Bağımsız araştırma, teknoloji ve üretim, Danimarkalı kurulu #4005-00029 vermek

Deneysel Kur etik ve yasal sınırlama yoktur vardır ve Roskilde Üniversitesi ile anlaşma yapılmıştır. Deneysel set-up bir bakış resim 1 ve Şekil 2optik kamera mekanizmaları görülebilir.
1. hazırlık
<ol><li>Tüm adımları bir steril laminar akış-tezgah tezgah ve tüm ekipmanları ile % 70 etanol başından önce deneme temizleyerek gerçekleştirin.</li>
	<li>Hücreler için en uygun koşulları sağlamak için % 5 CO2 37 ° C'de geleneksel bir kuluçka optik kamera yerleştirin.</li>
	<li>%10 FBS ve 1 x antibiyotik (penisilin ve streptomisin) bir T75 şişesi ile DMEM medyada HaCaT hücrelerin büyümesine.</li>
	<li>1 mL 1 x tripsin hücreleri bağlantısını kesin ve onları her 3-4 gün yetiştirmek hücresel katmanı üzerinden Dispergatör tarafından alt için kullanın. Oda sıcaklığına kullanmadan önce ön ısı.</li>
</ol>2. HaCaT Monolayer üreten hücreleri bir 48-kuyu Microtiter plaka
<ol><li>Orta T75 şişeye Pasteur pipet ile kaldırın.</li>
	<li>Şişeye yapışık hücreleri T75 şişesi 5 mL 1 x steril PBS ekleyerek yıkayın. Not: PBS kalsiyum ve magnezyum serbest olduğundan emin olun.</li>
	<li>PBS geçirilip yorumlanması için dolaştırmak ve Pasteur pipet ile çıkarın.</li>
	<li>2.2 2.3 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Şişesi için 1 mL 1 x tripsin ekleyin ve hücre katmanı dağıttı.</li>
	<li>Hücreleri müstakil kadar geleneksel bir kuluçka 37 ° C'de şişeye kuluçkaya (5-8 dk çoğu hücre hatlarında yeterli).</li>
	<li>Hücreleri müstakil ise mikroskop altında görüntüleyin. Hücreleri müstakil kez 9 mL % 10 ile düzenli kültür ortamının eklemek FBS 1 x tripsin devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>Her iki hemasitometre, hücresiyle saymak coulter-sayaç veya benzer bir. Not: Trypan mavi ölü hücreleri görüntülemek için kullanılabilir. Ancak, 1 x tripsin HaCaT hücreleri vardır mükemmel yuvarlak zaman canlı.</li>
	<li>7.5 x 104 hücreleri/iyi 250 µL % 10 FBS medya 48-iyi doku kültürü yuvarlak popolu plaka (Standart plaka) aktarın. Not: tahlil de ayarlanabilir 6-, 12-, 24-veya hangi optik mikroskop altında denetlesinler 96-şey plakaları.</li>
	<li>Yavaşça plaka yan tarafında hücreleri aynı derecede içinde wells yayılır emin olmak için hareket veya hücreleri kuyuları Merkezi'nde bir araya gelecek. Hücre medyada eşit yayılmış emin olmak için hafif bir mikroskop altında incelemek</li>
	<li>Gecede veya hücreleri kuyu dibine yapıştırılır kadar geleneksel bir CO2 kuluçka 37 ° C'de plaka koymak.</li>
</ol>3. geçiş efektleri için bir çekim gücü eklenmesi
<ol><li>Kuyuları % 90-95 birleşmesi hafif bir mikroskop altında olup olmadığını kontrol edin.</li>
	<li>10 µg/mL mitomycin C orta uygun bir miktarda hazırlamak. Not: Bu çalışmada, Mitomycin C 1 mg/mL, hisse senedi bir çözümde 4 ° C'de tutulur. 2-8 ° C'de karanlıkta bir hafta için Mitomycin C çözüm içinde depolanması</li>
	<li>Pasteur pipet ile harcanan medya her kuyudan çıkarın.</li>
	<li>5 µg/mL mitomycin C de 250 µL her şey için ekleyin.</li>
	<li>2 h 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Peptidler uyaranlara onları Orta uygun bir miktarda sulandrarak hazırlayın. Not: Bu çalışmada, insan ve sığır laktoferrin hem Lactoferricin 25 µg/mL 250 µL hacmine, test edildi</li>
	<li>Mitomycin C ile Pasteur pipet ile orta kaldırın.</li>
	<li>1 x 1 x PBS (Oda sıcaklığında) ve Kaldır yıkama bir Pasteur ile 250 µL ile pipet wells yıkayın.</li>
	<li>1 x PBS 250 µL ekleme ve el ile wells 200 µL pipet ucu ile dikey çizik. Yeni bir pipet ucu her şey için kullanın.</li>
	<li>PBS kaldırın ve 250 µL peptid uyaranlara ekleyin.</li>
	<li>Plaka plaka her iki tarafındaki vidaları ayarlayarak optik kamera sistemi monte. Kapak microtiter plaka üzerinde bırakın. Not: Kameranın açık gerekirse kapak ile çalışabilir.</li>
</ol>4. Program bilgisayarın optik kamera için ayarlama
<ol><li>Al soldaki görev çubuğundaki düğmesini tıklatın.</li>
	<li>Görev çubuğundaki soldaki iyileşmesi işlevi seçin.</li>
	<li>Plaka tipi plaka illüstrasyonaşağı tıklatarak seçin.</li>
	<li>Wells, kullanılmadığı, onları işaretleyerek seçimini kaldırın ve ekranın üst sol tarafında, Etkinleştir ' i tıklatın. Not: Bütün wells varsayılan olarak seçilir.</li>
	<li>Hücrelerin konumunu bir kuyu üzerinde sağ tıklatarak sığdırmak için kuyu objektif odak noktası ayarlayın. Not: Otofokus da plaka illüstrasyon sağında çubuğunu taşıyarak el ile ayarlanabilir.</li>
	<li>Zaman dönemi Resim aralığı altında görüntü için ayarla (Örneğin (00: 30:00)).</li>
	<li>Tekrarı istenen dönem (Örneğin 97 tekrarlar) sığacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Run Başlat düğmesini sağ alt köşesine tıklatarak başlatın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity.">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li><li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+motility:+lessons+from+migration+in+confined+spaces.">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li><li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro.">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization.">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells:+toxicity,+wound+healing,+uptake+and+phagocytosis.">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li><li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells.">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li><li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput,+interactive+imaging,+bright-field+wound+healing+assay.">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>R&#228;s&#228;nen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives,+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign,+not+in+malignant+keratinocytes.">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li><li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation.">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Stamm, A., Reimers, K., Strau&#223;, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+wound+healing+assays+-+state+of+the+art.">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study.">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing.">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li><li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin/lactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein/peptide.">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li><li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+properties+of+lactoferrin.">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li><li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+desmosome.">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li><li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells.">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Geliştirme, yara iyileşmesi, immünoloji ve kanser araştırmaları göç önemi için birkaç farklı yöntem geçiş çalışma yol açmıştır. Geçiş ya da bir ifade genişleme veya boşluk hücreleri tarafından kapatılması olabilir. Bir monolayer hücreleri büyümek ve daha belirli form8hücrelerde büyüyen bir çizik bile yapmak daha kolay olduğu gibi en sık kapatılması çizik, mercek altına alındı. Tekniği Master kolay ve düşük maliyetli olduğu gibi bizim çalışma manuel tırmalamak için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini gösterir. Biz DNA sentezi inhibitörü mitomycin C, yayımlanmış yöntemleri18ve yüksek üretilen iş çalışmaları sağlayan bir optik kamera kullanımı ile karşılaştırıldığında çizik optimize etmek için ilave bir yıkama tanıttı.
Vitro sıfırdan tahlil düzgün kuyuları köküne bağlar bir yapisan hücre kültürünü gerektirir ve geçiş üzerinde bir çizik bile algılamak için nükleer silahların yayılmasına karşı inhibe olabilir gerekiyor. Bu iki özellik tahlil için gereklidir. Gerçek geçiş algılamak için birkaç yaklaşım14, DMSO veya çeşitli inhibitörleri 13,27tırmalamak önce hücre açlıktan serum konsantrasyonu düşürücü tarif edilmistir. Genel olarak, serum-ücretsiz medya-ebilmek var olmak kullanılmış, ancak, bazı birincil hücre hatları, taşıma ve genel sağkalım ihtiyaç serum gibi satırları hücre. Bu nedenle, hücre kültürünü göre seçim yapılmalıdır. Manuel çizikler kaplama rahatsız etmeyecek gibi kaplama gerektiren hücre hatları bu tahlil, sorunlu olabilir de.
Farklı hücre türleri farklı konfluent monolayer bağlı olarak onların boyutu ve büyüme oranı oluşturmak için hücre sayısı gerektirir. HaCaT hücreleri yaklaşık 4-6 h sonra uygun ama gece dengeli monolayer yapmak için yerleşmek için yaptı. Kazı-kazan tahlil önemli dezavantajları biridir düzensiz çizikler8. Bu çalışmada, PBS ile ön yıkama ve çizik içinde yeni PBS yapma birikimleri çizik kenarları boyunca yaralı ve hasarlı hücrelerinin azaltmak göster. Bu tanıdıklarını cilt hücrelerinde bağlanma desmosomes kavşağı tarafından açıklanabilir. Kavşak Ca2 +vardır-bağımlı24 ve PBS, kullanarak hangi güçlü hücre-hücre adezyon zayıflatabilir özellikler kaldırılır. Böylece, PBS kullanımı hücrelerin daha iyi temizleme tek tek hücreler yara kenarı boyunca daha az birikimi önde gelen izin verebilir. Ayrıca, optik kamera Wells, her plaka geniş bir kısım önlemler ve bents, üç adım algoritma üzerinden çizik içinde uyum sağlar. Böylece, ön yıkama PBS ile ve optik kamera kullanarak, el ile çizikler dezavantajları ortadan kalkar. Z-görüntülerin istifleme, daha doğrusu, hücreleri üzerinde odaklama yapar ama büyümeye bağlı olarak ne kadar farklı hücre tipleri, odağı bir sorun olabilir. Hücreleri çok fazla genişlerse, fotoğraf makinesinin odak odak out gelen odak kayacak. Böylece, Mitomycin C kullanılırsa, deneysel kurulumunuzu daha 24 h çalıştırırsanız biraz daha yüksek odak ayarlamak için yararlı olabilir. Optik kamera microtiter tabak tabak üzerinden 6 - 96-iyi ölçebilirsiniz sezgisel bir yazılım ile standart bir bilgisayar aracılığıyla işletilen kolay bir kurulumu vardır ve bu nedenle çeşitli test set-up sağlar. Alınması gereken görüntü sayısını seçerken, bazı sınırlamalar vardır. 96-şey plaka kullandıysanız, bir elde edebilirsiniz resimler sadece sınırlı veri kümeleri gibi bilgisayarında yer büyük hale gelebilir ve fotoğraf makinesinin hızı tarafından sayıdır. Hızlı bir şekilde çok sayıda resim gerekirse, her inceden inceye gözden geçirmek için zaman ihtiyacı olduğu kamera hareketi kısıtlayıcı bir faktör olabilir de.
Optik sistem basit ama güçlü izleme sağlar. Çizik resimleri boşluğu kapatma işlemi açısından incelenir ama hücreleri morfolojik karakterizasyonu için de kullanılabilir. Yazılımı hücreleri sarı işaretler ve arka plan rengi gri ham görüntüleri belli ki bu Örneğin yayınlar için gerekli mevcuttur rağmen yara kenarına daha iyi görmek için standart bir özellik olarak değiştirmez. HaCaT hücreleri içinde dinamik sayfa28ortaya geçiş yapan güçlü hücre-hücre etkileşime sahip olabilirsiniz. Bu özellik, lamellipodia geçirme hücre zaman (Şekil 4) görmek kolaylaştırır.
Bu çalışmada laktoferrin proteinlerin etkisi ve Lactoferricin ve EGF pozitif kontrol olarak türetilmiş N-terminal peptidler gösterir, ancak farklı ilaçlar, peptidler/proteinler ve kombinasyonları, inhibitörleri veya uyarıcılar olarak test etmek için değiştirilmiş olabilir yara iyileşmesi. Kazı-kazan tahlil değişmiş ve çeşitli hücre hatları ve geçiş etkileyebilir bileşikler uyacak şekilde en iyi duruma getirilmiş. Birlikte, düşük maliyetli ve kolay yönetilebilirlik ile bu tahlil çoğu laboratuarlar için çok uygundur. Optik kamera farklı ilaçlar, inhibitörleri veya uyarıcılar geçiş, aynı zamanda nükleer silahların yayılmasına karşı test etmek için kullanılabilir.

Geçiş birçok fizyolojik açıdan etkileyen önemli bir süreçtir. Yara iyileşmesinde, geçiş cildin yeniden epithelization kolaylaştırır. Kronik yaralar gibi Sigara şifa yaralar fırsatçı bakteriler yara enfeksiyonu neden ve açık yaralar bakteri büyüme ve biyofilm1,2oluşumu için idealdir. Biyofilm dirençli bakterilerin gelişimi nedenleri biri bizim modern toplumun3için en büyük tehdit olan biridir. Yara iyileşmesinde, bağışıklık hücreleri biyofilm aşamıyor. Kanser, kanser hücrelerinin geçiş metastaz, çok önemli bir adım olan ölüm solid tümör4,5olan hastalar için birincil nedeni olmasıdır. Bu nedenle, geçiş çalışma çok önemlidir.
Kazı-kazan tahlil kez çünkü ucuz ve kolay, fibroblast, endotel ve epitel hücre hatları6,7gibi yapışık hücre satırları üzerinde gerçekleştirmek için hücre göç sınamak için kullanılır. Bugün, çizikler8gerçekleştirmek için birkaç yöntem var ve farklı malzemeler kullanılmak üzere, kürdan9, hücre Kazıma aletleri10, lazerler11ve elektrik akımları12de dahil olmak üzere bildirilmiştir. Tüm yöntemleri farklı artıları ve eksileri var ve yöntem üzerine hücre türü, bütçe ve analiz aracına göre karar vermesi gerektiğini. Örnek olarak, kullanılan hücre tipi, el ile basınç kaldırma, kaplama gerektiriyorsa, Örneğin bir kürdan veya pipet ucu ile geçiş alanı içinde etkisi, farklı bir yöntem kullanılmalıdır. Bu çalışmada, el ile kazıma üzerinde durulacak.
El ile kazıma için bir zararı olmaz bu çizikler şekilleri ve çizik kenarlarında hücre birikimi, boyutu varyasyonu. Birçok protokoller bulunmaktadır ve hızlı artış ve/veya13çizilmemesi sonra ayrıntılı çamaşır yüksek atıf kağıt tavsiye eder. Buna ek olarak, hücrelerin çoğalması göç--dan ayırt edici olamaz ve bu nedenle yanlış pozitif sonuçlar göç verebilir beri yayılması, en aza indirmek için birkaç yöntem kullanılmıştır. Bazı yöntemler sıfırdan14 önceki ve serum15miktarı azalan serum açlık bildirilir. Ancak, bu yöntemlerin ikisi de hiçbir nükleer silahların yayılmasına karşı olduğundan emin olabilirsiniz. Bu nedenle, biz ön arıtma göç doğru sonuçlar sağlamak için mitomycin C içeren hücrelerin raporu. Mitomycin C DNA16ayıran engeller DNA ile kovalent bağ oluşturarak DNA sentezini engeller bir antibiyotiktir. Mitomycin C ile önceden tedavi ve çizilmemesi önce PBS ile yıkama, Gap algılanan kapatılması (Şekil 1) hücrelerinin doğru geçiş gösteriyor.
Tüm yöntemleri geçiş17süreci analiz etmek bir sistemi için ihtiyaç özelliğidir. Ortak bir ilerleme çözümlemek için ucuz bir yöntem ise bir görüntü yazılımı18,19boşluğu kapatılması bir analizini ve ardından önceden belirlenmiş zaman noktalarda çizik görüntülerini çekmek için ışık alan mikroskop kullanmak için. Bu yöntem zaman alan, aynı yerde ve odak fotoğraf çekmek açısından güvenilmez ve resimlerin çekildiği ise sıcaklık değişiklikleri döngüleri kuluçka hareketinden kamera için zorlar. Diğer yöntemler mevcut akışını ölçerek geçiş algılamak için geliştirilmiştir. Geçerli değişiklikleri hücreler olarak empedans20artış olarak okumak plaka üzerinde daha fazla yer kapsamaktadır. Empedans ölçüm, çevrenin hücrelerin etkilenmez ve yöntemi bu nedenle non-invaziv olarak kabul edilir. Bu yöntem pahalı, altın elektrotlar ile özel plakaları kullanır ama onlar hücresel bağlılık, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve hücre ölümü gibi birçok işlemlerin algılanmasını sağlar. Sıcaklık gibi faktörler empedansı üzerinde büyük bir etkiye sahip olarak empedans ölçüm doğrudan geçiş, göstermez bu yöntemin bir engel olduğunu. Empedans değişimler veri analizi daha zor hale yazılım tarafından incelenir değil çeşitli faktörler neden olabilir. Bu nedenle, görselleştirme eksikliği geçiş doğrulamak için geleneksel bir ışık mikroskobu gerektirir.
Birçok kullanılabilir teknikleri downsides üstesinden gelmek için gerçek zamanlı otomatik optik kamera kullanın. Optik kamera küçük bir platformda bir lens, aydınlatma ünitesi ve bir dijital fotoğraf makinesi ile yüksek-den geçerek mikroskop ile algılama sistemidir. Göç ve diğer şeyler arasında nükleer silahların yayılmasına karşı test edebilirsiniz bir yerleşik yazılım vardır. Geçiş algılamak için iki algoritmaları büyüme ve hücrelerin çoğalması ve analizi, sırasıyla şifa yara adı verilen geçiş kinetik çözümlemek için kullanılır. Doku analizi (sarı renkle gösterilmiştir) cep kaplı alanlar arasındaki farkı bulmak için geçerlidir bir iki aşamalı görüntü segmentasyonu algoritma dayalı ve boş yayılması analizi arka plan alanları göre gelişmiş çubuk grafik analiz. Analiz şifa yara hücre monolayer algılar, yara boşluk bulur ve boşluk genişliğini belirler bir üç adım algoritmasına dayanan. Aşağıdaki adımları Kullanıcı tarafından belirlenen saat-noktalarda yapıldığı ve verileri kapalı alan, boşluk genişliği ve gap alanı sunulur. Bu makine büyük avantajlarından biri21kamera açısı yüzünden sıvı ile yapışık hücreleri görüntüleme sağlar olduğunu. Resimleri odak noktası (Şekil 2) olduğundan emin olmak için bir z-yığını için tek bir z uçağı öngörülen kamera hareket ettirildiğinde lenstakes görüntüler oluşturmak. z-yığınlar yara kenarına ve tüm yara arasında dikey çekilen fotoğraflar (Örneğin 40) dizi birleştirme tarafından oluşturulur. Z-yığınlar hücre katmanı hem de bir odakta uçak derinliği yara yakalama sağlar. Ayrıca, resimleri dizi görüntüleri, video koleksiyonuna bir düğmeyi tıklamak ile birlikte konabilir.
Biz algılanması HaCaT keratinosit hücre doğrultusunda geçiş için en iyi duruma getirilmiş bir protokol göstermek. Laktoferrin ve onun N-terminal peptid, Lactoferricin, insanlar ve inekler, bu moleküller çok sayıda uygulama antimikrobiyal ve bağışıklık molekülleri22 oransal için gösterildiği şekilde geçiş üzerindeki etkileri analiz etmek için test , 23. dört bileşikler tedavi edilmezse HaCaT hücrelere karşılaştırıldı ve epidermal büyüme faktörü (EGF) olumlu bir denetim olarak kullanıldı.

<table><tbody><tr><td>oCelloScope</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>Optical camera</td></tr><tr><td>UniExplorer software&amp;nbsp;</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>(8.0.0.7144 (RL3))</td></tr><tr><td>HaCaT cell</td><td></td><td></td><td>Donated from Bispebjerg Hospital</td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>Medium for HaCaT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Fetal bovine serum</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>D837</td><td>Without Mg+ and Ca2+</td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Trypsin (10x)</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Tocris</td><td>3258</td><td>Inhibits proliferation</td></tr><tr><td>Microtiter plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>677 180</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td></td><td>37&amp;deg;C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Assistent</td><td></td><td>T&amp;uuml;rk (0.1 mm)</td></tr><tr><td>Pipet boy</td><td>Accu-Jet pro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

Hücre göç sağlık, yara iyileşmesi ve kanser, gibi birçok yönünü etkileyen önemli bir süreçtir ve bu, bu nedenle, geçiş çalışma yöntemleri geliştirmek için çok önemlidir. Kazı-kazan tahlil uzun bileşikler ile anti ve pro migration özellikleri nedeniyle, düşük maliyetli ve basit yordamı sınamak için en yaygın vitro yöntemi olmuştur. Ancak, bir sık rapor tahlil hücreleri birikimi sıfırdan kenar boyunca bir sorundur. Ayrıca, tahlil verileri elde etmek için farklı pozlama görüntüleri bir süre içinde tam olarak aynı noktada göç hareketleri karşılaştırmak için alınması gerekir. Farklı analiz programları sıfırdan kapatılması tanımlamak için kullanılan, ancak emek yoğun, yanlış ve kuvvetleri döngüleri sıcaklık değişiklikleri. Bu çalışmada, geçiş etkisi, Örneğin doğal olarak meydana gelen proteinler insan ve sığır Laktoferrin ile ve epitel hücre satırındaki HaCaT onların N-terminal peptid Lactoferricin test etmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi göstermektedir. Çok önemli bir optimizasyon yıkayın ve söz konusu birikimi hücre kenarı boyunca ortadan kaldırır PBS sıfırdan etmektir. Bu özellikler, keratinosit hücre-hücre bağlantısı üzerinde etkisi olduğu gösterilmiştir kaldırma tarafından açıklanabilir. Geçiş doğru tespiti sağlamaktır, mitomycin C, DNA sentezi inhibitörü ile önceden tedavi protokolü için eklendi. Son olarak, aşırı sıcaklık döngüleri, ortadan kaldıran otomatik optik kamera, el emeği ile sıfırdan kapatma analizi, tekrarlanabilirlik üzerinde iyileştirilmesi ve zamanla çizik aynı bölümden analiz sağlanması sırasında göstermek.

HaCaT keratinosit hücre, deride en bol bulunan hücre türlerinden biri olan bir. Bir yara ortaya çıktığında, cilt hücrelerini çoğalırlar ve üzerinde yara (Şekil 3) kapatmak için yara yatağına geçirmek başlatın. Her iki süreç vardır, bu nedenle, uygun şifa için son derece önemlidir.
Optik kamera her iki süreç gerçek zamanlı olarak takip edebilirsiniz. Geçiş için sistemi üç veri kümeleri verir: hücre kapalı alan, boşluk genişliği ve gap alanı. Çizikler izleme Lactoferrin, Lactoferricin veya EGF ile tedavi ederken, optik mikroskop zamanla bu üç parametreleri izlemek için bize izin verir. 48 h kuluçka sonra biz EGF tedavi edilmezse denetimi (Şekil 3A) % 38 kapatmaya göre yara, % 95 kapatılması sonuçlandı görmekteyiz. Laktoferrin ve Lactoferricin farklı sürümleri ile üst proteinler daha güçlü olmak peptidler % 33 ve % 62 yara kapatma arasında yerleştirilir. Yara kapatma, boşluk genişliği ilk sıfırdan değişikliklerden belirlenen yüzdesi de olabilir (Şekil 3B) çizilen.
HaCaT hücrelerin güçlü hücre-hücre etkileşim ve hücreleri'e geçiş yaparken, gerekli24dizi adımı vardır. Kısa bir süre, önde gelen hücrelerin yapıştırılması sitelerinde bozacak, çıkıntı ve25taşımak için sitoiskeleti sözleşme. Önde gelen hücrelerin çıkıntı optik kamera (Şekil 4) ile kolayca görülebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig1.jpg"> Resim 1 : Geçiş bir optik kamera test etmek için sıfırdan testin şematik akış çizelgesi. HaCaT hücreleri 48-şey plaka üzerinde kaplama ve 24 saat bağlı kalmak için izin verdi. Hücreleri mitomycin C için nükleer silahların yayılmasına karşı etkisizleştirmek 2 h ile önceden kabul edilir ve sıfırdan yapılır ve buna ek olarak peptid uyaranlara tarafından takip. Plaka optik kamera birimi eklenir ve geçiş için 48 saat gelir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig2.jpg"> Resim 2 : Optik kamera tarama teknolojisi. Otomatik optik kamera optik lens birimi yatay düzlemde bakteriyel ve hücresel çözümleri gibi çeşitli çözümler yoluyla taranmasını sağlamak için 6.25 ° açılı. Görüntü yığınları bütün odaklanır, odak ve odaktaki, hücreleri odaktaki görüntülerle sağlamak için alınan dizi resmi içerir. 26değiştiren.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig3.jpg"> Şekil 3 : Geçiş 48 saat önceden tedavi mitomycin C HaCaT hücrenin. (A) geçiş 48 saat için her yarım saatte otomatik optik kamera tespit edildi. Hücreleri ile mitomycin C-nükleer silahların yayılmasına karşı etkisizleştirmek için önceden kabul edilir. Hücreleri 25 µg/mL ile insana ilişkin - veya sığır-Lactoferrin (H-Eğer veya B-Eğer) veya - Lactoferricin (H-LFcin, B-LFcin) kabul edilir. Epitelyal büyüme faktörü (EGF) 500 ng/mL, pozitif kontrol olarak kullanılır. Tedavi edilmemiş HaCaT hücreler bir denetim olarak kullanılır. (B) geçiş tedavi grafik resmini. Üç bağımsız çalışan temsilcileri sonuçlarıdır ve sonuçları ilk sıfırdan yüzde kapatma olarak verilen * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig4.jpg"> Şekil 4 : Lamellipodia, çıkıntılı HaCaT hücreleri tedavi. Lamellipodia HaCaT hücre siyah oklarla işaretlenmiş. Onlar göç ve zaman içinde kolayca görülebilir HaCaT güçlü hücre-hücre etkileşiminin hücrelerin dinamik hareket sonuçlanır.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.

Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

22.9K Görüntüleme.  Roskilde University. Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.

Video: Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Kanser Araştırmaları

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Gelişim Biyolojisi

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

Vitro Cilt hücre göç arsenik etkilerini göstermek için tahlil kaşı

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Çevre

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Tıp

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biyoloji

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

T-Hücresi Kinetiğinin Aydınlatılması: Gerçek Zamanlı Migrasyon Analizi Yöntemleri

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

Yazar Spotlight: T Hücresi Göçünün Gerçek Zamanlı Analizi ile Hastalık Mekanizmalarını Anlamak

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Vitro Cilt hücre göç arsenik etkilerini göstermek için tahlil kaşı

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi