Bu yöntem, konak amino yanıtında yer alan kodlama, kodlamama ve viral RNA ekspresyonunun incelenmesine ve bir patojenin konakçının biyolojik fonksiyonlarını nasıl etkileyebileceğine izin vererek konak-patojen etkileşimlerinin incelenmesinde anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, globin azaltılmış RNAseq kütüphanelerinden mRNA ve kodlamayan RNA'nın tek bir tam kan örneğinden işlenmesi için optimize edilmiş bir protokol sunmasıdır. Tekniği gösteren Sarah Anderson, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.
Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 50 20 kez G'de kan tüplerini santrifüj ederek başlayın. Biyolojik bir güvenlik kabininde çalışan, supernatant çıkardıktan sonra, pelet için RNase içermeyen su sekiz mililitre ekleyin. Tüpleri kapatın ve pelet görünür cereyana kadar girdap, sonra 50 20 kez G'deki tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin ve peleti geri verin.
Biyolojik bir güvenlik kabininde çalışarak, süpernatant'ı atın ve peleti kurtarın. Toplam RNA'yı izole etmek için, 300 mikrolitre likis bağlama tamponunun pelete boruile titreştirilerek başlayın. Girdap sonra, yeni etiketli 1.5 mililitre santrifüj tüp için her tüp karışımı aktarın.
miRNA izolasyon kitinden 30 mikrolitre homojen katkı maddesi ekleyin. Tüpleri girdap ve 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Bir duman kaputunda çalışan, buz tüpleri kaldırmak ve tekrar karıştırmak için kiti ve girdap asit fenol kloroform reaktif 300 mikrolitre ekleyin.
Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 10,000 kez G santrifüj ettikten sonra, sulu fazı yeni bir tüpe dikkatlice çıkarın. Önceki adımdaki sulu geri kazanım miktarına bağlı olarak, karıştırmak için her tüp ve pipet sulu faj için% 100 etanol hacmi 1,25 kat ekleyin. Her numune için filtre kartuşunu içeren yeni toplama tüpleri hazırlayın.
Pipet yaklaşık 675 mikrolitre lysate-etanol karışımı filtre kartuşuna. Filtreden sıvı geçirmek için 10.000 kez G'de kısaca santrifüj edin. Akışı atın.
Tamamen kullanılana kadar filtre ve santrifüj ekleyerek lysate-etanol karışımı tekrarlayın. 700 mikrolitre yıkama çözeltisi ekleyin bir kitten filtre kartuşu için. Çözeltiyi filtrelerden geçirmek için kısa bir süre santrifüj edin.
Akış tan atın ve aynı filtre kartuşları ve toplama tüplerini saklayın. Her filtre kartuşu için 500 mikrolitre yıkama çözeltisi iki-üç ekleyin. Tekrar santrifüj den sonra, akış tan atın ve yıkama adımını tekrarlayın.
Filtre kartuşlarından kalan sıvıyı çıkarmak için 60 saniye daha döndürün. Kartuşları yeni toplama tüplerine aktarın. Her filtre kartuşunun ortasına 100 mikrolitre 95 derece santigrat önceden ısıtılmış nükleaziçermeyen su ekleyin.
Kartuşları masa üstü santrifüjünde maksimum hızda yaklaşık 20-30 saniye santrifüj edin. Globin azaltma oligoları ile melezleşmeyi sağlamak için, ilk olarak alınan her numuneyi 0,2 mililitre ince duvarlı çekirdeksiz reaksiyon tüpüne ekleyerek RNA'yı denatüre edin. Tüpleri 70 derecede bir termal döngüye iki dakika yerleştirin.
Bundan sonra, optimum RNA kalitesini elde etmek için tüpleri hemen buza yerleştirin. Tüpler soğurken, 400 mikrolitre 10X globin azaltma oligo karışımı ve 10X oligo hibridizasyon tamponiki mililitretüp hazırlayın. Hibridizasyon karışımı yapmak için, RNA örnek altı mikrogram ekleyin, 10X globin azaltma oligo karışımı iki mikrolitre, 10X oligo hibridizasyon tampon bir mikrolitre, ve her 10 mikrolitre son hacmine çekirdeksiz su 0.2 mililitre ince duvarlı, çekirdeksiz reaksiyon tüpü.
Tüpleri termal döngüye 70 derecede iki dakika yerleştirin. Bundan sonra, hemen buz tüpleri yerleştirin. RNase H sindirimini gerçekleştirmek için, ilk olarak 10X RNase H'yi bir X RNase H tamponuyla bir X RNase H'ye seyreltin.
10X RNase tamponunun iki mikrolitresini, bir mikrolitre RNase inhibitörünün ve bir X RNase H'nin iki mikrolitresini ve toplam 10 mikrolitre lik çekirdeksiz suyun beş mikrolitresini birleştirerek RNase H reaksiyon karışımını hazırlayın. Globin azaltma hibridizasyon örneklerine 10 mikrolitre RNase H reaksiyon karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. Bu reaksiyonu 37 derecede 10 dakika sindirin ve sonra 4 santigrat dereceye kadar soğutun.
Tüpe bir mikrolitre 0,5 molar EDTA ekleyerek sindirimi durdurun ve tüpün tüm içeriğini 1,5 mililitrelik taze bir tüpe aktarın. Bundan hemen sonra, 80 mikrolitre RNase içermeyen su, 350 mikrolitre lysis tampon, sonra her tüpe %100 etanol 250 mikrolitre ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Her 700 mikrolitrelik numuneyi, akış tanzimi için iki mililitrelik toplama tüpüne yerleştirilen ayrı bir elüsyon filtresi kartuşuna aktarın.
8, 000 kez G veya daha fazla 15 saniye santrifüj ve sonra akış atmak. Aynı elution filtresi kartuşlarını yeni iki mililitrelik toplama tüplerine yerleştirin. Filtre kartuş membranlarını yıkamak için, filtre kartuşlarına 500 mikrolitre hafif yıkama tamponu ekleyin ve 8, 000 kez G veya daha fazla 15 saniye santrifüj yapın.
Akışı atın. Daha sonra, aynı toplama tüplerini kullanarak, filtre kartuşlarına %80 etanol 500 mikrolitre ekleyin. 8, 000 kez G ve daha büyük iki dakika santrifüj.
Hem akış ve toplama tüplerini atın ve elüsasyon spin sütunlarını kaydedin. Her elution spin sütunu yeni bir iki mililitretoplama tüpü neyer. Spin kolon membranlarını kurutmak ve etanol taşımasını önlemek için filtre kartuşlarının açık kapağı yla beş dakika boyunca tam hızda santrifüj yapın.
Toplama tüplerini attıktan sonra, kurutulmuş filtre kartuşuher bir 1,5 mililitrelik toplama tüpü içine yerleştirin. Doğrudan filtre kartuş membranının ortasına 14 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyin. RNA'yı elemek için tüpleri tam hızda 60 saniye santrifüj edin ve daha fazla RNA değerlendirmesi ve hazırlığıyla devam edin.
Globin tükenmiş örnek şimdi bölünmüş ve küçük hazırlamak için kullanılabilir, kodlamayan RNA kütüphaneleri yanı sıra ribo-tükenmiş mRNA ve uzun, kodlamaolmayan RNA kütüphaneleri. Bu protokolü kullanarak globin tükenmiş ve ribo-tükenmiş tam kan örneklerinin ekspresyon kütüphaneleri hazırlandıktan sonra, elektroforez dosya çalışma özeti 6.3 ile 9.2 arasında değişen RNA bütünlüğü numaraları ile globin tükenmiş kütüphane örneği gösterdi. Bu globin tükenme yöntemleri kullanılan ve sadece altı veya yakın RIN numaraları elde edebildi diğer çalışmalara göre bir gelişme olduğunu kanıtladı.
Tek bir domuz tam kan örneğinin globin öncesi ve globin sonrası indirgeme oranı nın 260-280 nanometre konsantrasyon oranlarının iki veya üzerinde olduğunu göstermiştir. Bu protokol kullanılarak havuzlama ve sıralama öncesinde globin ve riboz-tükenmiş tam kan mRNA kütüphane örneklerinin çip bazlı elektropherogramları elde edildi. mRNA kütüphaneleri için temsili elektrofegram yaklaşık 280 baz çifti ile zirveye sahiptir.
Küçük ncRNA'lar için temsili çip bazlı elektropogramlar yaklaşık 100 ila 400 baz çifti arasında bir dizi tepe içerir. Yaklaşık 143 baz çifti ndeki zirveler miRNA'lara karşılık gelir ve yaklaşık 153 baz çifti ndeki zirveler piRNA'lara karşılık gelir. Bu prosedürü çalışırken, hemen nerede belirtildiği buz tüpleri hatırlamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, diferansiyel ifade, epigenetik değişiklikler ve bunların biyolojik yollar ve süreçler üzerindeki etkileri gibi ek soruları cevaplamak için yeni nesil sıralama gibi başka yöntemler de uygulanmalıdır. Fenol-kloroform reaktifile çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu ve duman kaputunda çalışma gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Ayrıca, tam kan veya enfeksiyöz organizmalar ele alırken, çalışma bulaşıcı organizmanın aktivasyonu önce biyolojik bir güvenlik kabininde yapılmalıdır.
