Makalemizin ana katkısı, MALDI görüntüleme kitle spektrometresi görüntüleme teknolojisi ile Alzheimer hastalığı beyninin amiloid beta patolojisinin kesin ve ince bir manzarasını incelemiş olmamızdır. Doku slaytlarının formik asit ön tedavisi ile özel bir protokol oluşturarak teknolojik gelişmelere ulaştık. MALDI-IMS'den sonra segmentasyon haritaları oluşturulur ve plak ve subaraknoid vaskülatür ile birlikte lokalize yeni marker proteinleri veya peptidleri keşfetmek için hesaplamalar yapılır.
Ölümden sonra sekiz saat içinde eksi 80 derecede çıkarılan, işlenen ve depolanan beyinlerden IMS için insan kortikal örnekleri alın. AD hastalarının oksipital korteksve yaş uyumlu kontrollerden beyin örneğini alın. Bir kriyostat üzerinde doku bölümleri kesmek için, ilk gıyonluk içinde iletken indiyum tin oksit veya ITO kaplı mikroskop cam slaytlar yerleştirin.
Otopsi beyin örneğini eksi 80 santigrat dereceden kriyostat içinde eksi 22 santigrat dereceye ısıtın. Her deney için kriyostat'a yeni bir tek kullanımlık bıçak takın. Her zaman bıçağın temiz bir parçasını kullanmaya çalışın.
Dondurulmuş otopsi beyinlerini az miktarda optimum kesme sıcaklığı bileşimiyle birlikte sahneye koyun. IMS ve immünohistokimya için, her doku örneğinden beş ila altı bölüm kesti. Bıçak dokuyu kesmeye başladığında, tekerleği çevirin ve tüm doku açığa çıkana kadar bloğa dönün.
Bölümde küçük bir çizgi veya yırtık varsa, sıcaklık ayarı otomatik olarak düzeltene kadar kriyostat'ta bekleyin. Anti-roll'u altında bir doku yla açmadan önce birkaç saniye sayın. Doku dilimini hemen cam kaydıranın İTO kaplı tarafına yerleştirin.
ITO kaplamalı olmayan tarafta ki kaydırağın altına bir parmak koyarak doku dilimini eritin. Doku slayta yapışacak. Hiçbir kırışıklık ları ile doku mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun.
Doku bölümlerini durulamak için, endojen lipidleri ve inorganik tuzları çıkarmak için numuneleri cam boyama kavanozuna 30 saniye boyunca %70 etanol mililitreye batırın. Metin protokolünde listelenen yıkama sırasını kullanarak örnekleri yıkayın. Daha sonra numuneleri 30 dakika vakumla kurulayın.
Şimdi, otopsi beyin dokusundan amiloid beta proteinlerinin daha iyi iyonizasyonu için doku bölümlerini formik asit buharı ile tedavi edin. Bunu yapmak için, 60 santigrat derece fırın ve% 100 formik asit beş mililitre ile bir kuluçka cam çanak hazırlayın. Hava nemini kuluçka cam çanağı doygunluk seviyesinde tutun.
Formik asit daldırma önlemek ve altı dakika tedavi ederken kuluçka cam çanak doku slaytlar yerleştirin. Film tarayıcısı, jel tarayıcı veya dijital mikroskop kullanarak örneklerin optik görüntüsünü alın. Bu adımı oda sıcaklığında gerçekleştirin.
Numune hedefi cihazın içine yerleştirildiğinde numunelerin optik görüntüsünün hizalanması gereklidir. Genellikle, matris tabakasının altındaki doku bölümünü tanımak mümkün olmayacaktır. Optik görüntüleri örneklerle ilişkilendirmek için, hem optik görüntüde hem de kamera optikindeki matris katmanının altında görünen kılavuz işaretleri yapın.
En kolay yolu optik görüntü almadan önce örnek etrafında en az üç düzeltme sıvı sıyrık işaretleri nokta etmektir. Bir ultrasonik püskürtücü ile matris sprey için, desiccator püskürtülür ve odasına yerleştirin doku çıkarın. Dokunun sensör penceresini kaplamadığından emin olun.
Başlat düğmesine basarak hazırlık başlatın. Genellikle hazırlık süresi 90 dakika civarındadır. Hazırlık matris tabakası kalınlığı ve ıslaklık izlenmesi ile otomatik olarak düzenlenir.
Alternatif olarak, matris çözeltisini otomatik püskürtücü ile doku yüzeyine püskürtmek için, matris çözeltisini teslim etmek için dakikada 10 psi ve 0,15 mililitre olarak ayarlanmış bir çözücü pompa sistemi kullanın. Isıtılan kılıf gazının sabit bir akışı matris çözeltisi spreyi ile birlikte teslim edilecektir. MALDI-IMS ile yüksek iş yapma ve yüksek mekansal çözünürlükte görüntüleme deneyleri yapın.
Kütle spektrometresi ölçümü için MALDI kontrol yazılımı ve veri analiz yazılımını kullanarak doku alanlarını tanımlayın. 2, 000-20, 000 ve 20 ve 100 mikron uzamsal çözünürlüğe sahip pozitif doğrusal modda spektrum elde edin. Kalibrasyon standardını sağlamak için, peptit kalibrasyon standardını ve protein kalibrasyon standardını CHCA ve TA30 çözeltisi ile 1-4 oranında çözünve 10 kez seyreltin.
Dört farklı konuma slaytüzerinde kalibrasyon standardı bir mikrolitre yerleştirin. Moleküler histoloji yazılımı kullanarak, senil plaklar ve arteriyel duvarlarda kolokalize farklı amiloid beta peptidler gibi çeşitli sinyallerin mekansal korelasyon bulmak için birden fazla sinyal görüntüleri bindirme. Bu çalışmada üç numaralı hastanın serebral amiloid anjiyopatisi veya CAA fenotipleri en belirgin olarak görüldü.
Bu hastanın beyin dokusunun MALDI-IMS açıkça amiloid beta 1-42 ve amiloid beta 1-43 tercihen serebral parankim de senile plaklar olarak yatırıldı görselleştirilmiş. Buna karşılık, amiloid beta 1-36-1-41 gibi kısa amiloid betalar tercihen leptomeningeal vasküler alanlarda birikti. Patolojik olmayan kontrolde önemli bir sinyal yoktu.
Amiloid beta 1-40 ve amiloid beta 1-42 dağılımları dokuların komşu dondurulmuş bölümleri kullanılarak immünohistokimya ile doğrulandı. Anti-amiloid beta 1-40 antikor CAA etiketli ve ortaya amiloid beta 1-40 tercihen leptomeningeal kan damarlarında yatırılır, hangi senil plaklar olarak serebral parenkim amiloid beta 1-42 dağılımı açık kontrast. Burada gösterilen bir segmentasyon haritası hasta üç numaralı aynı bölüme uygulanan bir bisecting k-ortalama analizi ile elde edilir.
Bu kümeleme yöntemi, subaraknoid alanda parankim ve vasküler yapılarda plak benzeri yapıları başarıyla tanımlayabilmiştir. Bu parankim sadece parankim küçük bir arteriyol etrafında tespit edilir parankim küçük bir dairesel alan bulmak için ilginç yanı sıra subaraknoid alanda. Bu bireysel amiloid beta peptidlerin tek iyon görüntüleri ile doğrulanır.
Belirli antikorlar kullanıyor olsa bile aynı anda amiloid betas geniş bir yelpazede izlemek için bir sınırı vardır. Burada, son teknoloji MALDI görüntüleme kütle spektrometresi yöntemini kullanarak insan beyninde amiloid beta dağılımını gösteriyoruz. Bu rapor insan otopsi beyinlerinde amiloid beta proteinlerinin tam set karakterizasyonu sunuyor, çünkü bu katkı Alzheimer hastalığı araştırma atılım yapar inanıyoruz.
En etkileyici bulgu, amiloid beta proteininin C terminalinde sadece tek bir amino asit değişiminin dağılımlarında köklü bir değişiklik yaptığıdır. Doku hazırlama adımları insan beyin dokusunda toplanan proteinlerin etkili bir iyonizasyon elde etmek için önemlidir. Yüksek duyarlılık ve artifakız görüntüleme için çok önemli matrisler ile analithomojen cocrystallization.
