Nöronları bölümlere ayırmak için kullanılan mikroakışkan cihazlar nörobilimde standart bir araç haline gelmiş, araştırmacıların somata, aksonların, dendritler ve sinapslar gibi nöronların hücre altı bölgelerini fiziksel ve kimyasal olarak manipüle etmesini sağlamaktadır. Bu bölümlere ayrılmış kültür cihazları nörolojik alanda çok sayıda soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir, örneğin, aksonların gelişim sırasında sinapsoluşturmak için nasıl uzanması, akson hasarı sonrasında sinapsların nasıl yeniden biçimlendirilip reform yaptığı ve patolojik koşulların Alzheimer gibi hastalıklarda trans-synaptically nasıl yayılabilir. Bu protokol, kültür birincil sıçan nöronları bölümlere ayırmak için preassembled plastik multicompartment yonga kullanımını açıklar.
Bu yongaları kullanmanın en büyük avantajı, nöronları bölümlere ayırmak için kullanımı kolay ve son derece tekrarlanabilir bir yöntem sağlamalarıdır. Bir diğer avantajı da bu çiplerin önceki silikon bazlı bölümlere ayrılmış cihazlara göre nöronların ve izole aksonların daha sağlıklı, uzun süreli büyümesini ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile eşit derecede uyumlu olmasıdır. İnsan kök hücreleri de dahil olmak üzere diğer model sistemleri de önceden monte kompartıman çip içinde kültürlü edebiliyoruz.
Başlamak için, bir Petri kabına steril, çok bölmeli bir çip yerleştirin. Çipin sol üst kuyusuna 100 mikrolitre ön kodlama çözeltisi ekleyin ve ana kanaldan bitişik kuyuya akmasını bekleyin. Daha sonra, çipin sol alt kuyuyu ön kodlama çözeltisinin 100 mikrolitresi ile doldurun.
Bu kez, çözeltinin mikro oluklardan akmasını sağlamak için beş dakika bekleyin. Şimdi, sağ üst kuyuya kodlama öncesi çözeltinin 100 mikrolitresini ekleyin ve ana kanaldan bitişik kuyuya akmasını bekleyin. 90 saniye sonra, sağ alt kuyuyu 100 mikrolitre ön kodlama çözeltisi ile doldurun ve çipi 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Pipet ucunu ana kanaldan uzağa dikkatlice açılayın ve her kuyudan çözeltiyi aspire edin. Sonra, hemen üst sol iyi PBS 150 mikrolitre ekleyin ve bir buçuk dakika bekleyin. Daha sonra, alt sol kuyuya 150 mikrolitre PBS ekleyin ve sıvının mikro oluklardan akmasını sağlamak için beş dakika bekleyin.
Daha sonra, bu sırada, sağ üst ve alt sağ kuyulara 150 mikrolitre PBS ekleyin. 10 dakika sonra, tekrar PBS aspire ve yıkama adımları ikinci kez tekrarlayın. İkinci yıkamadan sonra, kanal açılışından uzakta, pipet ucunu oltalayarak PBS'yi kuyulardan aspire edin.
Daha sonra, mil Poli-D-Lizin çözeltisi başına 0,5 karışımı 100 mikrolitre ekleyin, çipin sol üst kuyusuna. Bir buçuk dakika bekleyin ve sonra poli-D-Lizin çözeltisi 100 mikrolitre ile sol alt iyi doldurun. Bu işlemi çipin sağ yarısında tekrarlayın.
Petri kabını kapat. Sonra, bir saat için 37 santigrat derece bir kuvözde çip yerleştirin. Kuluçkadan sonra çipi daha önce açıklandığı gibi PBS ile iki kez durula.
Sonra, cihazdan PBS aspire. Hemen, çipin sol üst kuyusuna 100 mikrolitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Bir buçuk dakika sonra, sol alt kuyuya ortam ekleyin.
Ortamın mikro oluklardan akmasını sağlamak için beş dakika bekleyin ve ardından çipin sağ tarafındaki dolum işlemini tekrarlayın. Belirlenen protokollere göre ayrışmış sıçan hipokampal nöronların bir hücre süspansiyon hazırlayın. Çipin her kuyudaki ortamın büyük bir kısmını çıkarın, ancak kanalları dolu bırakın.
Daha sonra, hemen üst sağ kuyuya hücre süspansiyon beş mikrolitre ve alt sağ kuyuda hücre süspansiyon başka beş mikrolitre yükleyin. Hücreleri yüklerken, pipetin ucunu ana kanala doğru çevirin. Hücreleri yükledikten sonra, bir mikroskop aşamasına çip aktarın ve nöronlar ana kanal da olduğundan emin olmak için.
Hücrelerin bağlanması için beş dakika bekledikten sonra, üst ve alt sağ kuyuların her birine yaklaşık 150 mikrolitre nöronal kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, üst ve alt sol kuyuların her birine 150 mikrolitre ortam ekleyin. Petri kabının üzerini kapatın ve çipi %5 karbondioksit, 37 santigrat derece kuvözde nemlendirilmiş tepsiye yerleştirin.
İlk olarak, aksonal bölmenin sol alt kuyusundan 20 mikrolitre çıkarın ve somatik bölmenin sağ üst kuyusuna yerleştirin. Her kanal daki akış için iki dakika bekleyin. Daha sonra, aksonal bölmeden 50 mikrolitre ortam çıkarın ve bu ortama bir milimolar Alexa Fluor 488 hidrazit0.3 mikrolitre ekleyin.
Pipet yukarı ve aşağı çözelti karıştırmak ve daha sonra aksonal bölmeye floresan boya içeren medya geri dönmek için. Bu noktada, çipi istediğiniz gibi mikroskoba ve görüntüye yerleştirin. Çip içinde aksotomi yapmak için, ilk olarak, pipet ucunu ana kanalın girişinden uzak tutarak medyayı aksonal bölmeden çıkarın.
Çıkarılan ortamı şimdilik bir santrifüj tüpünde saklayın. Daha sonra aspirasyon pipetini, aksonal bölmenin ana kanalının girişinden birini yakınına yerleştirin ve aksonal bölmeyi tamamen aspire edin. Bir ila iki dakika boyunca alan aspire etmeye devam edin.
Aksonal bölmeyi depolanan ortamla değiştirin. Çözeltinin bölmeden tamamen çıkarıldığından ve aksonların numuneye mikroskop altında bakılarak kesildiğinden emin olun. Sonra çipin üzerini kapatın ve kuvöze geri ver.
Floresan immünolemeye başlamak için, iç bölmeleri nemli tutarak, çipten ortamın çoğunu çıkarın. Hemen, aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyularına 100 mikrolitre fiksasyon çözeltisi ekleyin. Bir dakika sonra, alt kuyulara 100 mikrolitre fiksasyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika sabitleyin.
Çözeltinin çoğunu kuyulardan çıkarın ve hemen aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyularının her birine 150 mikrolitre PBS ekleyin. PBS'nin alt kuyulara akması için iki dakika bekleyin, ardından PBS'yi çıkarın ve aynı işlemi kullanarak kuyuları iki kez daha durulayın. Son durulamadan sonra, PBS'nin çoğunu çipin kuyularından çıkarın ve hemen aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyularının her birine %0,25 triton x-100 ile 150 mikrolitre PBS ekleyin.
15 dakika bekleyin ve sonra, kuyulardan sıvı nın çoğunu çıkarın. Hemen, aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyularının her birine 150 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin. 15 dakika sonra, kuyulardan sıvının çoğunu çıkarın ve hemen, aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyularının her birine birincil antikor çözeltisinin 100 mikrolitresini ekleyin.
Buharlaşmayı en aza indirmek ve oda sıcaklığında bir saat boyunca birincil antikordaki hücreleri kuluçkaya yatırmak için çipi kapatın. Daha sonra, çözeltinin çoğunu çıkararak ve aksonal ve sematik bölmelerin üst kuyularının her birine hemen 150 mikrolitre PBS ekleyerek çipi durulayın. Beş dakika sonra, PBS'yi her iki kuyudan da çıkarın ve iki kez daha durulayın.
Şimdi, kuyulardan sıvının çoğunu çıkarın ve hemen, Aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyularının her birine PBS'de 100 mikrolitre ikincil antikor ekleyin. Buharlaşmayı en aza indirmek için çipi kapatın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca çipi kuluçkaya yatırın. Daha önce gösterildiği gibi, pbs ile üç kez talaş durulayın, montaj ve görüntü aşağıdaki metin protokolünde açıklandığı gibi yongaları.
Burada gösterildiği gibi, plastik yongalar ve PDMS cihazlarda yetiştirilen nöronların yan yana karşılaştırmasi yapılır. Nöronal büyüme kültürde 15 güne kadar iki platform içinde karşılaştırılabilir, ancak uzun kültür yaşlarda, plastik çip içinde izole akson, daha az dayak ile sağlıklı görünür. Aksonal kompartmanlarda aksonları daha fazla görselleştirmek için, bu örnekler de beta tubulin III için immünostained edildi, hangi kültür de plastik yongaları içinde sağlıklı aksonal büyüme gösterir 22 gün.
24 günlük örneklerle daha fazla boyama, hem uyarıcı hem de inhibitör sinaptik belirteçleri, vGlut1 ve vGat'ı ifade etmek için plastik yongalarda yetişen nöronların olduğunu gösterir. Burada retrograd etiketli mCherry nöronlar ile birlikte iki sinaptik belirteçleri vardır. Bu çipin akson yaralanması ve rejenerasyon çalışmaları için uygunluğunu göstermek için retrograd etiketli nöronlar aksotomiden önce ve 24 saat sonra görüntülenmiştir.
Bir retraction ampul ve rejeneratif akson aksotomi aşağıdaki her ikisi de belirgindir. Bu sonuçlar, PDMS tabanlı aygıtlar kullanılarak yayınlanan verilere eşdeğerdir. Klasik çok bölmeli çipler, uzun süreli nöron kültürleri sağlayan ve üç haftadan uzun süre yaşatılabilir olan nöronları bölümlere ayırmak için kullanımı kolay bir seçenek sunar.
Bu prosedürü çalışırken, uygun sayıda nöronların tohumunu hatırlamak ve kuvözünüzün kültür sırasında iyice nemlendirildidiğinden emin olmak önemlidir.
