Geçmişte kobay modelinde immünoterapötiklerin karakterizasyonu humoral bağışıklığın ölçülmesi ile sınırlıydı. ELISpot tsay bu sınırlamanın üstesinden gelir ve araştırmacıların bu hayvan modelinde daha anlamlı veriler oluşturmalarına yardımcı olur. Bu tekniğin en büyük avantajı hücrelerin periferik kandan elde olmasıdır.
Nekropsi gerekmez. Bu doğal bir enfeksiyon sırasında veya bir aşı rejimi boyunca bireysel kobaylarda T-hücre yanıtlarının sadece büyüklüğü değil, aynı zamanda kinetik ölçümü için izin verir. Prosedürü gösteren Holly Pugh olacak.
Inovio'nun Klinik Öncesi R ve D Departmanı'ndan araştırma görevlisi. EliSpot bir sayak plakasının her kuyuya 15 mikrolitre %35 etanol ekleyin. 60 saniye sonra her kuyuya 150 mikrolitre PBS ekleyin.
Ve etanol ön işlemedurdurmak için plaka ters. Kontaminasyonu veya membrana zarar vermesini önlemek için ELISpot tsay plakalarını kullanırken de büyük özen uygulanmalıdır. Plakayı yıkamak için her kuyuya 250 mikrolitre PBS ekleyin.
Yıkama iki kez tekrarladıktan sonra, her kuyuya 100 mikrolitre yakalama anti-kobay interferon gama antikor VE4 ekleyin. Sonra 4 santigrat derecede en az 12 saat boyunca plaka kuluçka. Kuluçka döneminden sonra tabakları üç kez yıkayın.
Her kuyuya 200 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın. Sonra tabakları üç kez daha yıkayın.
Oda sıcaklığında degrade orta 4,5 ml ile konik tüpler hazırlayın. Sonra kan ile Hanks'Balanced Tuz Çözeltisi eşit hacimli karıştırın. Katman yoğunluk gradyan orta üzerinde yavaş yavaş seyreltilmiş kan, arayüzü rahatsız etmemeye dikkat.
Bundan sonra tüpleri 800 x g'de oda sıcaklığında fren yapmadan 30 dakika santrifüj edin. Tüpü santrifüjden çıkarın, katmanları rahatsız etmemeye özen gösteriyor. Tabakaları doğru bir şekilde tanımladıktan sonra, PBMC'leri hasat etmek için tam buffy kat tabakasını aspire edin.
HbSS seyreltilmiş kanı yoğunluk gradyan ortamına yavaşça katlayın. Tüpün herhangi bir bozulmasını önleyin ve santrifüj frenlerini kapatın. Hücreleri yeni bir 15 ml tüpe aktarın.
Daha sonra R10 orta hücreleri seyreltmek 15 ml toplam hacmi. Hücreleri peletleme sonra, supernatant atın ve R10 orta 15 ml hücreleri resuspend. Hücre süspansiyonundan 70 mikrometrelik bir süzgeçten yeni bir tüpe geçirin.
Hücreleri sayın ve Trypan mavi dışlama testi ile canlı hücrelerin sayısını belirleyin. Sonra R10 orta ile hücreleri seyreltin. Önce engelleme tamponu çıkarın ve plakaları yıkayın.
Her PBMC örneği için pozitif kontrol, negatif kontrol ve her denemeye özgü uyarıcının triplicates gösterir. R10'daki protein peptid havuzunu istenilen son konsantrasyonun üç katına kadar seyreltin. Bundan sonra plaka uyarıcı test kuyuları peptid R10 orta karışımı 50 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra plakanın negatif kontrol kuyularına R10 ortamında 50 mikrolitre MT peptid formülasyonu ekleyin. Plakanın pozitif kontrol kuyularına R10 ortamına ConA ekleyin, ardından tüm kuyulara 100 mikrolitre PBMC süspansiyon ekleyin. ELISpot plakayı kuluçka makinesinde eşit bir yüzeye yerleştirin ve kuluçka süresi boyunca plakayı rahatsız etmekten kaçının.
Plakayı kuvözden dikkatlice çıkardıktan sonra, süpernatantı çıkarmak için plakayı ters çevirin. Sonra tabağı üç kez yıkayın. Her kuyuya seyreltilmiş biyotinylated algılama anti-kobay interferon gama antikor N-G3 yakalamak 100 mikrolitre ekleyin.
Sonra iki saat oda sıcaklığında plaka kuluçka. Antikor çözeltisini çıkarmak için plakayı ters çevirin ve yıkamayı üç kez tekrarlayın. Plakadan PBS çıkardıktan sonra, her bir kuyuya tampon engelleme seyreltilmiş ALP konjuge streptavidin 100 mikrolitre ekleyin.
Sonra bir saat oda sıcaklığında plaka kuluçka. ALP streptavidin çözeltisini atmak ve plakayı iki kez yıkamak için plakayı ters çevirin. Plakaters ve herhangi bir fazla PBS kaldırmak için temiz bir kağıt havlu karşı leke.
Bundan sonra plakayı her kuyuda 250 mikrolitre Ultrapure DI su ile yıkayın. Plaka ters ve temiz bir kağıt havlu ile fazla su çıkarın. Sonraki her kuyuya 100 mikrolitre BCIP/NBT substrat çözeltisi ekleyin.
Plakayı ışıktan korunan 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Plakayı dört kez DI suyuyla durulayın. Sonra ters çevirin ve fazla su kaldırmak için plaka dokunun.
Son olarak, plakanın altındaki plastik drenajı çıkarın ve membranTamamen kurumasını bekleyin. Daha önce gösterildiği gibi başarılı yoğunluk gradyan santrifüj sonra, tüpün altındaki kırmızı viskoz sıvı kırmızı kan hücrelerinin çoğunu içermelidir. Buffy kat tabakası plazma tabakası ve yoğunluk gradyan orta arasındadır.
Yakalama antikoreklemeden önce kuyular pretreating, titreşme negatif kontrol kuyularında spesifik olmayan noktalar sayısında bir azalma ile birlikte geliştirilmiş tanımı görüntülenir. Lekeler PBMC popülasyonu içinde interferon gama üreten T-hücreleri göstergesidir. Bu tekniği çalışırken, dikkatli ama hızlı bir şekilde kan işlemek için hatırlamak önemlidir.
Bu, hücre canlılığını artırmak nokta oluşumunu artırmak ve nonspesifik lekelerin oluşumunu azaltacaktır. Kan ve BCIP/NBT substratı ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken uygun PPE takma gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu protokolün araştırmacıların Tüberküloz, Ebola ve HSV gibi önemli bir T-hücre bileşeni olan hastalıkları incelemelerine olanak sağladığına inanıyorum.
Daha da önemlisi, kobay modelinde aşı protokollerinin geliştirilmesini geliştirecek ve daha az alakalı hayvan modellerinin kullanımını azaltacaktır.
