Evrim hızlandırıcı dediğimiz bu mikroakışkan on-chip modeli, tek bir hücre düzeyinde iyi tanımlanmış çevre koşulları içinde kanser dinamiklerinin uzun vadeli, gerçek zamanlı kantitatif çalışmalar için kontrol edilebilir bir platform sağlar. Bu teknoloji, kanserin evrimsel dinamiklerini tümör benzeri bir stres ortamında araştırmamızı sağlıyor. Morfoloji, popülasyon, hareketlilik ve hücresel düzeyde zaman içinde göç gibi bilgileri sağlar.
İyi kontrollü stres gradyanları altında karışık tümör popülasyonlarının davranışlarını kontrol etme ve izleme becerisi ile teknolojimiz klinik öncesi ilaç gelişimi için fizyolojik olarak daha uygun bir model sunabilir. Sunulan basınçlı sızdırmazlık paketleme yöntemi, ortam gazı bileşiminin ve aşağı akım deney kapasitesinin sofistike ayarını gerektiren diğer mikroakışkan sistemlerde de uygulanabilir. Uzun süreli bir deneyi başarıyla gerçekleştirmenin anahtarları, fiziksel ve biyokimyasal olarak istikrarlı bir ortamı güvence altına almaktır.
Sıcaklık, nem ve gaz bileşimi gibi faktörler her zaman izlenmelidir. Başlamak için, bir 3D baskı makinesi üzerinde eşzamanlı gaz geçirilebilir kültür yemekleri tutmak için yeterli bir plaka tutucu imal. Vidalı sürücü ile özelleştirilmiş üç iyi örnek plaka bileşenleri sökün.
Bileşenleri UV ışınlarıile en az bir saat dezenfekte edin ve steril bir ortamda bırakın. Hücre hattı tohumlama başlatmak için 10 santimetre kültür çanak her PC3-Epi veya PC3-EMT hücre kültürüne trypsin beş mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece bir kuvözde beş dakika tripsinizasyon çalıştırın. 15 mililitrelik santrifüj tüpler içine kültür yemekleri hücreleri aktarın ve daha sonra üç dakika boyunca 150 kez g santrifüj.
Supernatant atın. 15 mililitrelik santrifüj tüplerinde hücre peletlerinin her birini yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak her PC3-MP veya PC3-EMT'nin hücrelerini sayın. Her hücre türünün dördüne toplam 2,5 kez 10 ayırın.
İki yalıtılmış hücre türünü karıştırın ve iki mililitre kültür ortamı ekleyin. Üç gaz geçirbilebilir kültür yemeklerinin her birine hücre kültürünün iki mililitretohum. Hücrelerin bağlanması için gece boyunca 37 santigrat derecede kuvözde geçirilebilecek gazı bırakın.
PDMS cihazlarını UV ışınları ile en az bir saat dezenfekte edin ve steril bir ortamda bırakın. Şimdi hem karbondioksit ve oksijen kontrol üniteleri, bir gaz pompası, bir gaz karıştırma odası, bir nemlendirici veya kabarcık, ve gaz vanaları üç ayrı setleri ve basınç göstergeleri oluşan bir gaz besleme sistemi kurmak. Alternatif olarak normoksia koşulu sağlayan bir gaz besleme sistemi kullanın.
Karıştırma odasındaki bağıl nem oranının %85'in üzerine çıkarıldığından emin olun, kapak ve alt plaka için ayrı ısıtma alt üniteleri ile 37 derecede sahnede bir kuluçka termal kontrol ünitesi ayarlayın. Ertesi gün kuvözden gaz geçirgen kültür yemekleri çıkarmak ve ayrıntılı bileşenleri sırayla olduğunu belirlemek, Her iyi bir gaz geçirgen kültür çanak tutucu, bir PDMS yonga tutucu, bir cam pencere tutucu ve 35 mililitre genişliğinde cam pencereler bir çift sahiptir. Bu bileşenleri monte etmek ve gaz geçirbilebilir kültür çanak kelepçelemek için donatılmış vidakullanın.
Daha sonra önceden ısıtılmış kültür ortamını bir vakum odasına aktarın ve 20 dakika gazdan arındırın. Hidrofililiği korumak için PDMS çipini oksijen plazma sisteminde 30 saniye tedavi edin. Sonraki yük iki şırınga yavaş yavaş 10 mililitre gazsız büyüme ortamı ve diğer iki şırınga ile 10 mililitre gazdan arındırılmış istenilen reaktif ile.
Örneğin uyuşturucu ile medya ve medya. Her bir şırıngayı, 23 gauge dağıtım iğnesi ile 50 santimetrelik bir boruya bağlayın. Tüpün diğer ucuna içi boş bir çelik pim takın.
Boruyu astarlamak için ortamı boruya bastırın ve çelik pimi kapama katmanı ndan her PDMS yongasına takın. Rezervuar katmanını doldurun ve PDMS desen katmanını ortamla ıslayın. Rezervuar tabakası mikroakışkan desen içine girmesini hava kabarcıkları önlemek için çip kabarcık tuzak olarak çalışır.
Sonra kültür medyası ile bir mililitreşşon yükleyin. Şırıngayı, 23 kalibrelik bir dağıtım iğnesi ile beş santimetrelik bir boruya bağlayın. Tüpün diğer ucuna içi boş bir çelik pim takın ve boruyu asal.
Daha sonra çıkarılacak aşırı ortam için çipin orta deliğine içi boş çelik pimi yerleştirin. Ön güvertede çip başına iki 10 mililitreşli şırınga yükleyin ve diğer iki şırıngayı şırınga sisteminin geri çekilme güverteye yerleştirin. Mikrokabarcıkları mikroakışkan desene sokmamak için, önceden ısıtılmış ve gazsız ortamlardan bir mililitresini 35 mililitrelik derin gaz geçirilebilir kültür yemeğine dağıtın.
Talaşları doğrudan gaz geçirgen kültür membranlarının üzerine yerleştirin, talaş sıvı yüzeye 15 derecelik eğim açısıyla yaklaşır. PDMS yongasını PDMS yonga tutucuyla sıkıştırarak PDMS aygıtını aşağı doğru itin. Çipin kurumasını önlemek için PDMS cihazının üzerine bir fırın ördeği bantlayın ve PDMS yonga tutucusuyla kenetleyin.
Dizi nin etrafındaki ortam akış hızını saatte 20 mikrolitre olarak ayarlayın. Tüm plakayı sahnedeki inkübatöre yerleştirin ve ters bir mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirin. Gaz besleme sistemini gaz borusu ile gaz kanallarına bağlayın ve gösterge basıncını 0,2 PSI'da koruyun.
Bu, cihazın sızdırmazkalmasını sağlamak için gaz geçirilebilir kültür membranını yüklü PDMS yongasına karşı basınçlandırır. Yavaş yavaş orta delikten bir mililitre şırınga kullanarak çip aşırı medya ayıklayın. Ortamı ayıklarken mikroskop altında çipi gözlemleyin ve talaş mühürlendiğinde çıkarmayı bırakın.
Sahnedeki inkübatörün sıcaklık algılama ünitesini üç kuyu plakasına bağlayın ve 37 dereceye ayarlayın. Bu çalışmada PC3 dış stres varlığı olmadan bir evrim hızlandırıcı kültürlü hizalanmış iken büyüme eğrileri vardı. Çip boyunca pozisyon fonksiyonu olarak hücre çoğalma profilinin özdeşliğini düşündüren.
Eğrilerin ilk eğimi çoğalma oranını ortaya çıkarır. Cihazdaki hücreler için iki katına çıkarma süresi yaklaşık 24 saattir. Pc3-EMT ve mCherry ifade eden GFP pc3-Epi hücre astarlı evrim hızlandırıcı ortak kültürlü edildi.
%40'tan başlayarak birliktelik üç gün içinde %40'lık bir büyüme gösterdi. Toplam birleşimin büyüme eğrisi lojistik büyüme modeli şeklinde iken. PC3-EMT nüfusu genişlemeye devam etti ve PC3-Epi asimptotik fazda bastırıldı.
PC3-Epi ve PC3-EMT hücreleri yoğun cihazın merkezinde oturuyordu ve boş bölgeye serbestçe göç etmesine izin verildi. Her iki fenotiphızın normalleştirilmiş histogramı PC3-EMT hızının PC3-Epi'den 1.8 kat daha yüksek olduğunu göstermektedir. Kültür medyası önceden ısıtılmalı ve gazdan arındırılmalı.
PDMS çipi düzgün bir şekilde ıslanmalıdır ve hafifçe işlenmelidir. Basınç sızdırmazlık yöntemimizin yumuşak yeniden sızdırmazlığı sayesinde birçok alt akım deneyi önceden oluşturulabilir. Subklinik popülasyon ekstraksiyonu, lokal metabolit analizi ve mekansal olarak çözülmüş immünfloresans ve sıralama gibi.
Teknolojimiz, karmaşık bir süper mikro ortamda önemli bileşenleri ve etkileşimleri kapsamlı bir şekilde yeniden üretmenin bir yolunu göstermektedir. Ancak nicel, güvenilir ve tekrarlanabilir veriler sağlamak için yeterince basit.
