Geliştirdiğimiz bu protokoller siyanobakterilerin ve bunların serbest bırakılan ürünlerindeki salgı mekanizmalarını, yani hücre dışı karbonhidrat polimerlerini ve proteinlerini incelemek için önemlidir. Üretilen bilgi bize çeşitli uygulamalar, yani biyoteknolojik ve biyomedikal uygulamalar için bu ürünleri özelleştirmek için izin verecektir. Bu protokoller çok basittir.
Bunlar, üretim yapan organizmaya, kullanıcının ihtiyaçlarına ve ürünün son uygulamasına göre uyarlanabilir. Bu protokollerin en büyük avantajı, diğer canlı sistemlere, özellikle de diğer bakterilere kolayca adapte edilebilmelidir. Bu protokoller çok kolay.
Ancak, bir bakteriyel zorlanma veya gerekli saflık derecesine bağlı olarak bazı değişiklikler tanıtmak gerekebilir. Başlamak için, standart koşullar altında siyanobakteriyel zorlanma yetiştirmek. Büyümeyi standart protokolleri kullanarak ölçün.
Daha sonra, diyaliz membranları içine kültür aktarın ve sürekli karıştırma ile 24 saat boyunca deiyonize su en az 10 hacimli karşı diyaliz. 15 dakika boyunca 4 santigrat derece de 15, 000 kez g de kültür santrifüj. Supernatant'ı yeni bir şişeye aktarın ve peleti atın.
Hücre duvarı enkazı veya lipopolysaccharides gibi kirleticimaddeleri temizlemek için 15 dakika boyunca 4 santigrat derecede 20, 000 kez g tekrar santrifüj. Santrifüjden sonra, supernatant'ı cam bir kabına aktarın ve peleti atın. Polimer çökelti için, supernatant için% 96 etanol iki cilt ekleyin ve bir gecede dört derece santigrat süspansiyon kuluçka.
Çökelmiş polimerin küçük veya görünür olmayan miktarları için süspansiyonu 13,000 kez g'de 4 santigrat derecede 25 dakika santrifüj edin. Yavaşça supernatant atın ve otoklavlı deiyonize su bir ila iki mililitre pelet resuspend. Sulu süspansiyonu bir şişeye aktarın.
Görünür için, çökelmiş polimer büyük miktarda, bir şişe steril metal forseps ile çökelmiş polimer toplamak. Polimer sıkmak ve aşırı etanol atın. Donma-kurutma olarak bilinen lyophilization işlemini gerçekleştirmek için, eksi 80 santigrat derece bir gecede çökelmiş polimer ile şişeleri tutun.
Polimeri en az 48 saat boyunca lyophilize edin. Daha sonra kurutulmuş polimeri oda sıcaklığında daha fazla kullanılana kadar kurutucuda saklayın. Orta konsantre etmek için, ilk standart koşullar altında siyanobakteriler yetiştirmek.
Standart prosedürleri kullanarak siyanobacterium büyümesini izleyin. Daha sonra, 10 dakika oda sıcaklığında 4, 000 kez g kültürleri santrifüj. Supernatant'ı bir şişeye aktarın ve hücre peletini atın.
Ardından, decanted ortamı 0,2 mikron luk gözenek boyutu filtresinden süzün. Orta yaklaşık 500 kez konsantre etmek için, santrifüj konsantratörleri kullanarak üç kilodaltondan 4, 000 kez g ve 15 santigrat dereceyi maksimum bir saat santrifüj mermisi için kesin. Santrifüjden sonra, filtre cihazı örnek haznesi duvarlarını konsantre numune ile durulayın ve içeriği mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Maksimum ekzoproteom geri kazanımı sağlamak için otoklavlı kültür ortamı ile filtre cihazı örnek rezervuar ek bir yıkama adımı gerçekleştirin. Daha sonra ekoproteom örneklerini eksi 20 santigrat derecede daha fazla kullanılana kadar saklayın. Polimer çökeltme ve verim optimize etmek için etanol şiddetle eklenmelidir.
Çökelmiş polimersantrik sonra, şişe duvarına gevşek bağlı olabilir pelet resuspension önlemek için supernatant atılması dikkatle yapılmalıdır. Manuel filtrasyon yapılırsa, filtre zarının kırılmasını önlemek için nazik olmalıdır. Bazı çökelmiş polimerler sadece santrifüjden sonra görülebilir, özellikle şişelerin duvarlarında, Synechocystis EPS durumda gibi.
Siyanothece polimeri gibi diğer durumlarda, yağıştan hemen sonra cam kabın içinde yüzen polimer kümeleri görmek mümkündür. Bazı kontaminasyonlar polimer liofilizasyondan sonra makroskopik olarak kolayca tespit edilebilir, çünkü genellikle beyaz veya açık kahverengi polimer pigmentasyonunu değiştirirler. Turuncu polimerler karotenoidler veya bu pigmentleri içeren yapılar ile kontamine edilir.
Örneğin, yeşil polimerler hücre enkazı ve klorofil ile kontamine edilir. Ekoproteomlar bakteriyel suşbağlı olarak önemli ölçüde değişebilir. Örneğin, tek hücreli bir siyanobakteriden ekoproteom ve ipliksi bir türden gelen.
Eksoproteom konsantre numunelerde yüksek miktarda polisakkarit eksoproteom analizini engelleyebilir. Örneğin, protein ayrıştırma geciktirebilir ve maske daha az bol proteinler. Kullanıcı polimeri bileşimi, fiziksel/kimyasal özellikleri, test polimer biyolojik aktivitesi veya modifiye polimer bileşenleri açısından karakterize edebilir.
Protein tanımlaması için jel ve kütle spektrometresi proteinlerinin ayrılması yapılabilir. Veziküllerin ayrılması için eksoproteomun ultrasantrifüjü yapılmalıdır. Grubumuzda, bu protokoller zaten biyoremediasyon veya antitümör veya ilaç dağıtım ajanları gibi farklı alanlarda, siyanobakteriyel salgı mekanizmaları veya ekstrasellüler karbonhidrat polimerlerin uygulamaları çözmek için yol açmıştır.
