Name: rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples at JoVE.com

Biz Susanne Lopes Rasmussen ve Solvej Kolbjørn Jensen teknik yardım ve klinik örnekleri işleme için teşekkürler. Bu proje finansman yenilikçi ilaç girişimi 2 ortak girişim Hibe Sözleşmesi N ° 115843 altında aldı EbolaMoDRAD Konsorsiyumu bir parçasıdır. Bu ortak girişim, Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı ve EFPIA destek alır.

Biyomedikal Araştırma Etik Komitesi, Başkent Bölgesi onay verdi ve tüm yöntem tanımlamak burada bir inceleme tahlil kalkınma projeleri üzerinde Danimarka yasa uyarınca etik kurul sistemi tarafından muaf.
1. virüs Inactivation ve hızlı NA çıkarma için kan toplama camlı hazırlanması
Dikkat: Bu iletişim kuralı için kullanılan arabellek guanidinium thiocyanate (GITC) ve iyonik olmayan yüzey aktif, tahriş edici içerir. Uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak, bir akış başlığı kullan ve üstesinden eldiven giyerler. Herhangi bir cilt ve göz teması önlemek. Arabellek döküldü, bu karışım zehirli siyanür oluşumuna neden olabilir çünkü kontamine yüzeyi hiç kloramin veya sodyum hipoklorit ("çamaşır suyu" içinde aktif maddeler) ile doğrudan dezenfekte gerekir. Önce emici doku ile dökülen tampon kadar Sil. Daha sonra ve daha sonra su ile % 70 etanol ile yüzeyi temizleyin ve son olarak, kloramin veya sodyum hipoklorit kullanın.
<ol><li>Kan toplama camlı hazırlamak için belirli ticari lizis arabelleği 1.6 mL tüp 25 G x 1 iğne ve 3 mL şırınga kullanarak kapak delme tarafından 4 mL EDTA Vakum tüpün içine enjekte et. Not: vakum tüpü kapağını çıkarmak değil. Vakum muhafaza edilmelidir.</li>
	<li>Camlı oda sıcaklığında arabellek kullanımı kadar içeren depolar. Not: Tüpler onların hazırlık sonra en az 1 yıl boyunca stabildir.</li>
</ol>2. NA çıkarılması için arabellekleri hazırlanması
<ol><li>Arabellekleri bir NA çıkarma için hazırlamak için iki 1,8 mL, iki 4.5 mL ve bir 3,6 mL tüpler bir rafa yerleştirin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, manyetik cam parçacıkları (MGPs) bir temiz 1,8 mL tüp ve bununla MGPs. Resuspend MGP süspansiyon tamamen pipetting önce etiket için 960 µL tarafından. Not: MGPs hızlı tüp alt kısmında toplamak için eğilimindedir.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, yıkama arabellek 4 mL ben temiz 4.5 mL tüp tarafından ve WB-1 olarak etiketleyin. Dikkat: Yıkama arabellek ben tahriş edici guanidinium klorür içerir. Uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak, bir akış başlığı kullan ve üstesinden eldiven giyerler. Herhangi bir cilt ve göz teması önlemek.</li>
	<li>Ekleme, pipetting tarafından bir temiz 3.6 mL tüp yıkama arabelleğe II 1,5 mL ve WB-2 etiketleyin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting tarafından yıkama arabelleğe III temiz 4.5 mL Tüp 3 mL ve WB-3 etiketleyin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, elüsyon arabelleği için bir temiz 1,8 mL tüp 100 µL tarafından ve EB etiketleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında bölünmemeli arabellekleri kullanmak kadar saklamak. Not: Tüpler onların hazırlık sonra en az 1 ay boyunca stabildir.</li>
</ol>3. kan koleksiyonundan işaret ve bir virüs enfeksiyonu olan hastalarda
Dikkat: tam kan hastadan toplarken uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak. Eldiven ve gözlük giymek. Hasta yalıtım modunda ise, Biyogüvenlik seviye 4 yordamları izleyin.
<ol><li>Hastanın intravenöz tam kan toplamak için bir kelebek iğne ile küçük uzantısı boru ve bir kan toplama vakum tüpü lizis/bağlama arabellek içeren kullanın. Hastanın kolunu aşağı doğru bir konumda dinlenme ve kelebek iğne alt toplama tüp getirin. Kelebek iğne hastanın damar içine yerleştirin ve kan toplama vakum tüpü küçük uzantısı ekleyebilirsiniz. Not: Bu geri akış engeller.</li>
	<li>Kan toplama sonra 5 - 10 kez tüp saygısız tüp içeriği karıştırın. Not: otomatik olarak 1.6 mL lizis/bağlama arabellek içeren kan toplama tüp kalan boşlukta nedeniyle toplanan örnek hacmi 1.6 mL olacaktır.</li>
	<li>% 70 etanol kullanarak tüp dýþýna dezenfekte.</li>
	<li>Tüpler, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Not: Protokol burada duraklatıldı ve tam kan toplama tüpler-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C veya 37 ° C en az 1 ay7için saklanabilir.</li>
	<li>Doğrudan Basitleştirilmiş NA ayıklama yönteme geçin.</li>
</ol>4. tam kan çıkarılması NA Basitleştirilmiş
<ol><li>NA lizis/bağlama arabellek inaktive toplanan kandan, mix arındırmak için vakum saygısız tarafından tüp içeriğini el ile 5-10 x tüp.</li>
	<li>Tüpün kapağı dikkatli bir şekilde çıkarın ve boşaltma kapağı.</li>
	<li>MGPs (1 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Yeni bir kapak bir kullanılmayan kan toplama tüp örnek içeren tüpü yerleştirin.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı olduğundan emin olun ve kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat saygısız tüp içeriğini karıştırmak için kapağı yerleştirin.</li>
	<li>Tüp manyetik tutucu içinde yerleştirin ve kapağını tüp sıkıca kapalı sağlamak için bir parmak tutmak.</li>
	<li>Tüp ile manyetik sahibi tüm MGPs tüp mıknatıs ile tarafında toplanan emin olmak için el tarafından birkaç kez çevirin. Not: Manyetik tutucu uzun bir mıknatıs ve bir lastik bant ile değiştirilebilir.</li>
	<li>Tüp kapağını kaldırmak ve tek kullanımlık bir pipet kullanarak veya içeriği 50 mL toplama tüp içine dökme tarafından sadece tüp içeriğini atın. Not: 50 mL toplama tüp aerosoller kapaklı tüp kapatarak kaçının.</li>
	<li>WB-1 (4 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>Kapağı güvenli bir şekilde bir parmak ile sıkılır tutmak manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat lanetleme tarafından resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 olan adımları yineleyin.</li>
	<li>WB-2 (1,5 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp birkaç saniye için el ile saygısız resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>WB-3 (3 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat lanetleme tarafından resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 olan adımları yineleyin.</li>
	<li>EB hazır aliquot dökün (100 µL) doğrudan kan toplama tüp içine.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>MGPs EB içinde kan toplama tüp bir parmak ile 5 - 10 kez dokunarak resuspend. Not: Burada protokol duraklatılmış ve tüpler-20 ° C'de depolanan</li>
	<li>Bir damlacık (5-8 µL) resuspended MGPs 1,5 mL tek kullanımlık pipet (herhangi bir aşağı akım tanılama NA amplifikasyon tahlil lamba/RT-lamba veya qPCR/RT-qPCR deneyleri kullanılan gibi) kullanarak aşağı akım NA amplifikasyon tepki karışıma aktarın. Not: NAs MGPs için sopa, aşağı akım NA amplifikasyon tepki MGPs kullandığınızdan emin olun. Kullanmadan önce MGP süspansiyon karıştırın. Karıştırma sonra MGPs tüp alt kısmında toplayacaktır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li><li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood.">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li><li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015.">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li><li>Yang, M., Ke, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+a+Rapid+and+Sensitive+EBOV-RPA+Test+for+Rapid+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease.">Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type.">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li><li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable,+Pressure+Driven,+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics.">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li><li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests.">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li><li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis.">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li><li>Schmitz, H., K&#246;hler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever.">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li><li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution.">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li><li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever.">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li><li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus.">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow,+microfluidic,+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection.">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li><li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+(v2.5)+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom.">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li><li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone:+A+Field+Evaluation+Study.">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).</li><li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).</li><li>MPLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve basit el ile başucu NA çıkarma yöntemi lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan virüs aşağı akım moleküler tespiti için açıklar. Açıklanan NA çıkarma yöntemi doğrudan lizis/bağlama arabellek (Tablo reçetesi)7içeren vakum kan toplama tüplerde toplanan tam kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilen için geliştirilmiştir. Bu belirli bir arabellek EBOV7 inaktive ve yöntem kritik bileşenidir. Kan toplama sonra tam inactivation örnek sağlamak için en az 20 dk7 tüp kuluçka öneririz. Başucu EBOV inactivation BSL-4 koşulları gibi sıkı koruma koşullar altında herhangi bir EBOV pozitif örnekleri işleme gereksinimini ortadan kaldırır ve normal BSL-2 şartlar altında ele alınması örnekleri sağlar. Büyük olasılıkla diğer risk grubu dört patojenleri gibi Lassa virüs, Marburg virüsü ve Kırım Kongo kanamalı ateşi virüs de bu arabellek tarafından inaktive ama bu almak için kalır.
Açıklanan NA ayıklama yöntemi hastalar hastanede tecrit koğuşuna ya da bir sahra hastanesi yanında yapılması için geliştirilen ve bu nedenle, santrifüjler, Isıtma blok veya elektrik gibi hiçbir Labaratuar donanımları gerektirir. O NA çıkarma yöntemi tüpler MGPs veya yıkama arabellekleri, manyetik tutucu ve tek kullanımlık pipetler sabit bir birimi içeren gerektirir. Arabellek içeren tüpler öncesi hazırlanması protokol kolaylaştırır, çünkü pipetler gereksinimini ortadan kaldırır ve bunun yerine, bölünmemeli arabellekleri doğrudan örnek tüpler içine dökülür. Manyetik tutucu NA içeren MGPs yakalar ve yıkama adımları kolay bir kullanım aracılık eder. Bir manyetik tutucu kullanılamaz durumda manyetik tutucu sıradan bir mıknatıs ve bir lastik bant ile yerine; Ancak, manyetik tutucu tüp bırakarak ve içeriği mıknatıs ve lastik bant uygularken dökülüp, uygulamalı riskini azaltır. Lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan örnek viskozite nedeniyle, tek kullanımlık pipetler tüpünden süpernatant/sıvı/yıkama arabellekleri kaldırmak için kullanılır. Tek kullanımlık pipetler bir doğrudan tüp İçindekiler bir atık toplama tüp içine dökerek yerine ama tüp dışında herhangi bir damlacıklar yaratmak için değil unutmayın. Damlacıkları oluşturduysanız, bu karışım zehirli siyanür oluşumuna neden olabilir çünkü kontamine yüzeyi hiç kloramin veya sodyum hipoklorit ("çamaşır suyu" içinde aktif maddeler) ile doğrudan dezenfekte gerekir. Bu nedenle, ilk dökülen Eğer dökülme emici bir doku ile silin. Ardından, % 70 etanol ile ve sonra bol su ile yüzeyi temizleyin ve son olarak, kloramin veya sodyum hipoklorit kullanın. Bu (atık toplama tüp ve tek kullanımlık pipetler de dahil olmak üzere) lizis/bağlama arabellek ile temas oldu tüm atık içerir. Bunun yerine, ayrı bir atık konteyner tüm atık toplama ve sadece % 70 etanol kapsayıcıyla dýþýna dezenfekte.
NAS'ın normalde MGPs bir Isıtma adımı sırasında eluted ama bu Isıtma adım elektrik ve ekipman kullanımı ortadan kaldırmak için Basitleştirilmiş NA ayıklama kuralında kaldırıldı. Bu nedenle, NAs olan, bu nedenle, aşağı akım NA algılama tahlil için olumlu bir NA algılama eklemeniz gerekir MGPs sopa eğilimindedir. MGPs 1,5 mL tek kullanımlık pipet üzerinden bir damlacık aşağı akım tepki karışımının aktarılır. Bu ek bir yüzgeci ucu pipet kullanarak normal bir ek olarak kesin değildir; Ancak, unprecise yanı sıra NA/MGPs lamba, RT-lamba, qPCR veya RT-qPCR reaksiyon karışımı değil tepki inhibe veya floresan sinyal bizim in-house teşhis tahlil etkisi. Yine de, bu tahlil tahlil farklı olabilir ve biz aşağı akım her NA test doğrulanır ve testin duyarlılığı Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi kullanarak test öneririz. NA çıkarma yöntemi nispeten duyarlı ve bir DNA veya RNA virüsü 3.000 kopya/mL kolayca ayıklanır ve aşağı akım moleküler testlerde, qPCR gibi algılanan gibi düşük içeren tam kan örnekleri var. Klinik örneklerinde viral yük bir enfeksiyon akut faz sırasında genellikle çok yüksektir ve genellikle EBOV gibi kanamalı ateşi virüsler, Lassa virüs ve Kırım Kongo kanamalı ateşi virüs, 10'dan fazla5 kopya/mL9 içeren ,10,11. Bu nedenle, virüsler Bu örneklerdeki kolayca bu NA çıkarma yöntemi kullanarak tespit edilebilir. Ancak, MPLB inactivation EBOV7, vaksinia ve ineklerde dışındaki virüs virüs8 gösterilmesini kalır.
Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi hastane yalıtım Wards veya alan ayarları'nda gerçekleştirilen ve bakım noktası moleküler teşhis için idealdir. Ancak, yöntem yüksek üretilen iş NA çekimi açık bir tüp için yakışıklı-üstünde işleme nedeniyle geçerli değildir. Yüksek işlem hacmi NA çekimi gerekiyorsa, Inaktif tam kan örnekleri, NA ayıklama robotlar7kullanarak kolayca saf. Bir diğer dezavantajı lizis/bağlama arabellek [% 20-30 Polietilen glikol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil eter ve % 30-50 guanidinium thiocyanate (GITC)]17 ve yıkama arabellek gibi zararlı kimyasalları kullanımı olduğunu ben (% 30-50 guanidinium bir akış başlık dışında açık bir tüp içinde klorür)17 . Yoğun biçimde lizis/bağlama arabellek vakum tüpü içinde ve kan 1:1 (v/v) koleksiyonu ile yer alıyor, tüp açılmadan önce konsantrasyonu azalır. Açılış vakum tüplü ve ekleme/kaldırma MGPs veya yıkama arabellek bir kaç saniye içinde gerçekleştirilir ve bu nedenle, aerosoller zehirlenmesinden riski azdır. Yıkama arabellek çıkarıldıktan sonra-ben, tüp sizden hiçbir zararlı diğer reaktifler iletişim kuralında kullanılır.
20133,6,12,13,14,15,16 EBOV patlak beri pek çok hızlı bakım noktası moleküler testleri ve aygıtlar geliştirilmiştir . Ancak, çoğu bu testler, hala bulaşıcı malzeme, BSL-3 Biyogüvenlik kabini ve Pipetler, santrifüj ve Isıtma blok veya elektrik gibi en az, bir laboratuar donanımları, bir yukarı-stream işleme gerektirir. Biyogüvenlik kabinleri kullanımını karmaşıklaştırır ve hızlı tanı uzatır. Basitleştirilmiş NA ayıklama yöntemi ile kombine virüs inactivation tüpler doğrudan koleksiyonuna kan ile açıklanan başucu virüs inactivation Biyogüvenlik kabinleri, elektrik ve laboratuvar olanakları ortadan kaldırır. Ayrıca, hastanın yanında gerçekleştirilen ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aygıt bir lamba reaksiyon ile birlikte basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi çünkü güvenli bir başucu moleküler tanı 40dakika içinde elde edilebilir.

Virüs salgını durumlarda hastaların hastane yalıtım wards veya hızlı tanı gerekli olduğunda, sınırlı zaman güvenli, basit ve doğru bakım noktası moleküler tanı hasta bakım ve risk çevreleme için zorunludur. İki son virüs salgınları, Ebola virüsü (EBOV) Batı Afrika'da (2013) ve Güney Amerika (2015), Zika virüs geliştirilmiş bakım noktası moleküler tanı testleri, Ters transkripsiyon döngü-aracılı İzotermik gibi ilgi arttı amplifikasyon (RT-lamba)1,2 ve recombinase polimeraz amplifikasyon (RPA)3,4. RT-lamba ve RPA Basitleştirilmiş örnek hazırlıkları üzerinde gerçekleştirilebilecek hızlı, hassas ve belirli moleküler testlerdir. Zika virüs için RT-lamba Zika virüs olmayan saf tam kan örneklerinde 30 dk1içinde tespit edebilen bir yanal akışı tahlil (LFA), ile birlikte; Ancak, bir risk grubu 4 patojen sınıflandırılır ve çok bulaşıcı, EBOV örnekleri Biyogüvenlik altında ele alınması gerekir 4 (BSL-4) koşulları düzey ve güvenli herhangi bir tanı yöntemleri uygulanmadan önce inaktive olur.
Örnek2,3,4,5, lizis arabellekleri eklenmesi gibi EBOV için Basitleştirilmiş inactivation yöntemleri salgını sırasında kullanılması; Ancak, bu yöntemler ile Laboratuar donanımları, BSL-3 Biyogüvenlik kabinleri, santrifüj, Isıtma blokları ve Pipetler, en azından gibi BSL-4 koşulları altında işlem gerektirir. Bu ekipman yalıtım koğuşlarında ya alan hastaneler mevcut değil normal. Bu zorluğu aşmak için bavul3' te gerçekleştirin teşhis için yapılan girişimleri ve birkaç taşınabilir cihazlar ve makineleri gelişmiş [Örneğin, nükleik asit (NA) çıkarılması için taşınabilir bir aygıta] olmuştur6. Ancak, EBOV-pozitif örnekleri hala bu cihazların kullanılabilmesi için önce inaktive gerekir.
Biz daha önce bir hızlı başucu virüs inactivation yöntemi EBOV7, vaksinia virüs ve ineklerde virüs8 için buna ek olarak bir ticari lizis/bağlama arabellek tarafından sıradan vakum kan toplama tüpler için doğrudan için izin bildirdin hastanın transfer kan inactivation arabellek7içine. Bu doğrudan ve anında inactivation kapalı bir sistem içinde BSL-4 koşullar7gibi herhangi bir sıkı koruma kullanarak örnekleri işleme gereksinimini ortadan kaldırır ve örnekleri normal BSL-2 şartlar altında ele alınabilir. Bu inactivation Yöntem robotlar ve el arıtma kitleri7gibi birkaç NA emme tesisleri ile uyumludur; Ancak, bu yöntemler laboratuvar donanımları, robotlar, santrifüj ve elektrik, her zaman mevcut alan ayarları veya hastane yalıtım wards değil gibi gerektirir.
Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş el ile NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki moleküler tespiti için açıklar. NA çıkarma yöntemi bir mıknatıs/manyetik tutucu dışında herhangi bir donanım gerektirmez. Santrifüjler blok veya elektrik Isıtma, NA çıkarma için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler, hastane yalıtım Wards veya düşük kaynak ayarları ile) kullanılır. NA çıkarma yöntemi hızlı ve basit ve doğrudan testlerde herhangi bir aşağı akım NA, qPCR, RT-qPCR, lamba veya RT-lamba gibi kullanılabilir. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aleti ile birleştirildiğinde, başucu tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus Blood Collection</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1 needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>LUER LOK syringe (3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle with small-bore extension tubing</td><td>J&amp;oslash;rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr><tr><td>1% Virkon</td><td>Nomeco A/S</td><td>849265</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>3038505001</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&amp;trade;-5 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette (3.5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Samco&amp;trade; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Nunc&amp;trade; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

Hızlı tanı bir enfeksiyonu salgını yönetimi, risk çevreleme ve hasta bakımı için önemlidir. Biz daha önce Ebola virüsü hızlı başucu inactivation güvenli nükleik asit (NA) testleri için kan örnekleme sırasında için bir yöntem bir ticari lizis/bağlayıcı arabelleğe doğrudan vakum kan toplama tüpler içine ekleyerek göstermiştir. Bu başucu inactivation yaklaşımı kullanarak, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş başucu NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki tespiti için geliştirdik. NA çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir.
Kan lizis/bağlayıcı arabelleğe toplandıktan sonra içeriği el ile tüp lanetleme tarafından karışık ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe. Manyetik cam parçacıkları (MGPs) tüp eklenir ve içeriği el ile toplama tüp saygısız karıştırılır. MGPs sonra bir manyetik tutucu veya bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak kan toplama tüp tarafında toplanır. MGPs üç kez yıkanır ve toplama tüp içine doğrudan elüsyon arabellek eklenmesinden sonra NAs qPCR veya izotermal döngü amplifikasyon (lamba), reaksiyon gelen MGPs kaldırılması olmadan gibi NA testler için hazırız. NA çıkarma yöntemi herhangi bir laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir ve kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler ve hastane yalıtım wards) kullanılır. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir alet ile birleştirildiğinde, bir tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.

Burada sunulan iletişim kuralı basit ve etkili ve geniş lizis/bağlama arabellek inaktive bulaşıcı tam kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilen herhangi bir moleküler tahlil için uygulanabilir. Kan inactivation ve NA çıkarma için iş akışı kan toplama camlı7 (Şekil 1A), kan toplama7 (Şekil 1B), ( NA ayıklama hazırlanması da dahil olmak üzere Şekil 1' de gösterilen Rakamlar 1 c - 1 H) ve aşağı akım NA Analizi (Şekil 1I).
Basitleştirilmiş NA ayıklama Protokolü nedeniyle MGPs elüsyon adımından kaldırılmaz ve bu nedenle, NAs MGPs için sopa eğilimindedir. Herhangi bir aşağı akım moleküler analizi, qPCR veya lamba analizi, gibi doğrudan MGPs üzerinde (Şekil 1I ve Şekil 2) olumlu bir sonuç sağlamak için yapılması gerekiyor.
NA ayıklama yöntemi ile viral yük 130-3.000 kopya/mL elde edilebilir ve ya qPCR ya da RT-qPCR (Şekil 3) kullanılarak analiz gibi düşük verimli ve RNA veya DNA-virüs-pozitif tam kan örnekleri var.
NA çıkarma yöntemi, lamba veya RT-lamba ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aygıt için virüs-pozitif tam kan örnekleri kullanarak, bir tanı kan Collection (Şekil 4) 40 dk içinde elde edilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58001/58001fig1.jpg"> Resim 1 : İş akışı tam kan örneklerinin Basitleştirilmiş NA çıkarılması için. Bir iğne ve şırınga kullanarak lysis/bağlama arabellek vakum kan toplama tüpler(a)hazırla. (B) toplamak bir kelebek iğne kullanarak kan. (C) yer kan toplama tüp bir tutucu kapağı çıkarın ve MGPs tüpün içine dökün. (D) tüp yeni bir kapak ile kapatın ve içeriği el ile tüp saygısız karıştırın. (E) tüp manyetik tutucu saygısız tarafından kan toplama tüp tarafında MGPs toplamak. (F) Kaldır tek kullanımlık bir pipet kullanarak süpernatant. (G) yıkama veya elüsyon arabellek doğrudan kan toplama tüp içine dökün ve paneller D - Fgösterilen eylemler tekrarlayın. (H) Bu panel gösterir MGPs doğrudan kullanıma hazır bir qPCR RT-qPCR, lamba veya RT-lamba tepki. (ben) Transfer bir damlacık (5-8 µL) MGPs, 1,5 mL tek kullanımlık pipet kullanarak bir PCR veya lamba tepki tüp için. A ve Bpaneli: Bu rakam Rosenstierne ve ark. değiştirildi 7. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58001/58001fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58001/58001fig2.jpg"> Resim 2 : NA algılama 28 virüs-pozitif tam kan örneklerinin Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemiyle çıkarılan. Tam kan örnekleri (1.6 mL) test negatif bir virüs çivili için her iki DNA-virüs [Epstein - Barr virüsü (EBV) (2.0 x 104 - 1.0 x 103 kopya/mL)] veya bir RNA virüsü [Hepatit C virüsü (HCV) (6.0 x 105 - 103 kopya/mL x 3.0)] ya da dang virüs (DENV) (1.7 x 108 - 1.7 x 106 kopya/mL). NAS'ın yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak elde ve ayıklanan NAs yinelenen içinde belirli şirket içi qPCR, RT-PCR, lamba veya RT-lamba, ile ya da ezelî MGPs analiz edildi. X-ekseni = NA algılama metodu, y-eksen örnekleri qPCR/lamba içinde olumlu yüzdesi =. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58001/58001fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58001/58001fig3v2.jpg"> Şekil 3 : Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi duyarlılığını. Yöntem kavramının bir kanıtı, virüs negatif tam kan farklı RNA veya DNA virüs hazırlıklar tanımlanmış bir viral yük içeren çivili ve NAs Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemini kullanarak elde. (A)negatif tam kan (1.4 mL) ile 10 kat dilutions Guéckédou/Gine (2.0 x 106 kopya/mL) son patlak üzerinden hazırlanan tanılama amacıyla (ENIVD), hazırlanan EBOV standart 200 µL çivili. Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir MX3005P termal cycler kullanma bir kurum içi EBOV özgü RT-qPCR7 tarafından analiz edildi. (B) tam kan (1.2 mL) bir HCV kim standart serum örneği 10 kat dilutions 400 µL ile çivili (1.2 x 106 IU/mL). Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir in-house HCV özgü RT-MX3005P termal cycler kullanarak qPCR tarafından analiz edildi. (C) tam kan (1.2 mL) 400 µL EBV (2.0 x 104 kopya/mL, 8,0 103 kopya/mL x, 103 kopya/mL x 2.7 ve 9,3 x 102 kopya/mL) farklı konsantrasyonları ile çivili. Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir in-house EBV özel qPCR tarafından analiz edildi. (D) tam kan (1.2 mL) ile 10 kat dilutions BK virüs (1.3 x 104 kopya/mL) 400 µL çivili. Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir in-house BK özel qPCR tarafından analiz edildi. X-ekseni (kopya/mL veya IU/mL), çivili tam kan örneğinde bir virüs son konsantrasyonu = y-eksen Ct-değeri (ortalama ± SD) =. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58001/58001fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58001/58001fig4v2.jpg"> Şekil 4 : Basitleştirilmiş NA çekme ve RT-lamba ya da lamba izotermal bir taşınabilir aygıtta. (A)EBOV-pozitif tam kan örnekleri bölümü virüs & mikrobiyolojik özel tanılama, Serum Institut stats, Danimarka olmaması nedeniyle negatif tam kan 1.4 mL EBOV farklı dilutions 200 µL ile çivili yapıldı. tanılama amacıyla (ENIVD) hazırlanan standart. Çivili örnekleri Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemini kullanarak bir NA çıkarma yapıldı ve EBOV özgü RT-lamba reaksiyon tarafından analiz edildi. Bir negatif kontrol, bir negatif tam kan örneği dahil edildi. X-eksen EBOV son konsantrasyonu çivili tam kan örneğinde (kopya/mL), y=-eksen pozitif için min =. (B) kavramının bir kanıtı için tam kan (1.6 mL) aliquots 7 hastalardan tanısı olumlu EBV (13.000-500 kopya/mL) virüs bölümü & mikrobiyolojik özel tanılama, Serum Institut stats, Danimarka, için bir NA uygulandı Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemini kullanarak ayıklama ve taşınabilir pil tahrik Genie II izotermal aygıtta EBV özel lamba reaksiyon tarafından analiz edildi. Bir negatif kontrol türedi B19-pozitif örnek dahil edildi. X-ekseni EBV viral yük bir hasta örneğinde (kopya/mL), y=-eksen pozitif için min =. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58001/58001fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples at JoVE.com

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Burada, bir protokol virüsü inaktive tam kan rapid virüs nükleik asit çıkarılması için mevcut. Çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir. Yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir olabilir herhangi bir yere (Örneğin, alan hastanelerde) kullanılır.

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

rapid-safe-simple-manual-bedside-nucleic-acid-extraction-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K Görüntüleme.  Statens Serum Institut. Burada, bir protokol virüsü inaktive tam kan rapid virüs nükleik asit çıkarılması için mevcut. Çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir. Yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir olabilir herhangi bir yere (Örneğin, alan hastanelerde) kullanılır.

Video: Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Çevre

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

Ortak Liquid Handling Robotlar TruTip Teknoloji kullanarak Klinik Örneklerden DNA ve RNA yüksek verimlilik, Otomatik Ekstraksiyon

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biyomühendislik

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid impingement-based air sampling devices for efficacious concentration of negatively-charged viruses from bioaerosols. Thus, the resin serves as an additional concentration step in the bioaerosol sampling workflow. Nucleic acid extraction of the viral particles is then performed directly from the anion exchange resin, with the resulting sample suitable for molecular analyses. Further, this protocol describes a custom-built bioaerosol chamber capable of generating virus-laden bioaerosols under a variety of environmental conditions and allowing for continuous monitoring of environmental variables such as temperature, humidity, wind speed, and aerosol mass concentration. The main advantage of using this protocol is increased sensitivity of viral detection, as assessed via direct comparison to an unmodified conventional liquid impinger. Other advantages include the potential to concentrate diverse negatively-charged viruses, the low cost of anion exchange resin (~$0.14 per sample), and ease of use. Disadvantages include the inability of this protocol to assess infectivity of resin-adsorbed viral particles, and potentially the need for the optimization of the liquid sampling buffer used within the impinger.

An anion exchange resin-based method, adapted to liquid impingement-based bioaerosol sampling of viruses is demonstrated. When coupled with downstream molecular detection, the method allows for facile and sensitive detection of viruses from bioaerosols.

Anyon Exchange reçine kullanma Bioaerosols--dan virüs tespiti

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

VirWaTest, su örnekleri virüslerin tespiti için bir nokta-of-kullanım yöntemi

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Biyoloji

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by a high rate of transmission and low mortality, the COVID-19 pandemic necessitated accurate and efficient diagnostic testing, particularly in closed populations such as residential universities. Initial availability of nucleic acid testing, like nasopharyngeal swabs, was limited due to supply chain pressure which also delayed reporting of test results. Saliva-based reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) testing has shown to be comparable in sensitivity and specificity to other testing methods, and saliva collection is less physically invasive to participants. Consequently, we developed a multiplex RT-qPCR diagnostic assay for population surveillance of Clemson University and the surrounding community. The assay utilized open-source liquid handling robots and thermocyclers instead of complex clinical automation systems to optimize workflow and system flexibility. Automation of saliva-based RT-qPCR enables rapid and accurate detection of a wide range of viral RNA concentrations for both large- and small-scale testing demands. The average turnaround for the automated system was &#60; 9 h for 95% of samples and &#60; 24 h for 99% of samples. The cost for a single test was $2.80 when all reagents were purchased in bulk quantities.

The protocol describes a SARS-CoV-2 diagnostic method that utilizes open-source automation to perform RT-qPCR molecular testing of saliva samples. This scalable approach can be applied to clinical public health surveillance as well as to increase the capacity of smaller university laboratories.

Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

Kentsel Çevrenin Taranması - Çevre Rezervuarlarından SARS-CoV-2'nin Örneklemesi ve Tespiti için Bir Boru Hattı

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase polymerase amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a system for trace detection of DNA viruses. Target DNA is amplified and recognized by RPA and CRISPR/Cas12a separately, which triggers the collateral cleavage activity of Cas12a that cleaves a fluorophore-quencher labeled DNA reporter and generalizes fluorescence. For POC detection, portable smartphone microscopy is built to take fluorescent images. Besides, deep learning models for binary classification of positive or negative samples, achieving high accuracy, are deployed within the system. Frog virus 3 (FV3, genera Ranavirus, family Iridoviridae) was tested as an example for this DNA virus POC detection system, and the limits of detection (LoD) can achieve 10 aM within 40 min. Without skilled operators and bulky instruments, the portable and miniature RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with artificial intelligence (AI) assisted classification shows great potential for POC DNA virus detection and can help prevent the spread of such viruses.

We present a protocol that combines recombinase polymerase amplification with a CRISPR/Cas12a system for trace detection of DNA viruses and builds portable smartphone microscopy with an artificial intelligence-assisted classification for point-of-care DNA virus detection.

RPA-CRISPR/Cas12a-SPM ve Derin Öğrenmeye Dayalı DNA Virüs Tespit Sistemi

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase ...