Bu protokolün önemi, DIC ve karanlık alan gibi diğer tekniklerden daha basit ve daha ucuz yüksek kare hızlarında yüksek kontrastlı görüntüler elde edebilen etiketsiz bir görüntüleme tekniği sunabilmesidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, uygulanması kolay ve kullanımı kolay olmasıdır. Bu ucuz ve kolayca floresan mikroskoplar ile kombine edilebilir.
Yöntem tek tek mikrotübülleri görselleştirmek için geliştirilmiştir. Büyük protein komplekslerini ve nano partikülleri görselleştirmek için kullanılma potansiyeline sahiptir. Ana zorluk yarım gümüş ayna eklemek için filtre küpü ile tamir etmek için gerekli aktivasyon enerjisidir.
Tekniği ilk kez deneyen birine tavsiyem bunu yapmak. Başlamak için, uygun bir filtre küpü kullanarak floresan mikroskobun filtre tekerleğine 50/50 ayna takın. Genellikle bir anti-yansıma kodlama var gibi dikkatli bir şekilde ayna kolu.
Aynı zamanda yüksek sayısal diyafram yüksek bir büyütme hedefi açın. Burada gösterilen 1.3 sayısal diyafram ile 100x yağ hedefidir. Daha sonra, plastik parafin film üç milimetre genişliğinde şeritler kesmek için düz bir kenar olarak bir jilet ve mikroskop slayt kullanın.
Plastik parafin film şeritleri üç milimetre ayrı temiz bir 22 tarafından 22 milimetrelik kapak kayma yerleştirin, sonra bir kanal oluşturmak için şeritler üstüne 18 tarafından 18 milimetrelik kapak kayma yerleştirin. Parafin filminin kapalı bir kanal oluşturması için kapak fişini 100 santigrat derecede 100 santigrat dereceden bir ısı bloğuna aktarın. Bir pipet kullanarak, perfüzyon ile bir anti-rhodamine antikor mililitre başına 50 mikrogram akış ve 10 dakika boyunca slayt kuluçka.
Kuluçkadan sonra, filtrelenmiş BRB80 kullanarak kanalı beş kez yıkayın, ardından filtrelenmiş BRB80'de %1 Poloxamer 407 ile akar ve yüzeyi spesifik olmayan bağlamaya karşı bloke edin ve kaydırağı 10 dakika kuluçkaya yatırın. Yine, filtrelenmiş BRB80 kullanarak kanalı beş kez yıkayın. Numunenin kurumasını önlemek için, kanalın sonuna filtrelenmiş BRB80'den iki damlacık ekleyin ve gerektiğinde daha fazla arabellek ekleyin.
Örneği mikroskop aşamasına yerleştirin ve epi-illumination ışık kaynağını açın. Örnek yüzeyi bulmak için parafin film kenarına odaklanın ve görünümü odanın ortasına ayarlamak için alanı hareket ettirin. Optik yol içindeki optik ışıktan gelen ışığın arkadan yansıması nedeniyle amaç yukarı ve aşağı hareket ettikçe birden fazla yüzey gözlemleyeceksiniz.
Daha sonra, alan diyaframını yarı yolda kapatarak ve ayar vidalarını kullanarak görüş alanında ortaladı. Diyafram düzgün hizalandığında, yeniden açın. Daha sonra, bertrand lens slayt arka odak düzlemi görüntülemek için, aynı zamanda objektif çıkış gözbebeği olarak bilinen.
Diyafram diyaframını çıkış gözbebeğinin kenarlarının ötesine kapatın ve diyafram diyaframını çıkış gözbebeğiyle ilgili olarak ortalamak için ayar vidalarını kullanın. Diyafram diyaframını açarak ve kenarlarını çıkış gözbebeğiyle eşleştirerek çift kontrol edin. Daha sonra diyafram diyaframını, hedefin sayısal diyaframının yaklaşık üçte ikisine ayarlayın.
Başlamak için, kameranın pozlama süresini 10 milisaniyeye ayarlayın ve aydınlatmayı kameradinamik aralığını neredeyse doygunlaştıracak şekilde ayarlayın. Daha sonra, 0,22 mikrometre filtrelenmiş BRB80 GMPCPP stabilize mikrotübüllerin 10 mikrolitre akış için bir pipet kullanın. Yüzeyin görüntülenmesinde mikrotübül bağlamasını izleyin.
10 ila 20 mikrotübül görüş alanına bağlandıktan sonra, filtrelenmiş BRB80 ile numuneyi iki kez yıkayın. Toplam 10 saniye lik bir zaman atlamave 10 saniyelik bir gecikme süresi oluşturarak mikrotübüllerin 10 görüntüsünü elde edin. Ardından, sahne denetleyicisini kanalın uzun ekseni boyunca kullanarak sahne görüntüsünü hareket ettirerek ve gecikmeden 100 görüntü elde ederek arka plan görüntüleri elde edin.
Beyin tubulin kullanarak mikrotübül dinamikleri görüntü için, 37 santigrat derece örnek ısıtıcı sıcaklığı ayarlayarak başlayın. Bir pipet kullanarak, 10 mikrolitre GMPCPP stabilize mikrotübül tohumu akışı ve yüzeycanlı görüntüleme tarafından yüzeye bağlayıcı onları izlemek. 10 ila 20 tohum görüş alanına bağlandıktan sonra, önceden ısıtılmış ve filtrelenmiş BRB80'in iki katı kanal hacmini kullanarak numuneyi yıkayın.
Sonra, polimerizasyon karışımı 10 mikrolitre akış. Mikrotübül büyümesini ölçmek için, 15 dakika boyunca her beş saniyede bir görüntü elde etmek için satın alma yazılımını kullanarak bir zaman atlamalı ayarlayın. Her zaman noktasında ortalama 10 görüntü elde ederek kontrastı artırın.
Önceki bölümde gösterildiği gibi arka plan görüntüleri edinin. Görüntüye giderek, yığın seçerek ortanca hesaplayın, sonra Z projesi, sonra ortanca. İşleme giderek, görüntü hesap makinesine giderek ve açılır menüden çıkarma seçerek ilgili arka planı çıkarın.
32 bit float sonuç seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Mikrotübül büzülmesi için, zaman gecikmesini sıfıra ayarlayarak ve pozlama süresini 10 milisaniyede tutarak saniyede 100 kare lik görüntüler elde edin. Girişim indüksiyon mikroskobu ile yüksek kontrastlı görüntüler elde etmek için önemli bir faktör düzgün aydınlatma sayısal diyafram ayarlamaktır.
Bu diyafram diyafram boyutu tarafından kontrol edilen objektif, çıkış gözbebeği aydınlatma kiriş boyutu rehberlik tarafından yapılabilir. Floresan etiketli stabilize mikrotübüllerden bir örnek kullanarak, mikrotübülleri floresan olarak görüntülerken mikroskobun odak noktası haline getirin. Kamera pozlamasını 10 milisaniyeye ayarlayın ve diyafram diyaframını en küçük açıklığına kadar kapatın.
Ayrıca, aydınlatmayı kameranın dinamik aralığını neredeyse doygunlaştıracak şekilde veya maksimum menzile ulaşılıncaya kadar ayarlayın. 10 veya daha fazla mikrotübül içeren bir görüş alanı akışı yaparak 10 görüntü elde edin. Ardından arka plan görüntüsü elde edin.
Diyaframın boyutunu değiştirin ve aydınlatma yoğunluğunu daha önce belirlenenle eşleşecek şekilde ayarlayın. 10 yeni görüntü ve yeni bir arka plan edinin. Diyaframın tüm aralığı tamamlanana kadar bu işlemi tekrarlayın.
Edinilen her görüş alanı için, ilgili arka planı çıkarın ve daha önce gösterildiği gibi ortaya çıkan arka plan çıkarılan görüntüleri ortalama. Daha sonra, her açılış boyutu için mikrotübüllerin arka plan gürültü oranına ortalama sinyali hesaplayın. Diyafram boyutunu arka plan gürültü oranına kadar en yüksek sinyali üreten boyuta ayarlayın.
Burada gösterildiği gibi karşılaştırılabilir kontrast üreten bir dizi boyut olması mümkündür. İyi hizalanmış bir mikroskopla, mikrotübüller arka plan çıkarma olmadan görülebilmelidir. Ancak arka planı çıkarmak mikrotübülün kontrastını artırır.
Kontrastı daha da artırmak için ortalama, 4a filtreleme veya her ikisinin bir kombinasyonu kullanılabilir. Burada gösterilen çizgi taramaları görüntü kalitesinin artımlı gelişimini açıklar. Bunlar, her işlem adımında arka plan gürültüsünün gözle görülür şekilde azaltılmasını açıklar.
Mikrotübül dinamiği zaman atlamalı filmlerden oluşturulan kinograflarda rapor edilebilir. Saniyede 0,2 kare kare hızında edinilen bir örnek kinograf burada gösterilmiştir. Kesik çizgiler tohumları işaretler.
Bu yordamı gerçekleştirirken, yüksek sayısal diyafram hedefleri ile çalışmak önemlidir. Diyafram çapı çerçevesinin boyutunu doğru hizalamak ve ayarlamak da önemlidir. Irm'i floresan görüntüleme ile birleştirmek kolaydır, örneğin mikrotübül bağlayıcı proteinleri ve mikrotübül dinamiklerini nasıl değiştirdiklerini incelemek için.
Bu teknik fotoğraf hasarını önemli ölçüde azaltır ve daha yüksek kare hızı elde edilmesine olanak sağlayarak, mikrotübüller gibi etiketli biyopolimerlerin yüksek zamansal çözünürlük ve iyi izleme hassasiyeti ile uzun süre çalışılmasını kolaylaştırır.
