Bu protokol ökaryotik hücrelerde birçok mikro RNA eşzamanlı modülasyonu sağlar ve moleküler klonlama adımları en aza indirgeyen çok basit ve esnek bir yönteme dayanmaktadır. Bu teknik in vitro mikro RNA fonksiyonel etkileşimlerin çalışması için etkileri vardır, ama daha da önemlisi tedavide mikro RNA daha etkili bir kullanım için bir platform sağlar. Biz esas olarak geliştirdik ve beyin kanseri bağlamında kullanılan, ancak gen ekspresyonunun birden fazla değişiklik söz konusu olan herhangi bir hastalık için geçerlidir.
Yapay trans genlerimizi meme ve tiroid kanseri çizgileri gibi bu tekniğin tekrarlanabilirliğini gösteren diğer modellerde test ettik. Biyoinformatik ve mikro RNA biyolojisi temel bilgi bu protokol için yararlıdır, ancak vazgeçilmez değildir. Biyoinformatik yaklaşımı, ilgili mikro RNA kombinasyonlarını ve TRK-11'i tanımlamak için önemlidir, ancak mikro RNA işlemeye aşinalık ölçülebilir bir şekilde bu farklı mikro RNA'ların belirli hücrelere stabil hale geldiklerinde başarılı bir şekilde işlenebilen yapay DNA kümeleri halinde nasıl biraraya getirilebildiğini anlamak için önemlidir.
Çanak kaplama için, ilk mililitre başına 100 mikrogram konsantrasyonda suda poli-D-lizin eritin. 25 santimetre kare yüzeybaşına bir mililitre çözelti miktarında çözeltiyi tabağa dökün. Tüm çanak kapsama emin olmak için çanak girdap.
Altı saat sonra poli-D-lizin çözeltisini aspire edin ve PBS ile iki kez durulayın. Orta hücre orta, astrositik farklılaşma orta veya nöronal farklılaşma orta ya da orta beş mililitre başına 100, 000 hücre miktarında plaka insan nöral kök hücreleri. Hücre kaplamasonra, bir hafta boyunca 37 derece santigrat ve yüzde beş karbondioksit bir kuvöz de çanak yerleştirin ve el yazmasına göre mikro RNA ifade analizi gerçekleştirmek için devam edin.
Kültür IÇIN GBM-34 glioblastoma kök benzeri hücreler, bir kez on beşinci hücreler ve nörobazal orta beş mililitre ile 25 santimetre kare düşük eki şişe başlar. Şişeyi 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte bir kuvöze yerleştirin. Kaplamadan 48 saat sonra, her yedi günde bir DNA alkilleyici ajan temozolomid konsantrasyonlarını iki katına ekleyin.
Beş gün boyunca beş mililitre orta takviye beş mikromolar TMZ eklenmesi ile başlayın. Beş gün sonra, orta kaldırmak ve temozolomide olmadan taze orta ile kalan hücrelerin kurtarmak için izin vermek için değiştirin. 48 saat sonra, başka bir beş gün için 10 mikromolar temozolomide ve kuluçka ekleyin.
En az 100 mikromolar konsantrasyonu ulaşılana ve hücreler ilaca dirençli hale gelene kadar katlama temozolomid tedavisini tekrarlayın. Direnç indüksiyonundan sonra, 1 mililitre Lysis reaktifi kullanarak yalan hücreleri. Toplam RNA ayıklayın ve el yazmasına göre spesifik mikro RNA'ların ekspresyonunu analiz edin.
Daha önce tanımlanan her mikro RNA'nın öngörülen targetome'sini elde etmek için mikro RNA hedefleme tahmin araçlarını kullanın. TargetScan'ın ön sayfasından, önceden doldurulmuş açılır menüden ilgi çeken mikro RNA'yı seçin. Gönder düğmesini tıklatın.
İndirme tablosu bağlantısını kullanarak ortaya çıkan hedef listesini elektronik tablo olarak indirin. Yanlış pozitif tahmin olasılığını azaltmak için, yalnızca korunan siteler sütunu ve akış aşağı analizi içindeki hedefleri içerir. Ek mikro RNA tahmin programları daha fazla sıkılık elde ve sadece tüm algoritmalar için ortak hedefleri içerir.
Sonra, ToppGene 20'yi aç. Her mikro RNA'da ortak olan yolların zenginleşmesini değerlendirmek için, eğitim gen kümeleri penceresinde elde edilen hedeflerin listesini yapıştırın. Giriş türü olarak HGNC Sembolü'ne tıklayın.
Gönder ve başlat'ı tıklatın. Program genlerin girilen listesi için en önemli GO kategorilerini gösteren bir çıktı tablosu sağlar. Sonunda ortak bir yol veya hücresel sürecin düzenlenmesi için her mikro RNA katkısını kurmak için, Biyoinformatik ve Evrimsel Genomik web sitesinde sağlanan venn-diyagram fonksiyonu açın.
Elde edilen her targetome'yi belirli hücresel süreçte yer alan genlerin tam listesine karşı kontrol edin. İlgi çeken her mikro RNA'lar için hedef haberci RNA'ları ilgili pencerelerdeyse, listeyi kopyala-yapıştır'ı yükleyin. Her listeyi benzersiz bir tanımlayıcıyla adlandırın.
Gönder'i tıklatın. Program her sektörde genlerin numaraları ile bir venn-diyagram görsel bir çıkış yanı sıra her alt küme ve kesişim kombinasyonları için haberci RNA tam bir listesini sağlar. Seçilen mikro RNA'ları fonksiyonel trans gende gruplandırmak için miR-17-92 küme lokusu temel alınarak transgenik bir iskele elde edin.
Topluluklu genom tarayıcısından nükleotit dizisini edinin. Lokusun altı kodlanmış mikro RNA saç tokasını ve çekirdek dizisinin hem akıntıya hem de aşağı akışına kadar en az 200 nükleotit yan dizisini kapsayan yaklaşık 800 baz çifti çekirdek dizisini seçin. Sırayı herhangi bir sözcük düzenleme programına yapıştırın.
MiR tabanında nisasında alarak altı doğal saç piminin her birinin dizisini tanımlayın. Bu dizilerin her birini daha önce tanımlanmış çekirdek dizisinin açıklığı içinde işaretleyin. Her saç tokası arasındaki tüm diziler spacer dizilerini temsil eder.
Daha sonra, miR tabanından trans genifade edilmesi amaçlanan mikro RNA'ların saç tokası dizilerini elde edin. Mikro işlemci bölünmesi nin olduğu yerlerdeki spesifik nükleotitleri dikkatlice not edin. Yeni saç tokaları için bir kabul olarak hizmet edecek her saç tokası hem beş ve thee biter üç ila beş nükleotitler hariç çekirdek dizisinden yerli saç tokası dizileri silin.
Daha önce silinmiş saç tokaları yerine istenilen mikro RNA'ların saç tokası dizilerini yapıştırın. Trans geninin her iki yan bölgesine de istenilen kısıtlama dizilerini ekleyerek alt klonlamayı tercih edilen teslim vektörlerine ekleyin. Seçilen kısıtlama dizilerinin dizinin içinde bulunmadığını doğrulayın.
Trans genin iki boyutlu yapısını doğrulamak için, tam transgenik sırayı RNA yapı tahmin yazılımı programı RNA Webfold'a kopyalayın. Standart program ayarlarını seçin ve devam et'i tıklatın. Özellikle mikro işlemci dekolte sit alanına en az 11 nükleotit proksimal olan çift telli kök yapılarının varlığında iyi tanımlanmış saç tokalarının varlığı için grafik çıktısını analiz edin.
Ayrıca, saç tokası dizileri içinde dallanma noktalarının yokluğu na bakın. Bu noktada trans gen gen sentezi ile üretilmeye ve istenilen iletim vektörlerine klonlenmeye hazırdır. Bu yöntem, nöronal farklılaşma sırasında özellikle ifade edilen beyin tümörlerinde sürekli olarak düzenlenmiş olan üç mikro RNA'dan oluşan bir modülün karakterizasyonuna olanak sağlamıştır.
Genotoksik stres sırasında mikro RNA modüllerinin ko-ekspresyon desenleri doğrulandı ve bu üç mikro RNA arasında güçlü bir sinerjik aktivite önerdi. Tasarlanan trans gen aynı anda glioblastoma hücrelerinde üç mikro RNA ekspresyonunu özetleyebilir, hem in vitro hem de in vivo, tümör biyolojisinde önemli bir girişim ve çevirisel uygulanabilirlik vaat edilir. Ayrıca, transgenik küme de bir meme kanseri modelinde fonksiyonel oldu.
Bu protokolün en önemli gereksinimleri trans gendeki işlemci dekoltesinin orijinal boyutunu korumaktır. Ve şimerik mikro RNA saç tokalarının kök döngü yapısının korunduğundan emin olun. Bu yöntemle, birden fazla biyolojik olarak aktif mikro RNA genini çok kısa DNA dizilerine yoğunlaştırabiliriz ve bu da gen terapisi için herhangi bir doğum vektörlerine tam anlamıyla vitrrol takılabilir.
Bu yöntem, farklı mikro RNA'lar arasındaki fonksiyonel etkileşimi incelemek ve aksi takdirde birden fazla ilaç kombinasyonu gerektirecek karmaşık multifaktöriyel hücresel yolları müdahale etmek için idealdir.
