Bu yöntem, kolorektal neoplastik lezyonlu hastayı non-invaziv bir yaklaşımla saptamaya izin verir. Özellikle, Bu test izin verir, şu anda kolorektal kanser tarama programında kullanılan testler ile birlikte, daha iyi kanser veya anormal lezyonların daha yüksek risk varlığını tahmin etmek için. Bu protokolü başlatmak için, her pozitif kontrol, standart DNA ve spike-in DNA'nın bir aliquot'unu, bir mini santrifüj üzerinde 10 saniye boyunca kuru bir biçimde santrifüj edin.
750 mikrolitre su ile pozitif kontrolü yeniden askıya alın. 100 mikrolitre su ile inhibitörlerin varlığını test etmek için eksojen bir iç kontrol olarak kullanılan ani DNA'yı yeniden askıya alın. Standart eğri için, 100 mikrolitre su ile kuru standardı yeniden askıya alın ve stok çözeltisinden başlayarak dört adet 1:5 seyreltme yapın.
Daha sonra reaktifleri 15 saniye boyunca dikkatlice girdaplayın ve 10 saniye mini bir santrifüjde santrifüj yapın. Tam bir süspansiyon için, kullanmadan önce 30 dakika oda sıcaklığında sıvı reaktifler saklayın. 1x spike-in DNA kontrolünü hazırlamak için, 5 mikrolitre FL-DNA çivisini 45 mikrolitre steril suyla karıştırın.
Numuneler için, her numunenin 75 mikrolitresini 50 mikrolitre 1x başak DNA ile karıştırın ve toplam hacmi 125 mikrolitreye getirin. İlk olarak, qPCR işletim yazılımını açın. Plakayı ayarlamak için, Birinci sütundaki sekiz pozisyonun tümü için Well Type'ı Standart olarak ayarlayın.
NTC olarak A2 ve B2 kuyuları için Well Type ayarlayın. Pozitif denetimler için Well Type'ı, C2 ve D2'yi Bilinmiyor olarak ayarlayın. Ve bilinmeyen olarak diğer tüm pozisyonlar için Well Type ayarlayın.
96 pozisyonun tümünü seçin. Boyaları, FAM ve HEX'i ekleyin ve Plakayı Eşitle'yi tıklatın. Sonra termal profil, sağlanan ayarlayın.
İnsan DNA'sını ve iç kontrolü hedefleyen özel astar ve problarla, tamamen lyophilized amplifikasyon karışımları içeren 8-iyi şeritler istenilen sayıda hazırlayın. Tüplerin altına içeriğini getirmek için, 10 saniye boyunca şeritler santrifüj. Mühürleri şeritlerden yavaşça çıkarın, pelet kaybetmemeye özen.
Daha sonra negatif kontrol kuyularına 25 mikrolitre su ekleyin. Kuyuları örneklemek için 25 mikrolitre örnek DNA ve pozitif kontrol kuyularına 25 mikrolitre pozitif kontrol DNA'sı. Standart eğri için, her bir kuyuya 25 mikrolitre standart 1, 2, 3 ve 4 ekleyin.
Tüm şeritleri ve girdapları birkaç saniye liğine dikkatlice kapatmak için 8 şeritli düz optik kapaklar kullanın. Şeritleri 10 saniye santrifüj edin, alete yükleyin ve koşmaya başlayın. Çalışma sonunda, FAM FL-DNA A ve HEX IC için, SEÇİlMİş sütunlar, A, C, E ve G.FAM FL-DNA B ve HEX IC için, standart başlayan miktarlar için sütunlar, B, D, F ve H.'yi seçin, A1 ve B1 kuyuları için reaksiyon başına 10 nanogram, C1 ve D1 için reaksiyon başına iki nanogram, E1 ve F1 için reaksiyon başına dört nanogram nokta , ve G1 ve H1 için reaksiyon başına sıfır sekiz nanogram. Daha sonra, hem FAM hem de HEX kanalları için Eşik Floresan değerlerini 150 olarak ayarlayın.
Kutu Sonuç Tablosu'nda, gerçek zamanlı qPCR enstrüman yazılımı tarafından sağlanan ilgili Cq ve delta R son değerleri ile her iki kanalda da sonuçları elde etmek için Sütun Seçenekleri'ni tıklatın, ardından Tümü Seç'i ve ardından Tamam'ı tıklatın. Delta R son floresan değeri son amplifikasyon döngüsüne normale karşılık gelir. Sonuç Tablosu kutusunda, bağlam menüsünü açmak için tabloya sağ tıklayın.
Ham verileri dışa aktarmak için Excel'e Gönder'i tıklatın. Ve sonra FL-DNA miktarı otomatik hesaplama için özel analiz yazılımı excel dosyası yükleyin. Her hasta için iFOBT ve FL-DNA değerleri tahmini kombinasyonu, kolorektal kanser riski.
Uygun pozitif bir numunenin floresan eğrileri, iç kontrol olan HEX kanalındaki örnek sinyalini kabul edilebilir aralıkta gösterir. Pozitif sinyal, hedef genlerin amplifikasyongösteren FAM kanalındaki eşiğin üzerindedir. Uygun bir negatif numunenin floresan eğrileri, hex kanalında kabul edilebilir aralıktaki örnek sinyalini gösterir.
Negatif kontrol sinyali FAM kanalındaki eşiğin altındadır. Diğer taraftan, uygun olmayan bir numunenin eğrileri, HEX kanalında kabul edilebilir aralıkta olmayan numune sinyalini gösterir. Büyük ihtimalle olası bir inhibisyona bağlı.
Bu nedenle, bu örnek çıkarma başlayarak, tekrarlanmalıdır. Yazılım analizi çıktı tablosu, reaksiyon kontrolleri, klinik numuneler ve işletme kalite kontrol sonuçları için FL-DNA konsantrasyonu açısından hem A hem de Mix B verilerini gösterir. Dört numaralı örnek, kalite denetimini geçemediği için herhangi bir sonuç alamamış.
Tekrarlanmalı ve yeniden analiz edilmelidir. Lütfen standart eğriye iniş li kontrol için DNA'yı yeniden askıya alırken dikkatli olun. Ve farklı NA'ları 8-iyi şeritlere dağıtırken, hem de sonuç analizi bölümünde moleküler algılama sırasında.
Kolorektal neoplastik lezyonların daha iyi değerlendirilmesi için bu yöntem iFOBT testi ile birlikte yapılmalı, aynı dışkı örneği ile yapılmalıdır.
