Bu metodolojinin genel amacı, bir araştırmacının karmaşık hücre popülasyonlarını sorgulamak için beş ek belirteç kaydetmesine izin vererek çoğu akış sitometresinin optik limitinin ötesine genişletmektir. Bu tekniği kullanarak, düşük sayıda dedektör veya sınırlı sayıda hücre ile örnek ile alet ile çalışırken derin bir immünofenotitipleme elde etmek mümkündür. 50 mililitrelik konik bir tüp içine dikkatle çekilen kan aktararak bu prosedürü başlayın.
Kalsiyum ve magnezyum olmadan PBS eşit miktarda kan seyreltin. Yeni bir 50 mililitrekonik tüp altına yoğunluk gradyan orta 15 mililitre ekleyin. Dikkatle yoğunluk gradyan orta ve seyreltilmiş kan arasında herhangi bir karıştırma kaçınarak, yoğunluk gradyan orta üstüne seyreltilmiş kan bindirme.
Arabirimin bozulmasını önlemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 kez g'de frensiz santrifüj. Santrifüjden sonra, plazma ve yoğunluk gradyan ortamı arasındaki arabirimdeki hücreleri kaldırmamaya dikkat edin, üst katmanı dikkatlice aspire etmek ve atmak için bir pipet kullanın. 50 mililitrelik konik tüpün altındaki kırmızı hücre peletine dokunmadan mümkün olduğunca çok periferik kan mononükleer hücre, ya da PBMCs, mümkün olduğunca toplamak ve yeni bir tüp transfer.
Son hacmi 25 mililitreye getirmek için PBS ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez tersine çevirin. Ardından, PBMC'leri metinde belirtilenin iki katı kadar yıkayın. Trombositleri çıkardıktan ve metinde açıklandığı gibi PBMCs sayarak sonra, PBS hücreleri resuspend, 0.1% sodyum azit mililitre başına yedinci hücrelere bir kez 10 konsantrasyonu.
PBMC'leri boyama için hazırlamak için, her numuneden 100 mikrolitreyi 96 kuyulu v-alt plakasına aktarın. Oda sıcaklığında 3dakika boyunca 350 kez g plaka santrifüj. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant'ı dikkatlice aspire edin.
Her kuyuya, proteinler üzerinde serbest amin le reaksiyona girer canlı / ölü fikse boya içeren PBS 100 mikrolitre ekleyin ve dikkatle PBMC karışımı resuspend. Daha sonra, ölü hücrelerin etiketleme için plaka oda sıcaklığında 10 dakika oturmasına izin verin. Her numune için, yedi antikor içeren bir karışımın 30 mikrolitresini hazırlayın.
Bu aşamada farklı hedef moleküllere ve farklı florokromlara karşı titre antikorlar da eklenebilir. 96 kuyulu plakayı oda sıcaklığında üç dakika boyunca 350 kez g'de santrifüj edin ve hücre peletini bozmadan süpernatantı dikkatlice aspire edin. Her iyi antikor kokteyl ekleyin ve kabarcıklar üretmeden dikkatlice resuspend.
Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yat. 30 dakika sonra, her kuyuya 150 mikrolitre boyama tamponu ekleyin ve tabağı oda sıcaklığında üç dakika boyunca 350 kez g'de santrifüj edin. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant'ı dikkatlice aspire edin ve 200 mikrolitre PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın.
Hücreler şimdi akış sitometri analizi için hazır. Anti-CD3, CD8, CD14, CD19 ve TCR gama delta antikorları maksimum boyama indeks eğrisi ile titre edilir. Antikor titrasyonu, iki florokrom kullanarak yedi bağışıklık hücresi alt kümesini doğru bir şekilde tanımlamak için bu protokoldeki en kritik adımdır.
İki kat antikor seyreltme hazırlamak için, kuyu başına 40 mikrolitre boyama tamponu ile 96 kuyulu bir plakanın 10 kuyusu doldurun. Bu videonun amaçları için, sadece anti-CD8 titrasyonu gösterilir. İlk kuyuda, son hacmi 80 mikrolitre boyama tamponuna yükseltin ve üretici nin önerdiği konsantrasyonun dört katı konsantrasyonda anti-CD8 ekleyin.
İyi bir şekilde karıştırın ve 40 mikrolitreyi ikinci kuyuya aktarın. İyi bir şekilde karıştırın ve diğer tüm kuyular için bu adımı tekrarlayın. Daha önce gösterilen protokolü izleyerek anti-CD8 10 farklı iki kat seyreltme 30 mikrolitre ile PBMCs veya tam kan 10 örnekleri leke.
Akış sitometresi ile veri edinin ve her seyreltmeden gelen sinyali çizin. Metinde ayrıntılı olarak her antikor konsantrasyonu için leke indeksi hesaplandıktan sonra, antikor seyreltme bir kısmını olarak ifade antikor konsantrasyonu karşı leke indeksi arsa ve maksimum leke indeksi değeri ile antikor konsantrasyonu belirlemek. Anti-CD4 ve anti-CD56 antikorları titrat için, daha önce gösterilen iki kat seyreltme stratejisi ile başlamak, ince cd4-pozitif T hücreleri ve NK hücrelerinin diğer hücre popülasyonlarından ayrılmasını sağlayacak konsantrasyon aralığını belirlemek için arasında ek konsantrasyonlar ekleyerek.
Anti-CD4 antikorlarını çift CD8-pozitif, CD3-pozitif sinyal ve CD3 tek pozitif popülasyon arasına anti-CD4 sinyalini yerleştirerek titrat. Anti-CD56 antikor anti-CD4 antikor titrasyonu benzer bir strateji aşağıdaki titrat, CD3-negatif ve CD3-pozitif popülasyonlar arasında NK hücreleri yerleştirerek. Bu iki florokrom, yedi marker gating stratejisi başlatmak için, lenfosit kapısını seçin ve her eksenüzerinde bu protokolde kullanılan iki florokrom biri ile nokta arsa oluşturmak.
Nokta çiziminin sağ üst köşesinde CD3 ve CD8 çift pozitif hücreler olarak tanımlanan CD8-pozitif T hücrelerinin kapısı. NKT hücreleri içerebilecek loş CD8 popülasyonunu hariç tonuyla. CD8-pozitif T hücreleri ile CD3 tek pozitif popülasyonları arasındaki popülasyon olarak tanımlanan CD4-pozitif T hücrelerinin kapısı.
Yüksek CD3 hücreleri olarak tanımlanan gama delta T hücrelerinin kapısı. Gama delta T hücrelerini CD8 pozitif ve CD8 negatif olarak böl. CD3-pozitif ve CD3-negatif hücreler arasındaki popülasyon olarak tanımlanan NK hücrelerinin kapısı.
NK hücrelerini CD8 pozitif ve CD8 negatif olarak böl. Nokta çiziminin sağ alt köşesinde CD3-negatif, CD19-pozitif popülasyon olarak tanımlanan B hücrelerinin kapısı. Monosit kapısını seçin ve her eksende bu protokolde kullanılan iki florochrome'dan biriyle nokta çizimi oluşturun.
CD3-negatif, CD14-pozitif popülasyonda kapı. Bu strateji kullanılarak multipl miyelomu olan bir hastanın lenfositleri ileri dağılımları ve yan dağılımları ve akış sitometrik profilleri temelinde geçitlendi. CD8-pozitif bellek alt popülasyonları ve naif T hücreleri CD45RA ve CCR7 ekspresyonu ile tanımlanmıştır.
CD8-pozitif naif, bellek, merkezi bellek, efektör bellek ve efektör bellek CD45RA-pozitif hücrelerde T hücre aktivasyonu çalışmak için HLA-DR ve CD57 ekspresyonu kullanıldı. Benzer şekilde CD4-pozitif naif ve bellek T hücreleri tespit edildi. Bellek popülasyonu içinde, CD4-pozitif T hücrelerinde T yardımcı alt popülasyonlarını tanımlamak için CCR4 ve CCR6 kullanılmıştır.
NK hücrelerinin alt popülasyonları CD16 ve CD57 ekspresyonu ile karakterize edildi. Bu strateji, kök hücre nakli alan multipl miyelomlu bir donörden alınan uzunlamasına örneklerin bağışıklık popülasyonlarında dinamikleri araştırmak için kullanılmıştır. Zaman içinde CD8 ve CD4 alt popülasyonlarının karakterizasyonu sürekli cd4-pozitif ve CD8-pozitif T hücre aktivasyonu ve T-helper-one fenotip T yardımcı bir eğrilme gösterdi.
Ama 60. Uygun hücre hazırlama ve antikor titrasyonu bu tekniği kullanarak güvenilir sonuçlar elde etmek için kritik adımlardır. Diğer belirteçleri hedefleyen antikor, daha derin akış sitometri analizini gerçekleştirmek ve aynı anda birden fazla soyu hedefleyen modüler akış sitometrik panelleri oluşturmak için eklenebilir.
Kaydedilebilir işaretleyicilerin sayısını artırmayı amaçlayan benzer yaklaşımlar, farklı işaretleyici kümeleri kullanılarak veya farklı hayvan modellerinde kullanılmak üzere geliştirilebilir. Sodyum azitin cilt ve gözlerde yanıklara neden olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, bir laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve eldiven her zaman bu reaktif ele giyilmelidir.
