Name: preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics at JoVE.com

Indiana Üniversitesi kütle spektroskopisi tesis ve Utah Üniversitesi Metabolomics çekirdek tesis bu iletişim kuralı en iyi duruma getirme konusunda yardım için teşekkür ederiz. J.M.T. tarafından ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM119557 altında desteklenir.

1. yumurta toplama
<ol><li>Yetişkin erkek ve istenen genotip bakire kadın toplamak. Tek tek bu hayvanlara yiyecek şişe standart Bloomington medya ile 3-5 gün için yaş.</li>
	<li>Uygun matings kadar 50 bakire kadın ve 25 erkekler için yeni bir gıda şişe aktararak ayarlayın. Not: Her genotip için en az altı bağımsız matings ayarlanmalıdır. Sadece bir örnek her (altı bağımsız matings toplanan Yani, altı örnekleri) çiftleşme üzerinden toplanacaktır.</li>
	<li>
Pekmez yumurta döşeme kapaklar hazırlayın.
	<ol>
<li>115 mL pekmezi ve agar 29 g H2O 2 lt şişeye içinde 700 mL ile karıştırın.</li>
		<li>Pekmez agar karışımı sıcak plaka üzerinde kaynatın.</li>
		<li>70 ° C'ye serin</li>
		<li>Asit karışımı (20 mL % 85 fosforik asit ve 209 mL propiyonik asit H2O; 1 L 25 mL ekleyin Bir kahverengi şişe deposunda) ve 10 mL % 10 p-hidroksi-benzoic asit metil ester % 95 etanol içinde.</li>
		<li>Pekmez agar 35 x 10 mm2 doku kültürü çanak kapağı ve alt bölümünü içine dökün. Not: pekmez ağar kaplamalar dökülmeden önce kapakları ve/veya 35 x 10 mm2 tabak tabanının kuytu bir Drosophila hisse senedi şişe (adım 1,6 olarak açıklanan) ağız içine sığacak emin olun. Bankası kullanılan plakalar marka bağlı olarak kullanılamayabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Taze Maya distile su ekleyerek yapıştırmak için etkin hale getirmek Kuru Maya (5 g Maya/7 mL su) karışım kadar katı bir yüzeye (yani, fıstık ezmesi tutarlılığını) kolayca yayılabilir bir hamur haline gelir.</li>
	<li>Yaklaşık 1.5 g Maya hamur bir pekmez yumurta döşeme kap yüzeyinde yayılmış.</li>
	<li>Dört hava delikleri bir plastik 6 oz. Drosophila hisse senedi şişe 22 G iğne kullanarak ters tarafı poke.</li>
	<li>Yeni şeklindeki sineklerin yiyecek şişe kültür şişe aktarın. Not: Sinekler tarafından aktarılabilir olarak geçici bir anestezi veya şişe şişenin ağzına üst tutarak ve keskin bir benchtop karşı şişe dibinde dokunarak CO2 kullanarak.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde bir pekmez yumurta döşeme kap Maya Yapıştır ile yüzey Drosophila hisse senedi şişe ağız içine yerleştirin. Laboratuvar bant yerde yumurta döşeme kap güvenliğini sağlamak için kullanın. Not: sinekler aktarmak için imzalat rahip olsaydı, tüm sinekler iyileşti kadar şişe yatay olarak benchtop üzerinde yer almalıdır. Sinekler tamamen mobil olduğunda, bir kuluçka pekmez yumurta döşeme kap alt kültür ile şişe yerleştirin.</li>
	<li>Pekmez yumurta atarken kapağı günde en az bir kez ilk iki gün için hisse senedi şişeyi ters çevirme, benchtop karşı şişenin dibinde dokunarak, eski yumurta kap kaldırarak ve yeni bir yumurta kap şişenin ağzına getirdikten hemen değiştirin. Eski yumurta atarken kapağı atmak. Not: Bu adım dişi yumurtalarını tutuyorsun değil ve senkronize nüfus topluluğu için sağlar sağlar.</li>
	<li>Yeni bir yumurta döşeme kap sonra günde 3, 2 h sonra Değiştir hisse senedi şişe içine yerleştirin ve atın. Kaldırmak ve dört saat sonra ikinci yumurta atarken kapağı değiştirin. Bu yumurta döşeme kap Tarih, saat ve genotip ile alt etiket. Not: Bu 4 h pencere sırasında toplanan yumurta analizi için kullanılır. Bu eşitleme özel gelişim aşamalarında analiz etmek için kritik bir adımdır. Yumurta bu şekilde birkaç gün için toplanabilir.</li>
	<li>Yumurta döşeme kapaklar bir 60 x 15 mm2 Petri tabağı ve kuluçka istenilen sıcaklık ve nem yerine takın.</li>
	<li>Yumurta döşeme kapaklar her gün açlık, nüfus yoğunluğu veya kirlenme ile ilgili sorunlar için kontrol edin. Not: Larva sürekli gelişimi sağlamak için yeterli gıda erişiminiz olmalıdır. Gerekirse, taze Maya Yapıştır deneyde kullanılacak Tüm yumurta döşeme kapaklar üzerindeki yayılabilir. Buna ek olarak, larva nüfus yoğunluğu çok yüksek ise larva kültür plaka dışarı dolaşmaya başlayacak. Yüksek nüfus yoğunluğu ve açlık wandering süre deneyimli ara nöbetleri tutarsız verilerde neden olur çünkü bu örnekler metabolomic analiz için kullanılmamalıdır. ~ 80 – 100 yoğunluğu orta orta üçüncü biçim (L3) plaka başına larva tavsiye edilir ikinci biçim larva (L2) veya plaka başına 40-50. Gözle görülür bakteri ve mantarlar ile kontamine örnekleri atılmalıdır.</li>
</ol>2. larva örnek koleksiyonu
<ol><li>İstenen sahne kadar yaş larvaları. L3 larva toplama, L2-L3 tüy dökme, örnekleri yeniden eşitleyin. Yeniden eşitleme işlemi yaygın gelişimsel kilometre taşı15ön vızıltısı kullanan bir yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak elde edilir. Alternatif olarak, orta-L3 larva sgs3 muhabir gen16kullanarak eşitlenebilir. Not: Bu bağlamda, biz bulmak L2 orta larva (~ 60 yumurta döşeme sonra h) çoğu analizleri için idealdir larva gelişme bu aşamada hala nispeten zaman uyumlu olduğundan, özenle toplanan örnekleri var bu timepoint için geliştirmek için yeterli yiyecek ve yönetilebilir (aşağıya bakın) hayvanlar örnek başına sayısıdır. L3 geliştirme sırasında oluşan çok sayıda ecdysone bakliyat metabolizma üzerinde dramatik etkiler ve eserler eşitlenmemiş nüfus oluşturur çünkü bir ek eşitleme adım L3 larva için gereklidir.</li>
	<li>Parçalanmış bir iğne hafifçe Maya Yapıştır agar kapalı kaldırmak için kullanın. Maya yeni bir pekmez agar kap üzerine yerleştirin. Not: Çoğu larva pekmez agar ve Maya Yapıştır arasında arayüz, yiyeceğim.</li>
	<li>Larva pekmez agar yeni maruz yüzeyinden toplamak için küçük bir fırça kullanın. Larvalar buz üzerinde 1,5 mL santrifüj tüpü yerleştirin. Not: Her gelişim aşaması için uygun örnek boyutları aşağıdaki gibidir: 50 ilk biçim larva (L1); 25 orta-L2 larva; 20 erken L3 larva; 15 L3 orta veya geç L3 larvaları.</li>
	<li>Yıkama ve büyük örnek kümesi toplarken örnekleri (adım 2,3 2,8 ile) küçük gruplar halinde (4-6 örnekleri) dondur. Örnekleri larva tüplerde yerleştirerek 20 dk içinde donmuş olmalısın. Not: Diğer tüpler örnek transfer sırasında adım 3 ile girişime neden olabilir çünkü Eppendorf 1.5 mL tüpler Flex kullanmanızı öneririz. Örnekleri microfuge tüplerde toplanan gerekir. 3.1. adımda anlatılan boncuk tüpler örnekleri toplamayın. Seramik Boncuklar yanlış kitle ölçüm sonuçları ve kirletici örnek tanıttı NaCl yıkama çözüm korur.</li>
	<li>Buz gibi %0,9 1 mL ekleyin NaCl içine tüp, kapağını kapatın ve dikey olarak tüp iyice larvalar yıkamak için ters çevirin.</li>
	<li>Tüp buz ~ 30 için geri koyun s. Bu süre içinde larva tüp alt batacağı ama Maya süspansiyon kalacaktır. Bir kez tüm larva gevşek Pelet oluşturdular, 1 mL pipet kullanarak NaCl çözüm kaldırın.</li>
	<li>Adım 2.4 ve adım 2.5 iki kez yineleyin veya son yıkama çözüm kadar temizleyin. Not: Ek yıkama adımlar toplanan örnek Maya aşırı miktarda varsa gerekli olabilir.</li>
	<li>2.000 × g 4 ° C'de 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Tüm kalıntı çözüm 200 µL pipet kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Hemen örnek sıvı azot dondur. Not: Bu adımda protokol duraklatılmış. Örnekleri-80 ° C'de 3 aya kadar saklanabilir</li>
</ol>3. transferi örnekleri boncuk tüpler için
<ol><li>Larva her örnek 1.5 mL microfuge tüpünden 1.4 mm Seramik Boncuklar içeren 2 mL screwcap tüpler aktarılması gerekir. Bu transfer adım için hazırlık olarak, bir etanol geçirmez işaretleyici (kapak üzerindeki işaretleri adımı sırasında 4.4 yok olacak) bir 2 mL screwcap boncuk tüp tarafında etiketlemek için kullanın.</li>
	<li>Dara doğru 0.01 mg ölçme yeteneğine sahip bir analitik denge kullanarak etiketlenmiş boncuk tüp kitle.</li>
	<li>Larva örnekleri-80 ° C'de depolanmış, örnek tüpler aktarmak için sıvı azot önceden içinde koyun.</li>
	<li>Uzun forseps 1,5 mL örnek tüp sıvı azot kaldırmak için kullanın dewar.</li>
	<li>Giyen nitril eldiven, donmuş kapmak Tüp, ters çevir ve keskin tüp kapağı donmuş Pelet çıkarmak için benchtop karşı pound. Hemen Pelet 2 mL önceden şeytan screwcap boncuk tüp içine dökün. Pelet çıkarmak başarısız olursa, tüp için sıvı azot dönmek ve tekrarlayın. Not: Tüm microfuge tüpleri larva granül çıkarmak değil. Önerilen bir başka bir tüp kullanarak, analiz için numune toplama önce larva granül yerinden Eğer belirleyin.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde larva Pelet ve boncuk tüp kombine kitle ölçmek. Hemen örnek tüp sıvı azot yerleştirin. Larva Pelet kitle metabolomic verileri normalleştirmek için kullanılacaktır. Not: Bu adımda protokol duraklatılmış. Örnekleri-80 ° C'de 3 aya kadar saklanabilir</li>
</ol>4. örnek çıkarma
<ol><li>Yer örnek-20 ° C benchtop soğutucu borular.</li>
	<li>Prechilled (-20 ° C) % 90 metanol her tüpün içine 2 µg/mL d4 süksinik asit içeren 0.8 mL ekleyin. Örnek-20 ° C benchtop soğutucu dönün. Not: D4 süksinik asit bir iç standart olarak hizmet vermektedir. Sadece HPLC Sınıf H2O ve metanol kullanın. Metanol ve diğer organik solventler uçucu ve doğru hava deplasman pipetler kullanarak ölçmek zor olduğundan, bu adım ve tüm aşağıdaki adımları için pozitif deplasmanlı pipetler kullanmanızı öneririz.</li>
	<li>Bir negatif kontrol 0.8 mL prechilled (-20 ° C) % 90 metanol 2 µg/mL d4 süksinik asit içeren bir boş boncuk tüp içine ekleyerek ayarlayın.</li>
	<li>Örnekler: 6.45 m/s 4 ° C sıcaklık kontrol odasında bulunan bir boncuk değirmen homogenizer kullanarak 30 saniye lunaparkçı. Not: başarısızlık hızla ve tamamen larva Pelet homojenize değişkenlik metabolomics analizde yaygın kaynağıdır. Sadece 30 içinde larva doku dondurulmuş yok edebilecek homogenizers kullanın s.</li>
	<li>Homojenize örnekleri tüpler-20 ° C benchtop soğutucu dönün ve onları en az 1 h için-20 ° C dondurucuda kuluçkaya.</li>
	<li>20.000 × g veya maksimum hızda 4 ° C'de 5 min için tüpler santrifüj kapasitesi elde edilen çökelti kaldırmak için.</li>
	<li>600 µL süpernatant ile yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Çökelti rahatsız etmeyin. Acele Pelet süpernatant pipetting sırasında yerinden olur varsa, tüm süpernatant tüp dönüp 4,6 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Örnek tüpler bir vakum santrifüje yerleştirin. Tüm tüpler santrifüj sızdırmazlık önce açık olduğundan emin olun. Tüm çözücü kaldırılana kadar örnekleri, oda sıcaklığında kuru (Bu adım genellikle ~ 16 tamamlamak için saat sürer). Not: gerekirse, bu adımda protokol duraklatılmış. Kurutulmuş örnek-80 ° C'de depolanan</li>
</ol>5. kimyasal Derivatization
<ol><li>Kurutulmuş örnekleri-80 ° C'de depolanmış, açılmamış örnek tüpler bir vakum santrifüje yerleştirin ve 30 dk için kuru. Bu adımı örnek tüp açmadan önce gerçekleştirilmelidir. Not: Bu adımı dondurucudan çıkardığında microfuge tüp dış toplar yoğunlaşma kaldırır. Protokol bu bölümünü H2için O son derece duyarlıdır ve tüm reaktifler mümkün olduğunca kuru tutmak için ekstra önlem alınmalıdır.</li>
	<li>
Susuz pyridine 40 mg/mL methoxylamine hidroklorid (MOX) çözeltisi hazırlamak. Sadece susuz pyridine kullanın. MOX ve pyridine bir desiccator depolamak ve günlük MOX çözüm hazırlamak. Dikkat: MOX ve pyridine zehirlidir. Bu çözüm duman başlıklı hazırlayın.<ol>
<li>1 mL Cam şırınga Kuru Isı tabancası kullanın.</li>
		<li>Şırınga iğne susuz pyridine şişe içine yerleştirin. 1 mL pyridine kaldırın ve MOX 40 mg içeren bir microfuge tüp ekleyin.</li>
		<li>Argon ile susuz pyridine şişe floş. Şişe mühür ve desiccator için dönmek.</li>
		<li>Pyridine MOX 600 rpm'de 10 dk 35 ° c termal bir mikser tüpte kuluçka tarafından çözülür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>40 mg/ml MOX 40 µL susuz pyridine çözümünde kurutulmuş örnek ekleyin.</li>
	<li>10 s ve kısaca santrifüj için girdap (10.000 x g 20 s).</li>
	<li>30 ° c termal bir karıştırıcı 600 RPM 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>20.000 × g veya partikül madde kaldırmak için 5 dakika için en yüksek hızı santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>25 µL süpernatant ile 250 µL devre dışı cam microvolume eklemek ile bir Otomatik Örnekleyici şişe içine aktarın.</li>
	<li>N- metil -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) % 1'i içeren 40 µL eklemek TMCS. Dikkat: MSTFA zehirlidir. Duman mahallede bu adımı gerçekleştirin. Not: varsa, bu adımı Gerstel Otomatik Örnekleyici tarafından tamamlanabilir.</li>
	<li>Bir kap üzerinde Otomatik Örnekleyici şişe yerleştirin ve crimper aracını kullanarak kapatın.</li>
	<li>Örnek 37 ° C'de (250 devir/dakika) sallayarak ile 1 saat kuluçkaya.</li>
	<li>Bir yağ asidi metil ester standart (ALEVLERİNİ) çözüm daha önce3desceribed hazırlayın. ALEVLERİNİ 3 µL robot otomatik örnekleyici hemen önce enjeksiyon kullanarak Otomatik Örnekleyici şişe ekleyin. Not: Alevlerini tutma zaman kaydırma kalibre ve cihazlarının performansını kontrol etmek için kullanılır. Hiçbir robot otomatik örnekleyici kullanılabilir durumdaysa, alevlerini adımı sırasında 5,8 eklenebilir.</li>
</ol>6. GC-MS algılama
Not: çoğu durumda, Kullanıcı bir kütle spektroskopisi çekirdek tesis yardımı ile bu adımı yürütecek. Bu iletişim kuralı bir 30 m, GC sütun 5 m koruma sütun ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
<ol><li>Örnek sipariş rastgele.</li>
	<li>
GC-MS hazırlayın.
	<ol>
<li>Küme helyum taşıyıcı gaz akış hızı 1 mL/dak.</li>
		<li>Giriş sıcaklığı 250 ° C'ye ayarla</li>
		<li>Aşağıdaki Sıcaklık gradyanı yürütmek için GC programı:<ol>
<li>İlk sıcaklığı 95 ° c ile 1 dk bir tutun.</li>
			<li>2 dk bir tutun ile 40 ° C/dk hızında 110 ° c sıcaklık artışı.</li>
			<li>250 ° C-5 ° C/dak rampa tarafından artırmak.</li>
			<li>330 ° c 4 dk son bir tutun ile 25 ° C/dk hızında artış.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Solvent gecikme için 3,5 dk ayarlayın. Not: Zaman GC-MS sistemine göre değiştirilebilir. Bu adımın amacı Dedektör zarar MSTFA ve MOX önlemektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Derivatized örnek 1 µL GC-MS (10:1 oranı split) enjekte. Not: örnek 2 µL doruklarına yoğunluğunu çok düşükse enjekte et. Örnekleri enjeksiyon sırasını randomize.</li>
	<li>Kütle Spektrometre tam tarama modunda bir kitle 50-500 m aralığında faaliyet/z.</li>
</ol>7. veri analizi
<ol><li>Ya hedefli veya hedeflenmemiş bir yaklaşım kullanarak metabolomic veri analiz. Hedeflenen analiz metabolitleri, biz aşağıda tarif laktat ölçümleri gibi tanımlanmış bir dizi bolluğu ölçme üzerinde odaklanmıştır. Buna ek olarak, hedefsiz analiz iki örnek kümesi arasındaki önemli ölçüde değişti herhangi bir metabolik özelliği tanımlamak için tarafsız bir yaklaşım kullanır. Not: Bizim laboratuvar öncelikle ücretsiz programlar MetAlign17 ve MetaboAnalyst18,19 veri analizi için kullanır. Hem kalite kontrol, normalleştirme ve veri işleme adımları yeterli bir açıklama bu yazının kapsamı dışındadır olduğundan, Kullanıcı veri işleme20,21' eayrılmış olan daha ayrıntılı iletişim kurallarına bakın, 22. Ayrıca, bu çözümleme için gereken adımları açıklayan bir akış şeması8başka bir yerde bulunabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila:+implications+for+aging+and+metabolic+diseases.">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).</li><li>Sieber, M. H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+metabolic+states+in+development+and+disease.">The role of metabolic states in development and disease.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 45, 58-68 (2017).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larvae+synthesize+the+putative+oncometabolite+L-2-hydroxyglutarate+during+normal+developmental+growth.">Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).</li><li>Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Estrogen-Related+Receptor+Directs+a+Metabolic+Switch+that+Supports+Developmental+Growth.">The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth.</a> Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).</li><li>Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabonomics':+understanding+the+metabolic+responses+of+living+systems+to+pathophysiological+stimuli+via+multivariate+statistical+analysis+of+biological+NMR+spectroscopic+data.">Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data.</a> Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).</li><li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+-+the+link+between+genotypes+and+phenotypes.">Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes.</a> Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).</li><li>Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+Studies+in+Drosophila.">Metabolomic Studies in Drosophila.</a> Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).</li><li>Lenz, E. M., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+strategies+in+metabonomics.">Analytical strategies in metabonomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).</li><li>Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatography/mass+spectrometry+in+metabolic+profiling+of+biological+fluids.">Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).</li><li>Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+exogenous+to+endogenous:+The+inevitable+imprint+of+mass+spectrometry+in+metabolomics.">From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).</li><li>Garcia, A., Barbas, C., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. , 191-204 (2011).</li><li>Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+urinary+metabolic+profiling+procedures+using+gas+chromatography-mass+spectrometry.">Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , 171-178 (1989).</li><li>Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glue+secretion+in+the+Drosophila+salivary+gland:+a+model+for+steroid-regulated+exocytosis.">Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis.</a> Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).</li><li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetAlign:+Interface-driven,+versatile+metabolomics+tool+for+hyphenated+full-scan+mass+spectrometry+data+preprocessing.">MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing.</a> Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis.">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li><li>Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+3.0-making+metabolomics+more+meaningful.">MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).</li><li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+(pre-)processing+of+nominal+and+accurate+mass+LC-MS+or+GC-MS+data+using+MetAlign.">Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign.</a> Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis.">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+inference+of+biological+patterns,+functions+and+pathways+from+metabolomic+data+using+MetaboAnalyst.">Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst.</a> Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).</li><li>Li, H., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development.">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Metabolomics ara metabolizma oluşturmak metabolik reaksiyonları incelemek için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu teknoloji, duyarlılığını ancak, genetik arka plan, gelişimsel ipuçları ve çevresel stresleri, sıcaklık, nem, nüfus yoğunluğu ve besin kullanılabilirliği de dahil olmak üzere çeşitli duyarlı verileri işler. Bu nedenle, bir yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir metabolomics analiz gerektirir örnekleri son derece kontrollü koşullar altında toplanması. Burada birkaç değerlendirmeleri bu n...

Meyve sineği Drosophila melanogaster ara metabolizma düzenleyen moleküler mekanizması eğitim için ideal bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Sadece çoğu metabolik yollar Drosophila ve insanlar arasında korunmuş ama anahtar besin sensörler ve büyüme düzenleyiciler, insülin, Tor ve myc, gibi aynı zamanda sinek1,2' aktif. Sonuç olarak, Drosophila insan hastalıkları diyabet ve obezite ateş ve kanser kadar çeşitli metabolik temeli keşfetmek için kullanılabilir. Bu bağlamda, Drosophila larva geliştirme hangi aerobik glikoliz veya Warburg etkisi olarak bilinen bir metabolik program çalışmak ideal çerçeve sağlar. Sadece birçok tümör aerobik glikoliz biyokütle karbonhidrat oluşturmak için kullanırken, öylesine Drosophila yapmak larva gelişimsel büyüme3,4,5tanıtmak için aerobik glikoliz harekete geçirmek. Bu benzerlikler arasında larva ve anlayış nasıl aerobik için anahtar bir model olarak Drosophila kurmak tümör metabolizma glikoliz düzenlenmiş vivo içindeolduğunu.
Anında metabolizma çalışmak için popüler bir model olarak ortaya çıkmıştır olmasına rağmen bireysel metabolitleri3, trehalose, trigliserid veya ATP gibi ölçmek için tasarlanmıştır yöntemleri en Drosophila çalışmaları güveniyor. Belirli bir iletişim kuralı her metaboliti ölçmek için gerekli olduğundan, tahlil tabanlı çalışmalar emek yoğun, pahalı ve ticari kitleri kullanarak ölçülen bu bileşikler karşı önyargılı vardır. Bir çözüm için bu kısıtlamalar Drosophila metabolizma eğitim daha etkili ve tarafsız bir yol sunan metabolomics alandan ortaya çıkmıştır. Tahlil tabanlı çalışmada farklı olarak, bir tek metabolomic Analizi aynı anda yüzlerce küçük molekül metabolitleri ölçebilir ve bir organizmanın metabolik durum6,7kapsamlı bir anlayış sağlamak. Bu teknik kapsamı Drosophila metabolik çalışmaların önemli ölçüde genişletti ve bu yeni ortaya çıkan alan8geleceği temsil eder.
Metabolomic çalışmalar öncelikle üç teknolojilerini kullanarak yapılır: (i) nükleer manyetik rezonans (NMR), (ii) sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ve (III) gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS)9. Farklı avantajları ve dezavantajları her yaklaşım sunuyor ve tüm bu teknolojilerin başarıyla Drosophila metabolizma çalışmaya kullanılmıştır. Bizim laboratuarımızda yapılan araştırma üzerinde küçük, kutup metabolitleri odaklandığı öncelikle bir GC-MS tabanlı yöntemi kullanır. GC-MS birçok avantajı da dahil olmak üzere yüksek tekrarlanabilirlik, en yüksek çözünürlük, hassasiyet, kullanıcıyla sağlar ve hızlı tanımlanması için izin veren bir standart elektron etkisi (EI) spektral Kütüphane kullanılabilirliğini metabolik keşfetti Şekil10,11. Örnekleri hazırlanması için GC-MS, ancak, biraz karmaşık ve ayrıntılı bir dikkat gerektirir. Örnekleri gerekir toplanacak, yıkanmış, tartılır ve hızlı bir şekilde metabolik reaksiyonlar quenches bir şekilde dondurulmuş. Ayrıca, sinek karkas standart homojenizasyon protokolleri için dayanıklı ve en uygun metaboliti ayıklama emin olmak için bir boncuk değirmen gerektirir. Son olarak, GC-MS tarafından analiz örnekleri algılama12önce kimyasal derivatization geçmek zorundadır. Daha önce yayımlanmış yöntemleri tarif tüm bu adımları3,13,14iken, Acemi kullanıcının tekrarlanarak yüksek kalitede veri oluşturmasına olanak sağlayacak görsel iletişim kuralı hala gereklidir. Burada Drosophila larva örnekleri metabolomics GC-MS tabanlı analiz için hazırlamak nasıl gösterir. Bu iletişim kuralı tekrarlanarak birçok merkezi karbon metabolizması oluşturmak küçük kutup metabolitleri ölçmek Kullanıcı sağlar.

<table><tbody><tr><td>Unsulfured blackstrap molasses</td><td>Good Food, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyamine hydrocholoride (MOX)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA with 1% trimethylchlorosilane</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>Fleischmann&amp;rsquo;s Active dry yeast</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6oz Drosophila stock bottle</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)&amp;nbsp;</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-627</td><td></td></tr><tr><td>Vial insert, 250 &amp;micro;L deactivated glass with polymer feet</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-Phosphoric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxy benzoic acid methyl ester</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>GC column</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics

Metabolomics alanındaki son gelişmeler meyve sineği Drosophila melanogaster hayvan metabolizma çalışmak için güçlü bir genetik model olarak kurduk. Drosophila genetik araçları geniş dizi ara metabolizmasının büyük tarama alanı anket yeteneği ile birleştirerek, bir metabolomics yaklaşım diyet, genotip, hayat-tarih olayları ve çevre ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimler ortaya çıkarabilir. Buna ek olarak, metabolomics çalışmalar roman enzimatik mekanizmaları keşfetmek ve görünüşte farklı metabolik yollar arasında daha önce bilinmeyen bağlantıları ortaya çıkarmak. Bu teknoloji Drosophila topluluk arasında daha yaygın kullanımını kolaylaştırmak için burada Drosophila larva örnekleri gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) için hazırlamak açıklar detaylı bir protokol sağlamak- metabolomic analizi dayalı. Bizim iletişim kuralı larva örnek koleksiyon, metaboliti ayıklama, kimyasal derivatization ve GC-MS çözümleme açıklamalarını içerir. Bu iletişim kuralı başarıyla tamamlanması amino asit, şeker ve organik asitler dahil glikoliz ve TCA döngüsü de dahil olmak üzere küçük kutup metabolitleri göreli bolluk ölçmek kullanıcılar izin verir.

Laktat dehidrogenaz dLDH etkinliği4ve genetik olarak uyumlu denetimleri eksikliği (dLDH) mutantlar L2 orta larva toplanmıştır ve yukarıda açıklanan protokolüne göre işlenir. Denetimleri ile karşılaştırıldığında, mutant larva laktat, pyruvate ve L-2-hydroxyglutarate4önemli değişiklikler sergi. Spectra bir AGILENT GC6890-5973i MS sistemi ile elde. GC-MS spectra örneği oluşturmak ile bizim protokol <strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics at JoVE.com

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Bu iletişim kuralı, Drosophila larva metabolomic GC-MS tabanlı analiz için hazırlamak açıklar.

Gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) Drosophila larva örnekleri hazırlanması-Metabolomics dayalı

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

preparation-drosophila-larval-samples-for-gas-chromatography-mass

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

11.1K Görüntüleme.  Indiana University. Bu iletişim kuralı, Drosophila larva metabolomic GC-MS tabanlı analiz için hazırlamak açıklar.

Video: Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Gelişim Biyolojisi

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Orta Ölçekli Hazırlanışı<em&gt; Drosophila</em&gt; Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetik

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

In iştahlı İlişkilendirilebilir Olfaktör Öğrenme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Nörobilim

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Davranış

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

Biyokimya

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması<em&gt; Drosophila</em&gt; Kafaları

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Biyoloji

FRET Sensörlerini Kullanarak Drosophila'da Beyin Metabolit Taşınmasının İzlenmesi

Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors

The high energy requirements of brains due to electrical activity are one of their most distinguishing features. These requirements are met by the production of ATP from glucose and its metabolites, such as the monocarboxylates lactate and pyruvate. It is still unclear how this process is regulated or who the key players are, particularly in Drosophila.
Using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors, we present a simple method for measuring the transport of monocarboxylates and glucose in glial cells and neurons in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation. The protocol describes how to dissect and adhere a larval brain expressing one of the sensors to a glass coverslip. 
We present the results of an entire experiment in which lactate transport was measured in larval brains by knocking down previously identified monocarboxylate transporters in glial cells. Furthermore, we demonstrate how to rapidly increase neuronal activity and track metabolite changes in the active brain. The described method, which provides all necessary information, can be used to analyze other Drosophila living tissues.

Yazar Spotlight: Drosophila Modelini Kullanarak Beyin Enerjisi Metabolizması Araştırmalarındaki Gelişmeler

Here we present a protocol to visualize the transport of monocarboxylates, glucose, and ATP in glial cells and neurons using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation.

Ex vivo Drosophila larva beynindeki monokarboksilatların ve diğer ilgili metabolitlerin genetik olarak kodlanmış sensörler kullanılarak görselleştirilmesi

Gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) Drosophila larva örnekleri hazırlanması-Metabolomics dayalı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması

Orta Ölçekli Hazırlanışı

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

In iştahlı İlişkilendirilebilir Olfaktör Öğrenme

Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması

Ex vivo Drosophila larva beynindeki monokarboksilatların ve diğer ilgili metabolitlerin genetik olarak kodlanmış sensörler kullanılarak görselleştirilmesi