Bu yöntem fare Peyer's Patch yalı T ve B hücre alt kümelerinin fenotip hakkında anahtar soruları yanıtlayabilirsiniz. Özellikle foliküler T yardımcı ve germinal merkezi B hücre popülasyonları. Bu tekniğin en büyük avantajı, izole lenfositlerin kalitesini ve kimliğini tehlikeye sokan kollajenaz bazlı sindirim gibi çeşitli zahmetli hazırlık adımlarından vazgeçmesidir.
Supine pozisyonda bir fare yerleştirerek ve% 70 etanol ile karın sterilize ederek başlayın. Peritineal boşluğu açmak ve çekum ve ileocekal kavşak bulmak için pubis göğüs kafesi deri ve periton ile orta hat karın kesi olun. Çekum ince bağırsak ayırmak için kavşakta mümkün olduğunca distal kesim olun.
Pilor sfinkterine kadar tüm ince bağırsağı dikkatlice çıkarmak için mesenteri makasla kesin. Pylorus ve duodenum arasındaki kavşağı tamamen karın boşluğundan ince bağırsağı ayırmak ve izole ince bağırsağı % 10 fetal sığır serumu veya FBS ile takviye edilmiş soğuk RPMI içeren 6 kuyulu bir plakanın bir kuyuya yerleştirin. Daha sonra, tüm segmentleri soğuk ortamda batırılmış kadar yavaşça el ile dokuları ajite.
Tüm bağırsaklar hasat edildiğinde, bağırsak bir kenarının mezenterik yağ kavramak ve örnek yerleştirmek için forceps kullanın, mezenterik tarafı aşağı, bir kağıt havlu üzerinde. Doku dehidratasyon ve yapışkanlık önlemek için RPMI ile tüm bağırsak segmentini nemlendirin 10%FBS ve peyer yamaları bulmak, hangi bağırsak duvarının anti-mezenterik tarafında karnabahar benzeri bir şekil ile beyaz multilobulated agregalar olarak görünür. Peyer's yamalar hasat için, eğri eğri ile yavaşça distal ve proksimal sınırları her yama çıkarmak için bakan kavisli cerrahi makas kullanın, çevreleyen bağırsak dokusu dışlamak için özen, ve toplandığı gibi buz üzerinde buz soğuk RPMI% 10 FBS içeren bir 12-iyi plaka bireysel kuyular içine Peyer yamaları yerleştirin.
Tüm yamalar elde edildiğinde, çapı bireysel Peyer yamaları aspire etmek ve fare başına 150 milimetre konik tüpler içine Peyer's yamalar aktarmak için yeterince büyük böylece 1 milimetrelik mikro pipet ucu ucu kesmek için makas kullanın 37 santigrat ftrpmi% 10 FBS 25 mililitre içeren. Sonra 10 dakika boyunca 125-150 RPM sürekli ajitasyon ile 37 santigrat derece bir orbital shaker tüp yerleştirin. Ajitasyonsonunda, fare başına 140 mikrometre hücresüz üzerine Peyer's yamalar aktarın ve hafifçe bireysel 50 mililitrekonik tüpler içine örgü aracılığıyla Peyer yamaları bozmak için hayvan başına bir 10 mililitreşlik şırınga dalgıç lastik ucunu kullanın.
15-20 mililitre soğuk RPMI%10 FBS ile süzgeçleri durulayın ve hücreleri santrifüj ile toplayın. Supernatant dikkatlice attıktan sonra, sayım için RPMI% 10 FBS konsantrasyonu mililitre başına 7 hücreleri yaklaşık 1 kez 10 hücreleri yeniden askıya. Daha sonra 96-iyi yuvarlak alt plaka her kuyuya orta 200 mikrolitre başına 6 hücreleri 2-2,5 kez 10 aktarın ve santrifüj ile hücreleri pelet.
Hafif flicking ile supernatant attıktan sonra, santrifüj ayakta tampon 200 mikrolitre hücreleri yıkayın. Hücreleri 100 mikrolitre sabitlenebilir canlılık boyası ile etiketleyin, 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca proteinsiz tamponda seyreltildi, ışıktan korundu, ardından 2 yıkıve taze boyama tamponu. Supernatant attıktan sonra, 4 santigrat derece 15 dakika kuluçka için FC blok 20 mikrolitre pelet yeniden askıya, ilgi birincil yüzey antikor kokteyl 80 mikrolitre eklenmesi takip, buz üzerinde 30 dakika, ışıktan korunan.
Yüzey antikor kuluçka sonunda, santrifüj hücreleri boyama tampon aşırı hacimde iki kez yıkayın, ve ikincil yüzey boyama çözeltisi 100 mikrolitre pelet resuspend, streptavidin ile birlikte. Işıktan korunan buzda 15 dakika kaldıktan sonra, santrifüj hücreleri 2 kez taze boyama tamponuyla yıkayın ve 200 mikrolitre fiksasyon, permeblizasyon çalışma solüsyonu ile ışıktan korunan buz üzerinde en fazla 20 dakikalık kuluçka için geri alın. Kuluçka sonunda, hemen plaka santrifüj, bir santrifüj takip permeablization tampon 200 mikrolitre iyi başına oldu.
Daha sonra, FC blok 20 mikrolitre hücreleri yeniden askıya, gösterildiği gibi permeblization tampon seyreltilmiş, ilgi hücre içi antikor kokteyl80 mikrolitre eklenmesi takip, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca, ışıktan korunan. Hücreleri 100 mikrolitre permeablization tamponuyla yıkayın ve ardından 200 mikrolitre permeablizasyon tamponunda ikinci bir yıkama. Daha sonra, boyama tampon 200 mikrolitre pelet resuspend ve uygun karşılık gelen hücreleri transfer 5 mililitre akış sitometrik analiz tüpleri, tüp başına boyama tampon 400 mikrolitre son hacmi.
Peyer's yamalar eşit ince bağırsak boyunca dağıtılan değil, ancak daha yoğun doku distal ve proksimal uçlarına doğru lokalize. Bu protokol, bir Peyer's patch lenfosit popülasyonunun izolasyonuna yardımcı dır. CD4 CD19 Çift Pozitif hücreler toplam Peyer yama lenfosit popülasyonunun yaklaşık %1'ini oluşturur.
Bu cxcr5 ve GL7 yüksek düzeyde ifade, hangi, hariç değil, T-helper foliküler ve germinal merkezi B hücresinin gating yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir, sırasıyla. Diğer sekonder lenfoid organlar ile karşılaştırıldığında, Peyer's yamalar germinal merkezi B hücrelerinin önemli ölçüde daha yüksek bir oran sergilemek, bir dizi 2-10% sürekli devlet koşulları altında toplam B hücre nüfusunun bir dizi. Germinal merkezi B hücreleri gibi, foliküler T-yardımcı hücre fraksiyonu da bireysel aşısız farelerde değişir, bir dizi ile 10-20%toplam, CD4 Pozitif Peyer yama T-lenfosit popülasyon.
Kollajenaz bazlı enzimatik sindirim CXCR5 T-helper foliküler hücre ekspresyonunun büyük azalmaya yol açar, diğer yüzey moleküllerinin ekspresyonu etkilenmez bırakarak. Bu gelişmeden sonra, bu teknik mukozal ve humeral bağışıklık dahil Peyer yamaları içinde önemli hücresel faktörlerin belirlenmesi için yol açtı.
