Bu yöntem, HIV provirüs entegrasyonunun androjen gen ekspresyonunu nasıl etkilediği ve son zamanlarda HIV ile enfekte olmuş hücrelerde bazı genomik entegrasyon alanlarının neden seçildiği sorusunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, CRISPR/Cas9 tabanlı genom mühendisliği kullanılarak seçilmiş entegrasyon bölgelerine yönelik pro-viral muhabirleri taşıyan HIV enfeksiyonu için in-vitro modellerin üretilebiliyor olmasıdır. Prosedürü gösteren Thomas Walther, bir doktora öğrencisi ve Julia Bialek, benim laboratuvar bir postdoc olacaktır.
UcSC Genom Tarayıcısı kullanarak hedef alınması istenen genomik lokus genomik dizisini in-silico-ayıklamak için başlayın. Seçilen genomik lokus hedeflemeiçin 20 nükleotit kılavuzu RNA'larını seçmek için E-CRISP web aracını kullanın. Sonra seçin, Homo Sapiens Genom Referans Konsorsiyumu İnsan Genomu:Build 38.
Organizma olarak referans genom ve daha önce çıkarılan istenilen genomik lokusu kapsayan genomik dizinin 2,000 baz çiftini girin. Herhangi bir PAM, herhangi bir beş asal taban, off-targets uyumsuzlukları tolere ve dışlanmış introns ve CPG adaları ile orta uygulama ayarlarını kullanarak bir rehber-RNA arama başlatın. Görünen olası kılavuz-RNA tasarımları ile listeden, hedeflenen istenilen genomik lokus mümkün olduğunca yakın özgüllük ve verimlilik için yüksek puan ile bir rehber RNA seçin.
Seçilen kılavuz-RNA dizisini referans genomuna karşı patlatmak için NCBI Blast tarayıcısını açın. Seçili kılavuz-RNA bağlama alanının benzersizliğini kontrol etmek için, önce genom olarak insan seçin ve ardından kılavuz-RNA dizisini sorgu sırası olarak girin. Ardından, kılavuz-RNA dizisinin benzersiz olduğundan emin olmak için program olarak son derece benzer dizileri veya Mega Blast'ı seçin.
Bundan sonra, başlangıçta çıkarılan genomik diziden in-silico 1, 000 baz çiftlerini, kılavuz-RNA dizisini yukarı ve aşağı doğru seçin. Bu seçilen 1.000 baz çifti, yukarı ve aşağı akım vektör yapımı ve bitişik muhabir dizisi hedef için hedef için beş asal ve üç-prime homoloji silah olarak kullanın hedeflenecek. Jurkat T-hücrelerinin transfeksiyonundan 24 saat önce, tek bir hedefleme deneyi için hücrelerin tam 6 kuyulu bir plakasını hazırlayın.
Başlamak için, plaka 1, 250, 000 hücreleri RPMI 2.5 mililitre 1640 takviyeleri ile ve antibiyotik olmadan, başına. Ertesi gün, dairesel hedefleme vektörü ve iki mikrogram Cas9 ve kılavuz-RNA ekspresyonu plazmidini, transfeksiyon için optimize edilmiş 250 mikrolitre ticari RPMI ortamına, bir reaksiyon tüpünde ekleyin ve girdap ile iyice karıştırın. Daha sonra tüp duvarına dokunmadan DNA ortamına yavaş yavaş 12 mikrolitre transfeksiyon maddesi ekleyin.
Tüp ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka flick. Karışımı bir hücre kuyusuna damlayla ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.
Transfeksiyondan 72 saat sonra transfected hücreleri çekin, sayılayın ve FACS ile zenginleştirmeye hazırlanın. Karışık hedefli hücre popülasyonundaki hedefleme olaylarını doğruladıktan sonra, sağlıklı, tedavi edilmemiş jurkat T-hücrelerinden alınan antibiyotiklerle RPMI'yi toplayarak, jurkat koşullu ortamı önceden hazırlayarak tek hücreli klonlar üretmeye başlayın. Tüpleri 300 G'de 5 dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı yeni, 50 mililitrelik konik tüplere 0,22 mikrometre filtre kullanarak 25 mililitrelik şırıngayla filtreleyin.
Daha önce FACS tarafından zenginleştirilmiş hedeflenen hücreleri sayın, genişlemeden 10 ila 14 gün sonra, ve sonra rpmi antibiyotik ile seyreltmek 100, mililitre başına 000 hücre. Seyreltmek 100 mikrolitre bu hücre seyreltme ile 9.9 mililitre orta mililitre ulaşmak için 1,000 mililitre başına. Sonra mililitre başına 100 hücre konsantrasyonu için orta dokuz mililitre ile bu seyreltme bir mililitre seyreltin.
Plaka 96 iyi plakalar iyi başına bir hücre içeren, hafifçe bir mililitre 100 hücre başına mililitre çözelti silikat beş mililitre orta ve dört mililitre taze orta ile karıştırın, steril bir reaktif rezervuar. Daha sonra, iyi seyreltme başına bir ve iki hücre elde etmek için yeni 96-iyi yuvarlak alt plakalar kuyu başına ilgili hücre seyreltme 100 mikrolitre eklemek için çok kanallı pipet kullanın. 96 kuyu plakasını istifleyin ve her desteyi her kuyubaşına üç mililitre PBS içeren altı kuyulu bir plakayla kaplayın.
Plakaları 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 karbondioksitle üç hafta kuluçkaya yatırın. Kuluçka tamamlandıktan sonra, dört kat büyütme ile ışık mikroskobu kullanarak yetiştirilen kolonilerin varlığını görsel olarak doğrulayın ve yetiştirilen koloniler ile kuyuları işaretleyin. Borulama ile iyi işaretlenmiş bir hücreyi yavaşça yeniden askıya alın.
Bu hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini, 100 mikrolitre RPMI'nin 100 mikrolitresini antibiyotiklerle birlikte yeni hazırlanmış 96 kuyulu yuvarlak alt plakaya aktarın, her iyi ve işaretli tüm kuyular için tekrarlayın, pipetleme ile hafifçe karıştırın. Plakayı çoğaltmak için, bu hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini ikinci bir boş, 96 kuyulu yuvarlak alt plakaya aktarın ve bu işlemi işaretli tüm kuyular için tekrarlayın. Son olarak, antibiyotikler ile RPMI 200 mikrolitre ile boş kuyuları doldurun.
Plakaları 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Yinelenen plaka 24 ila 48 saat boyunca kuluçkaya yattıktan sonra her kuyuya 100 mikrolitre RPMI antibiyotik ekleyerek tekrar kopyalanır. Yavaşça karıştırmak ve yeni bir 96-kuyu yuvarlak alt plaka her kuyuya 100 mikrolitre aktarmak için çok kanallı pipet kullanın.
Bu iki plakadan birini kuvöze yerleştirin. Hücreleri uyarmak için, ilk pma / Ionomycin Master Mix beş mikrolitre ekleyerek, akış sitometri için yeni yinelenen plakalar ikinci kullanın. 24 saat kuluçka ya da metinde açıklandığı gibi akış sitometrisi için hücreleri hazırlayın.
İleri ve yan dağılımboyutuna göre herhangi bir canlı tek hücre kapısı. Floresan muhabir gen ekspresyonunu akış sitometrisi ile analiz edin. PCR tarafından tek hücreli klonları taramak için, seçilen muhabir sırasına göre PCR tarama için p5 ve P6 tasarım astarları, muhabir dizisinin 500 ila 800 baz çiftleri yükseltmek için.
Pozitif kontrol PCR için, p7 ve P8 tasarım astarları bir vahşi tip, hedefsiz genomik lokus 630 baz çiftleri güçlendirir. Hedefleme vektör omurga dizilerinin spesifik olmayan entegrasyonu için bir kontrol olarak hedefleme vektör omurgasının 500 ila 600 baz çiftini güçlendiren üçüncü bir astar çifti tasarla. İkinci yinelenen plakadaki klonlar yeterince büyüdükten sonra, oda sıcaklığında 300-G'de plakayı 10 dakika santrifüj ederek PCR taraması için hazırlayın.
Dikkatlice supernatant çıkarmak, hücre pelet rahatsız değil emin olun. Hücreleri 100 mikrolitre PBS ile hafif pipetleme ile yıkayın ve tabağı oda sıcaklığında 300 G'da beş dakika santrifüj edin. PBS çıkarın ve kuyu başına lysis tampon 200 mikrolitre ekleyin.
Pipet yavaşça karıştırın ve süspansiyonu yeni bir PCR plakasına aktarın. Plakayı parafin filmle kapatın ve bir termocycler içinde 55 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Hücre enkazını maksimum hızda 10 dakika santrifüj ettikten sonra, supernatant'ı yeni bir PCR plakasına aktarın.
Her kuyuda 110 mikrolitre distile H2O ile dolu 96 kuyulu PCR plakanın her kuyuya bu hücreli lysate'den 10 mikrolitre ekleyin. Daha sonra bir termocycler 99 derece santigrat 10 dakika kuluçka, proteinaz K.Use 2 mikrolitre bu hücre lizat bir şablon olarak inaktive ve tarama, kontrol ve omurga PCR için ticari bir PCR ana karışımı kullanın. PCR'yi 96-iyi formatta 38 ila 40 devir PCR amplifikasyonu için çalıştırın.
PCR ürünleri beş mikrolitre kullanın ve analiz etmek ve akış sitometri ve PCR sonuçlarını birleştirmek için% 1.5 agarose TAE jel üzerinde çalıştırın, tek hücreli klonlar onaylamak için. PMA/İonomisin indüksiyonu sonrası muhabir gen ekspresyonu, entegrasyon bölgesine bağlı olarak hücrelerin %4-12'sinde hem akış sitometrisi hem de PCR ile doğrulandı. Beş-prime ve üç-prime entegrasyon kavşak için astar kullanarak genomik DNA PCR analizi, hedefleme olayları meydana geldiğini doğrular.
Akış sitometrisi ile doğru hedefleme için tek hücreli klonların taranması ndan sonra, yüksek, düşük ve floresan muhabir gen ekspresyonu olmayan klonlar gözlendi. Tek hücreli klonlar da PCR tarafından muhabire özgü astarlar ve kontrol astarları kullanılarak doğrulandı. Klonlar tarama PCR pozitif doğruladı harcanan ve daha güney leke tarafından doğru hedefleme için analiz, bir muhabir özel prob ve muhabir dışında bir genomik sonda bağlayıcı kullanarak.
Sadece bir kısmı Güney leke analizinde doğru bant boyutları gösterdi ve heterozigously muhabiri entegre vardı, Güney leke tarafından PCR sonuçlarını doğrulamak için önemli olduğunu gösteren. Klonlar da daha pozitif tek hücreli klonlar onaylamak için sıralama ile analiz edildi. Hedef alanın dizilimi: homolog alel, muhabirentegre değildi, Cas9 kaynaklı mutasyonlar ortaya.
Bir kez hakim, HIV muhabir hatları nesil iki ila üç ay içinde gerçekleştirilebilir. Hedeflemeden önce, uğraşmak istediğiniz araştırma sorusuna bağlı olarak, bir entegrasyon sitesi ve uygun bir muhabir seçmek için yeterli zaman harcamak önemlidir. Muhabirler örneğin, istenirse farklı HIV düzenleyici unsurlar içerebilir.
Bu yordamı takiben, hücre hatları, örneğin, entegrasyon sitesine bağlı olarak, muhabir LTR transkripsiyonel etkinliği üzerinde farklı gecikme yükselen ajanların etkisini test etmek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kılavuz RNA'lar ve hedefleme vektörü tasarlamak, jurkat hücrelerinde CRISPR/Cas9 tabanlı genom mühendisliği yapmak, tek hücreli klonlar üretmek ve FACS ve PCR taraması ile doğru hedeflenmiş klonlar için seçim yapmak için entegrasyon sitesine özgü HIV muhabiri hatlarının nasıl oluşturacağınızı iyi anlamanız gerekir. Unutmayın, eğer bir çoğaltma-yetkili HIV muhabiri ile çalışmayı seçerseniz, BSL3 güvenlik koşulları altında çalışmak gerekir.
