ilgili odak ve ilgili maksimum projeksiyon bulmak için yeşil 561 nanometre lazer ile canlı tarama başlar.
Hızlı bir şekilde daha düşük bir piksel dwell hızına tonlamak ve daha yüksek bir çözünürlükte her iki kanal anlık görüntü elde. Bu resim, dönüştürmeden sonra sıfır zamanda kabul edilir. Ardından, tarayıp tanımlanabilir bir ad ve veya sayı yla tazyikkaydedin ve ardından sıfır etiketini etiket.
Zaman içinde Dendra2 bozulmasını izlemek için, ilgili nematod nöronun times sıfır görüntü açın. Aynı görüntü ayarını kullanarak, kırmızı kanalda canlı tarama yapmaya başlayın ve dönüştürülmüş kırmızı nöronu odak haline getirin. Ardından, herhangi bir edinme parametrelerini değiştirmeden, ilk görüntüyle aynı hızda anlık görüntü elde edin.
Dendra2'yi verimli ve yeterli bir şekilde dönüştürmek ve farklı zaman dilimleri boyunca aynı edinme parametrelerini korumak için dönüşüm ayarınızı dikkatle tanımladığınızdan emin olun. Dönüştürülmüş Dendra2 görüntülerini analiz etmek için Fiji'deki sıfır ve ikinci nokta görüntülerini açın ve Analiz et ve Ölçümleri Ayarla'yı açın. Alan ve Tümleşik Yoğunluk işlevlerini seçin ve kırmızı kanalla elde edilen görüntüyü seçin.
Çokgen Seçim Aracı'nı kullanarak, sıfırın dönüştürülmüş nöron etrafında bir ilgi alanı çizin. Nöronun hatlarını düzgün bir şekilde tanımlamak için yoğunluk eşiklerini vurgulamak için Görüntü, Ayarla ve Eşik'i seçin. Seçim tanımlandıktan sonra Çözümle ve Ölç'i tıklatın.
Seçilen ilgi alanı için alan, tümleşik yoğunluk ve ham tümleşik yoğunluk değerleri de dahil olmak üzere bir açılır sonuç penceresi görüntülenir. İkinci zaman noktasından görüntü için aynı seçim ve ölçüm işlemini gerçekleştirin. Ardından, değerleri elektronik tabloya kopyalayın.
Dönüştürmeden önceki bu temsili analizde, örnek kırmızı kanalda heyecanlandığında kırmızı sinyal görünmüyordu. Işınlama üzerine, yeşil sinyal HTT-D2 dönüştürüldü ve daha sonra kırmızı bir sinyal ortaya çıktı azaldı. HTT-D2 ekspresyonu zamanla bozulmuş, kırmızı HTT-D2 sinyal düzeylerinde azalma ve daha fazla füzyon proteini yeni sentezlendikçe yeşil HTT-D2 sinyalinin olası bir artışına neden oldu.
Özellikle, kuyruk bölgesinin nöronlar baş ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha aktif olduğu tespit edildi. Ayrıca, kontrol HTTQ25-D2 24 saat dönüşümden sonra, daha sonra baş ve kuyruk nöronlar hem de iki saat sonra önemli ölçüde daha fazla bozulma oldu. Bu fark patojenik HTTQ97-D2'de gözlenmemiş, ancak proteostaz ağının sinir sistemi boyunca daha uzun glutamin uzantıları içeren HTT-D2'yi çıkaramadığını düşündürmektedir.
HTTQ97-D2 çok eski nematodlarda HTTQ25-D2 kadar verimli bir şekilde bozulmadı ve proteostaz ağının yaşlı hayvanlarda toplu ve muhtemelen zehirli Huntingtin türlerini ortadan kaldıramadığını vurguladı. Daha da önemlisi, kuyruk nöronlar genç nematodlarda toksik HTTQ97-D2 ile başa çıkabildiler, bu da htt-D2'yi çıkarmak için çeşitli eşlik eden proteostaz ağ mekanizmalarının iş başında olabileceğini düşündürmektedir. Dönüşümden hemen sonra her örnek için aşırı pozlanmış ve doymamış görüntü elde edin ve doymamış görüntü elde edin ve bu örnek için aynı ayarı zaman içinde yeniden kullanın.
Bu protokol ile, bir proteostatis ağındaki değişiklikleri test etmek ve ayrıca, süper çözünürlüklü mikroskopi yardımıyla, hastalıkla ilişkili proteinlerin yayılmasını izlemek mümkündür.
