Lipozomlar ile en araştırma cesur teknikler özünde tüm lipozomlar aynı olduğunu varsayarak güveniyor. Tek lipozomlar incelenerek önemli inhomojeniteler görülebilir. Burada sunulan tek lipozom tekniği, yüzlerce lipozom'u aynı anda incelememize ve boyut ve kompozisyonlarındaki homojenlikleri tespit etmemize olanak sağlar.
Yöntem kolayca protein membran etkileşimleri gibi tek bir lipozom düzeyinde diğer sistemleri incelemek için ayarlanabilir. İhtiyacınız olan tek şey floresan etiketli olmak için çalışma bileşiktir. Bu video ile, araştırmacılara tek lipozom çalışmalarını nasıl yapabilecekleri konusunda bir araç salıyoruz.
Biz bu tsay kolayca diğer bilimsel konularda bir dizi çalışma için değiştirilebilir açık olduğunu umuyoruz. Başlamak için, taze bir cam şişe de POPC 138 mikrolitre ve kolesterol 120 mikrolitre hazırlanan lipid stokları karıştırın. Daha sonra her biri floresan olarak etiketlenmiş iki lipid ve 50 mikrolitre DSPE-PEG-biotin 50 mikrolitre ekleyin.
Cam şişenin kapağını gevşetin ve şişeyi sıvı nitrojen içinde 1-2 dakika dondurun. Bir dondurma kurutucu bir gecede dondurulmuş lipid karışımı lyophilize. Sabah, kuru lipidler için 200 milimolar D-sorbitol tampon bir mililitre ekleyin.
Karışımı 45 dereceye ısıtın ve en az bir saat boyunca manyetik karıştırmaya maruz bırakın. Daha sonra sıvı nitrojen şişe daldırma ve süspansiyon tamamen dondurulana kadar bekleyin lipid süspansiyon dondurun. Daha sonra, karışım tamamen çözülene kadar 55 santigrat derece bir ısıtma banyosunda dondurulmuş süspansiyon daldırma.
Karışımı toplam 11 donma-çözülme döngüsüne maruz bırakın. Bundan sonra, bir mini ekstrüzyon kiti kullanarak, bir kez 800 nanometre polikarbonat filtre ile lipozom süspansiyon ekstrüzyon. 1, 200 mikrolitre BSA ve 120 mikrolitre BSA biotin'i karıştırın.
Sekiz kuyulu bir slaytta her kuyuya 300 mikrolitre karışım ekleyin ve kaydırağı oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Slama hafifçe yatırın ve her birinin kenarından ortamı yerleştirin. Hemen her kuyuya 300 mikrolitre HEPES tampon ekleyin.
Her kuyuda toplam sekiz kez yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca streptavidin 250 mikrolitre ekleyin ve kuluçka. Daha önce açıklandığı gibi sekiz yıkıntıtekrarlayın.
Skalı mikroskoba yerleştirin ve mikroskop joystick'ini odanın yüzeyine odaklanacak şekilde ayarlayın. Bu kolayca bir kılavuz olarak cam tampon arayüzü artan lazer yansıma sinyali kullanılarak yapılabilir. Bir mikrosantrifüj tüp, 20 mikromolar toplam lipid içeren seyreltilmiş lipozom stok 10 mikrolitre ekleyin.
100 mikrolitre tamponu hazneden mikrosantrifüj tüpüne aktarın, düzgün cerenle ve 110 mikrolitreyi hazneye geri aktarın. Mikroskop altında oda koymak ve lipozom lar yüzeyde hareketsiz olan lipozomlar gözlemlemek için lipozom floropores gelen sinyal tespit yeteneğine sahip bir rudimental mikroskop ayarı kullanın. El yazmasında açıklandığı gibi mikroskobu ayarlayın.
Lipozomlarda hem DOPE ATTO488 hem de DOPE ATTO655 floroporları görüntülemek için birden fazla kanalı görüntüleyin. Çapraz uyarmayı önlemek için her kanalın sırayla görüntülediğinden emin olun. Örneğin, ilk 488 nanometre heyecan verici ve 495-590 nanometre emisyon okuma tarafından bir görüntü almak.
Bundan sonra, ayarları değiştirmek ve 633 nanometre heyecan verici ama sadece 660-710 nanometre emisyon okuma başka bir görüntü almak. Analiz. Görüntü menüsünde, renk seçin ve iki kanal bir bileşik oluşturmak için birleştirme kanalı işlevini kullanın. İki farklı kanalda görüntülenen lipozomların iyi bir eş yerelleştirme gösterip göstermediğini veya görünür sürüklenme olup olmadığını gözlemleyin.
Parçacıkları algılamak için eklentiler menüsünü açın, ComDet'i seçin ve parçacıkları algıla'yı tıklatın. ComDet'te ayarların doğru olup olmadığını kontrol edin ve Tamam'a basın. Analizi çalıştırdıktan sonra, sonuçları ve özet göstermek ile iki açılır pencere. Sonuç tablosu, iki kanal arasındaki yoğunluk oranını içerir.
Ortak yerelleştirme verilerini içeren veri tablosu sonuçlarını dışa aktarın. Gaussfonksiyonu ile yoğunluk oranı histogram uygun ve ortalama ve standart sapma ayıklayın. Ortalama ve standart sapma, homojenlik derecesini hesaplamak için kullanılabilir.
50 nanometrelik bir filtre ile birkaç kez ekstrüzyon edilmiş bir lipozom formülasyonu hazırlayın. Floresan yoğunluğunu DLS'den alınan boyut verileriyle karşılaştırarak lipozomların boyutunu kalibre edin. Daha önce olduğu gibi aynı deneysel mikroskop ayarları ile kalibrasyon lipozomları görüntü.
Kalibrasyon lipozomlarının floresan yoğunluğunun kare kök yoğunluğu histogramını çizin. Bir günlük normal dağılımı ile histogram sığdırın ve geometrik ortalama olarak kalibrasyon lipozomların ortalama floresan yoğunluğu ayıklayın. Kare kök yoğunluğu ile lipozom boyutu arasındaki ilişkiyi belirlemek için, dinamik ışık saçılma ölçümlerinden elde edilen ortalama lipozom çapını kare kök yoğunluğunun geometrik ortalamasıyla bölerek düzeltme faktörünü hesaplayın.
Bileşimsel homojenlik deneyindeki lipozomlar için kare kök yoğunluğu değerlerini hesaplayın ve düzeltme faktörüile çarparak bu iki çapı dönüştürün. Bileşimsel homojenlik lipozomlar için çapın bir fonksiyonu olarak yoğunluk oranı değerini çizin, böylece yaklaşık 50 nanometreden 800 nanometreye kadar uzanan lipozom popülasyonu için lipozom boyutunun bir fonksiyonu olarak homojenliği elde edin. Bu protokolde, lipozomların başarılı yüzey immobilizasyonu, lipozom çözeltisinin kırınım sınırlı yoğunluk noktaları ile belirtilen odaya eklenmesiyle hemen ortaya çıkmıştır.
Bu çerçeve başına 300 ila 400 lipozom yoğunluğu elde etmek için yeterli lipozomlar immobilize önerilir. Daha düşük bir yoğunluk veri analizini daha fazla zaman alıcı hale getirirken, daha yüksek bir yoğunluk tek lipozomları ayırt etmeyi zorlaştırır. Tüm görüş alanı düzgün odaklanmıyorsa, örnek plaka eğimli olabilir.
Ayrıca, lipozomlar büyük ve bulanık görünüyorsa, bu odadaki tamponun buharlaştığını ve yüzeyin kuruduğunu gösterir. Yoğunluk oranı histogramlar genellikle ortalama oran değeri etrafında bir Gauss dağılımı ortaya koymaktadır. Gaussdağılımından güçlü sapmalar gözlenirse, daha zayıf bir sinyal gösteren bir lipozom alt kümesinin dışlandığını düşündüren bir algılama duyarlılığı sorunu gösterir.
Gauss fonksiyonu ile yoğunluk oranı histogram ı tutturduktan sonra, 0.23'lük bir homojenlik değeri, topluluğun ortalama azı azı oranının %23'ünden fazla sınanarak nüfusun %32'sine çevrildi. Deneysel belirsizliğin nicelikselliği 0.1 olarak bulunmuştur. Tsay çok yüksek kaliteli unilaminar lipozomlar esastır kullandığınız malzemelerden daha iyi asla.
Bu nedenle bunları hazırlarken, donma-çözülme döngülerini dışarıda bırakmak gibi köşeleri kesmeyin. Kötü görüntüler yüksek deneysel belirsizliğe yol açacak ve homojenliği abartmanızı sağlayacak, bu yüzden iyi odaklama görüntüleri elde etmek için zaman ayırın. Titrenin temel olarak yaptığı şey floresan etiketin yüzey yoğunluğunu incelemektir.
Bu floresan etiket percolated lipid üzerinde ise, o zaman bu test ilaç teslimi için kaliteli test lipozomlar için kullanılabilir. Kurulum peptidler membranlar bağlamak ve eğrilik duygusu nasıl çalışma için uygulanmıştır. Bu, araştırmacılara peptidlerin hücrelerin içinde nasıl sıralandığını yöneten moleküler ipuçlarına benzersiz bilgiler vermiştir.
