Name: detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages at JoVE.com

Tüm mikroskobu W. M. Keck mikroskobu merkezi Nathaniel Peters desteği ile ve NIH Ödülü S10OD016240 desteğiyle yapıldı. S.L.F. NIH K08AI119142 ve R21AI130281 tarafından desteklenir. Biz Dr Richard Flavell ve Dr. Brad Cookson caspase-1/11 eksik fareler için ve Dr. Brad Cookson laboratuvar tesisler ve ekipman paylaştığınız için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan yordamlar onaylanmış ve University of Washington kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi kuralları altında yürütülen.
1. kemik iliği hasat
<ol><li>Aseptik femur ve tibia bir fareden çıkarın ve steril aletlerin kullanma kemikleri temizleyin. Temizlenmiş kemikleri Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-glutamin + 0,05 mM 2-mercaptoethanol + 50 mg/mL Gentamisin sülfat + 10.000 U/mL penisilin/streptomisin + % 10 fetal Sığır serum (FBS, DMEM-10 tam) yerleştirin ve kuluçkaya 15 dakika buzda tüp.</li>
	<li>Makas kullanarak proksimal ve distal topu eklemler kaldırın. Kemikleri hollow orta ile dolu bir 10 mL şırınga bağlı 25 G iğne yerleştirin. Kemik iliği DMEM-10 tam kullanarak floş. Herhangi bir kümeleri yukarı ve aşağı yavaşça orta pipetting tarafından resuspend.</li>
	<li>Hücreler için 300 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Bu noktada, %90 FBS + % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) kullanarak hücreleri dondurmak veya 15 cm Petri kabına şartına L929 Orta (adım 2.1) kullanarak makrofajlar ayırt etmek için hücrelerde plaka.</li>
</ol>2. kemik iliği türevi makrofajlar farklılaşma
<ol><li>Önceden ısıtılmış farklılaşma Orta (DMEM-10 tam 21 mL ve Swanson vd tarafından açıklandığı gibi L929 koşullanmış hücrenin orta 9 mL kullanarak 18), kemik iliği hücreleri bir 15 cm koymak olmayan doku kültürü tedavi Petri kabına (1.2-1.5 x 107 hücreleri). 37 ° C ve % 5 CO2 plaka için 7 gün kuluçkaya. Ek bir 30 mL farklılaşma orta günde 3 ya da 4 plaka ekleyin. Not: makrofajlar ayırmak ve hasat zor olacak gibi bu doku kültürü tedavi kaplamalar, kullanmak önemlidir.</li>
	<li>Makrofajlar toplamak için fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile tabak yıkama ve 20 mL soğuk PBS + 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin. PBS + EDTA hücrenin üzerine pipetting hücreleri plaka 10 dk. hasat için 4 ° C'de kuluçkaya ve PBS 10 mL Tabağını yıka. Her iki birleştirme iki 15 mL konik tüpler içine yıkar.</li>
	<li>300 x g 10 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi ve fenol kırmızısı ücretsiz DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-glutamin + 0,05 mM 2-mercaptoethanol + %5 10 mL hücrelerde resuspend FBS (DMEM-5) ve bir hemasitometre ya da bir Coulter sayaç kullanarak hücreleri saymak. Sayım sırasında hücreler buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Makrofajlar doku kültürü kaplı levha 2 x 105 hücre/mL, içinde tohum. Mikroskopi deneyler için 1 mL 24 iyi plakaları coverslips sayfasında bulunan bir hücreler tohum. Karaciğer yayın deneyleri için 96 iyi plaka hücrelerinin 100 µL tohum. Karaciğer tahlil için 9 wells (3 kuyu tedavi edilmezse, % 100 lizis kontrolleri ile 3 kuyu ve 3 kuyular için deneysel uyarıcı) tohum.</li>
	<li>Santrifüj 96 iyi plaka hücreleri belirli yapmak için 300 x g de 5 min için eşit derecede iyi arasında dağıtılmış.</li>
	<li>Gece saat 37 ° C + %5 CO2 plaka astar işlemine başlamadan önce kuluçkaya.</li>
</ol>3. astar
<ol><li>100 ng/mL LPS (500 μL de plaka 24 veya 50 μL de plaka 96) içeren orta taze Orta (DMEM-5) ile değiştirin. Not: TLR4-aracılı astar19uyarmak için yeteneği etkileyen LPS yapısal değişimler çeşitli vardır. LPS Salmonella minnesota R595 üzerinden (Re) birden çok satıcı mevcuttur ve tavsiye edilir.</li>
	<li>3 h 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.</li>
</ol>4. harekete geçirmek-in Nigericin ile NLRP3 Inflammasome ve FAM-YVAD-FMK ile etiketleme
<ol><li>Orta kaldırın ve DMEM-5 5 mikron nigericin ve 5 mM glisin içeren 290 μL ile değiştirin. Glisin caspase-1 harekete geçirmek5sırasında oluşur hücre lizis azaltmak için eklenir. 60 dk 37 ° C ve % 5 CO2için kuluçkaya. Vahşi türü ve caspase-1 eksik makrofajlar gözlenen etiketleme caspase-1 için belirli olduğundan emin olmak için kullanın.</li>
	<li>Son 45 dakika 30 10 μL eklemek x FAM-YVAD-FMK, üreticinin yönergelerine göre hazırlanmış.</li>
	<li>60 dk sonra orta kaldırmak ve hücreleri 5 dk her ile 1 mL soğuk PBS için üç kez yıkayın.</li>
	<li>Her şey için % 2 paraformaldehyde 250 μL ekleyin ve 30 dk için alüminyum folyo ile kaplı buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Son 5 dk çekirdeklerin etiketlemek için 0.2 mM far-red floresan nükleik asit leke 4 μL ekleyin. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) veya diğer boyalar da etiket DNA için kullanılabilir.</li>
	<li>Hücreleri üç kez 1 mL soğuk PBS ile yıkama ve coverslips 7 μL Anti-fade montaj orta kullanma mikroskop slaytlar üzerine monte. Montaj orta coverslip tırnak cilası kullanma mikroskop slayt için sızdırmazlık önce gece sertleşmesine izin.</li>
	<li>Makrofajlar tarafından confocal mikroskopi olabilir görüntü. EX / Em FAM-YVAD-FMK için 492/520nm ve 642/661 far-red floresan nükleik asit leke için. Mikroskobu tedavi edilmezse hücreleri herhangi bir arka plan 488 kanalda boyama gösterme gibi ayarlamak emin olun. Aksi durumda, arka plan FAM-YVAD-FMK boyama tespit ve gerçek değil active caspase-1 olur. Not: Mikroskop set-up 6 bölümünde anlatılan.</li>
</ol>5. antikor boyama
Not: ASC algılamak için antikorlar hücrelerle etiketlemek için tohum, Başbakan ve nigericin önceki bölüme aynı hücrelere ortaya çıkarmak. İşleme daha sonra aşağıdaki gibidir:
<ol><li>Hücreleri 5 dk her ile 1 mL soğuk PBS için üç kez yıkayın. 250 μL fiksasyon ve permeabilization çözüm ekleyin. Hücreler buz üzerinde kuluçkaya ve 30 dk için kapalı.</li>
	<li>Üç kez 5 min için her 1 mL ile yıkama arabelleği makrofajlar yıkayın.</li>
	<li>ASC karşı birincil antikor 250 μL 1:500 yıkama arabelleği seyreltilmiş ekleyin ve buz üzerinde 1 h için kuluçkaya. Birincil herhangi bir antikor almaz, ancak yalnızca ikincil alacaksınız bir coverslip içerir. Bu coverslip mikroskop Kur sırasında doğru uzaklığı ayarlamak için kullanılır.</li>
	<li>Hücreleri ile 1 mL yıkama arabellek her 5 min için üç kez yıkayın.</li>
	<li>İkincil antikor (floresan boya konjuge keçi-anti-fare) 250 μL 1:500 yıkama arabelleği seyreltilmiş ve buz üzerinde 1 h için kuluçkaya ekleyin. Bu kuluçka son 5 min için 0.2 mM far-red floresan nükleik asit leke 4 μL etiket çekirdekler için ekleyin.</li>
	<li>3 hücreleri yıkama x 1 mL soğuk yıkama arabellek ve coverslips mikroskop üzerine slaytlar 7 μL Anti-fade montaj orta kullanarak bağlama ile. Coverslip açık oje kullanma mikroskop slayt için sızdırmazlık önce gece sertleşmesine montaj orta izin.</li>
	<li>Görüntü makrofajlar tarafından confocal mikroskobu. EX / Em ikincil antikor için 555/580 nm ve 642/661 far-red floresan nükleik asit leke (aşağıda açıklandığı gibi). Not: FAM-YVAD-FMK ve antikor etiketleme ile etiketleme Co yerelleştirilmesini etkin caspase-1 ve ASC göstermek için birleştirilebilir. Bunun için FAM-YVAD-FMK etiketleme için koşulları izleyin ve sonra daha fazla işlem için protokol etiketleme antikor geçin.</li>
</ol>6. Confocal mikroskobu tarafından etiketli makrofajlar görüntüleme
Not: coverslips gecede tedavi ve tırnak cilası ile mikroskop slayt mühürlü izin sonra lekeli hücreleri görülebilir. Burada, görüntüleme confocal mikroskop kullanılarak açıklanmıştır. Hücreleri de standart floresan mikroskopi tarafından görüntülenebilir.
<ol><li>Tedavi edilmemiş kontrol hücreleri içeren slaydı mikroskop sahnesinde yerini ve hücreleri mikroskobunun odaklan.</li>
	<li>Orada öyle ki hiçbir olumlu FAM-YVAD-FMK tedavi edilmezse hücrelerde boyama mikroskop bakmak kadar tablo (LUT) ayarları kullanarak, uzaklık ayarlayın. Bu işlem caspase-1 eksik makrofajlar kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Not: Uzaklık deneyde kullanılan her kanal için ayarlanması gerekir, ama doğru uzaklık ayarı FAM-YVAD-FMK kanal ve floresan antikor kanalları için en kritik. DNA kanal kenardan uzaklığı daha az önemlidir. Mahsup hesabı ayarladığınızda, bu ayarı deneme boyunca ayarlamak değil.</li>
	<li>Slayt geçiş yapmak için tedavi nigericin örnek. Pozitif ve negatif FAM-YVAD-FMK boyama için her iki hücre içeren bir alan bulun. Pozitif boyama en yüksek şiddeti vardır uçağa FAM-YVAD-FMK kanal görüntüleme uçak ayarlayın. Bu normalde inflammasome odak merkezi nerede görüntüsü uçak olacak.</li>
	<li>Öyle ki Foci yoğun çekirdeği olan hücrelerde görülebilir kazanç ayarlayın. Kazanç ve mahsup hesabı ayarladıktan sonra görüntüleme oturumun geri kalanı için bu ayarları bırakın. Not: bir hücre pyroptotic olup olmadığını belirlemek için bir kolay yolu nükleer morfoloji arıyor. Active caspase-1 içeren hücreleri yuvarlak ve yoğun çekirdeği nükleulus hücreleri caspase-1 harekete geçirmek ve nükleer morfoloji olmadan görünür iken, tedavi edilmemiş hücreleri benzer.</li>
	<li>Görüntü 100 X toplam büyütme 5 rasgele seçilen alan toplamak. Bu normalde görüntü başına yaklaşık 40 hücre sonuçlanır. Her örnek için bu işlemi yineleyin.</li>
	<li>Her görüntü görüntü analiz yazılımı kullanarak hücreleri saymak. Sonra olumlu FAM-YVAD-FMK boyama içeren hücreleri saymak. Caspase-1 etkinleştirme FAM-YVAD-FMK pozitif hücrelerinin yüzdesi olarak düzeyini temsil edecek.</li>
</ol>7. karaciğer yayın tahlil
Not: karaciğer yayın tahlil için tohum ve önceki bölümde açıklandığı gibi hücreleri hariç Başbakan 96 iyi tabak kullanın. Orta priming sonra kaldırmaz.
<ol><li>DMEM-5 10 mikron nigericin deneysel wells için ve 50 μL içeren 50 μL eklemek DMEM-5 spontan ve % 100 lizis denetim kuyuları için. Hedef hücre lizis ölçmek için olduğundan glisin bu deneyde eklemeyin. 60 dk 37 ° C ve % 5 CO2için kuluçkaya.</li>
	<li>30 dk sonra % 100 lizis denetim wells için 10 x lizis arabelleği 10 μL ekleyin ve DMEM-5 10 μL diğer wells ekleyin. Bu kuluçka sırasında substrat Mix (kurutulmuş substrat 1,5 mL) 1 flakon ve tahlil arabelleği (~ 12 mL) 1 aliquot dondurucudan kaldırmak ve ışıktan oda sıcaklığında korunan çözülme bildirin. Not: Kırmızı formazan ürün için dönüştürülür tetrazolium tuz (iodonitro-tetrazolium menekşe), substrat içermektedir.</li>
	<li>60 dk toplam kuluçka sonra plaka vasıl 500 x g 10 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi 50 μL süpernatant ile bir açık düz alt plaka aktarın. Bu süre içinde tahlil arabellek 12 mL substrat mix şişe ekleyin ve kullanmadan önce oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Her şey için 50 μL substrat ekleyin ve karanlıkta 30 dk için kuluçkaya. Orta tek kuyular için boş değerler içerir. Plaka 15 dakika sonra sinyal plaka okuyucu algılama sınırı aşan değil emin olmak için denetleyin.</li>
	<li>30 dk sonra durmak eriyik (1 M asetik asit) 50 μL ekleyin ve bir plaka okuyucu kullanarak OD490 ölçmek.</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak hücre lizis yüzdesini hesaplamak: % Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (maksimum-spontan)) × 100 Deneysel: tedavi nigericin hücreleri; spontan: tedavi edilmezse hücreleri; en fazla: hücre lizis arabelleğe maruz</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jorgensen, I., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptotic+cell+death+defends+against+intracellular+pathogens.">Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens.</a> Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).</li><li>Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+action,+role+in+disease,+and+therapeutics.">Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics.</a> Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).</li><li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptosis:+host+cell+death+and+inflammation.">Pyroptosis: host cell death and inflammation.</a> Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+host+responses+during+pyroptosis:+caspase-1-dependent+lysosome+exocytosis+and+inflammatory+cytokine+maturation.">Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation.</a> J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death.">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li><li>Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+NLRP3+inflammasome+activation.">Mechanism of NLRP3 inflammasome activation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).</li><li>Juliana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transcriptional+priming+and+deubiquitination+regulate+NLRP3+inflammasome+activation.">Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation.</a> J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).</li><li>Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitination+of+NLRP3+by+BRCC3+critically+regulates+inflammasome+activity.">Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity.</a> Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).</li><li>Song, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+Phosphorylation+Is+an+Essential+Priming+Event+for+Inflammasome+Activation.">NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation.</a> Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).</li><li>Stutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasome+assembly+is+regulated+by+phosphorylation+of+the+pyrin+domain.">NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain.</a> J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).</li><li>Broz, P., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+assembly,+regulation+and+signalling.">Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling.</a> Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).</li><li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC,+a+novel+22-kDa+protein,+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells.">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC+is+essential+for+LPS-induced+activation+of+procaspase-1+independently+of+TLR-associated+signal+adaptor+molecules.">ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules.</a> Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).</li><li>Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-induced+pyroptotic+cell+death.">Caspase-1-induced pyroptotic cell death.</a> Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).</li><li>LaRock, C. N., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Yersinia+virulence+effector+YopM+binds+caspase-1+to+arrest+inflammasome+assembly+and+processing.">The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing.</a> Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).</li><li>Swanson, M. S., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Legionella+pneumophila+with+the+macrophage+endoplasmic+reticulum.">Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum.</a> Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).</li><li>Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS,+TLR4+and+infectious+disease+diversity.">LPS, TLR4 and infectious disease diversity.</a> Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).</li><li>Sester, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometric+method+to+assess+inflammasome+formation.">A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation.</a> J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).</li><li>Sester, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Inflammasome+Formation+by+Flow+Cytometry.">Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2016).</li><li>DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+cell+lysis+are+separable+events+during+pyroptosis.">Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis.</a> Cell Death Discov. , (2017).</li><li>Russo, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Caspase-1+Induces+Plasma+Membrane+Pores+That+Precede+Pyroptotic+Lysis+and+Are+Blocked+by+Lanthanides.">Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides.</a> J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).</li><li>Evavold, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pore-Forming+Protein+Gasdermin+D+Regulates+Interleukin-1+Secretion+from+Living+Macrophages.">The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages.</a> Immunity. , (2017).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu makale, biz inflammasome harekete geçirmek ve caspase-1 harekete geçirmek NLRP3 stimülasyon fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde takip sonucu incelemek için iki teknik sundu. İlk teknik caspase-1 etkinleştirme floresan muhabir FAM-YVAD-FMK hücresel bağlamında düzeyini belirlemek araştırmacı sağlar. Bu muhabir caspase-1/11 eksik makrofajlar boyama yokluğu tarafından görüldüğü gibi enzimlerin caspase-1 Aile bağlama için çok özel. Özgüllük LaRock ve arktarafından da gösterildi. caspase-1 devre dışı Yersinia protein YopM rolünü açıklayan, gönderdikleri çalışmanın içinde. Gönderdikleri çalışmanın gösteriyorlar FAM-YVAD-FMK foci caspase-117karşı yönetmen antikorlar ile etiketli foci ile çakışıyor.
Her denemede olduğu gibi yanlış pozitif sonuçlar ortadan kaldırmak için izlenmesi gereken bazı önemli adımlar vardır. Her şeyden önce vahşi türü ve caspase-1/11 eksik makrofajlar kullanmak zorunludur. Bu iki hücre türleri kullanarak, non-spesifik boyama için yol koşulları daha fazla analiz dışlanabilir. İkinci olarak, tahlil etiketleme herhangi bir antikor veya etkinlik sondası gibi ile FAM-YVAD-FMK ile boyama sonra hücreler iyice yıkayın önemlidir. Üç 5 dk yıkar kullanarak, arka plan sinyal düzeyini önemli ölçüde azalır. Üçüncü önemli bir adım confocal mikroskop kurulumu sırasında oluşur. Burada, tedavi edilmemiş hücreler FAM-YVAD-FMK ile etiketli böyle bir şekilde hiçbir olumlu sitoplazmik boyama tedavi edilmezse hücrelerde görülmektedir confocal mikroskop uzaklığı ayarlamak için kullanılır önemlidir. Bu adımlar izlendiğinde, bu teknik harekete geçirmek-in caspase-1 hücresel olarak değerlendirmek için yararlı bir araçtır.
Bu iletişim kuralı araştırmacılar gereksinimlerinize uyacak şekilde değiştirilebilir. Örneğin, hücreleri ile küçük molekül ağırlıklı bileşikler birkaç adımlar tüm işlemi sırasında tedavi edilebilir. Bu NLR, ASC veya pro-caspase-1, alımı Oligomerizasyonda modüle yolları tanımlanması için sağlayacak ya da harekete geçirmek caspase-1 kendisi. Bu iletişim kuralı için yapılan değişiklikleri onlar caspase-1 tek başına yapmak değil harekete geçirmek böyle olmak zorunda. Bu durumda, söz konusu ilacın dozu yanıt eğrisi gereklidir. Biz NLRP3 inflammasome harekete geçirmek üstünde duruldu olsa bile, bu protokolü de diğer PRRs tarafından tetiklenen inflammasomes incelemek için kullanılabilir. Başka bir değişiklik bu el yazması dahil ettik FAM-YVAD-FMK antikor inflammasome bileşenleri etiketleme ile boyama ile birlikte olduğunu. Active caspase-1 inflammasome adaptör ASC Co yerelleştirme olduğunu göstereceğiz. Bir bu yöntemi açıklandığı gibi confocal mikroskop erişim gerektiren kısıtlamasıdır. Ancak, ASC odak oluşumu akış sitometresi tarafından tespit etmek için ilgili bir strateji bildirilen20,21olmuştur.
Konuştuğumuz ikinci teknik bir karaciğer yayın tahlil kullanarak hücre lizis hızlı tespiti için sağlar. Karaciğer yayın aynı zamanda birçok diğer formları hücre ölümü sırasında oluşur ve pyroptosis için spesifik değildir plazma membran bütünlüğü ve hücre lizis, kaybı gösterir unutmamak gerekir. Ancak, caspase-1 eksik hücrelerin kullanımı caspase 1 bağımlı hücre lizis, pyroptosis belirleyici bir özellik tanımlayabilirsiniz.
Bu iletişim kuralı (özellikle bulaşıcı bir ajan kullanırken) kritik bir adımda plaka 96 iyi plaka hücrelerde tohum sonra santrifüj kapasitesi var. Santrifüjü plaka makrofajlar eşit dağıtım için iyi bütün yüzeyi boyunca sağlar. Eşit dağıtım ile her makrofaj bakteriler aynı sayıda maruz kalacağı. Santrifüjü, daha fazla makrofajlar kuyunun kenarında biriken sıvı iyi menisküs etkisini sağlayacaktır. Bu enfeksiyon amaçlanan çokluğu iyi Center'da (MOI) iyi duvara yakın ve amaçlanan daha yüksek MOI düşürmek için yol açacak.
Karaciğer yayın tahlil bir potansiyel dezavantajı bu lizis nüfus düzeyinde ve tahlil için bir zaman noktasında ölçer olmasıdır. Alternatif bir yaklaşım tek hücre olarak membran bütünlüğü kaybı tanımlar mikroskobu tarafından hücre impermeant boyalar alımını ölçmek etmektir. Canlı hücre platformları Imaging ile birlikte, bu yaklaşım aynı zamanda pyroptosis22zamansal bir değerlendirme sağlar. Propidium iyodür gibi küçük DNA'ya bağlanıcı floresan boyalar veya etidyum bromür gasdermin D gözenek geçmek, hücresel nükleik asitleri bağlama ve5,22,23bulabilsem. Gözenek oluşumu ve bu küçük boya alımını geçici terminal hücre lizis önce. Lizis daha büyük boya alımını ve karaciğer gibi büyük hücresel protein kaybı sağlar. Glisin kullanımı deneysel olarak gözenek oluşumu lizis, üzerinden glisin gasdermin D-aracılı gözenek oluşumu, küçük boya alımı veya IL-1β salgı engellemez, ancak glisin hızlı lizis ve karaciğer sürüm5,22 engeller gibi çözmek , 23 , 24. membran bütünlüğü tamamen kaybı önlemek için FAM-YAVD-FMK boyama deneylerde glisin dahil öneririz ama glisin pyroptotic karaciğer yayın ölçerken ihmal gerekir.

Inflammasome-aracılı iltihap patojen organizmalar1karşı savunma bir kritik bileşenidir ama aynı zamanda pek çok hastalıkları2etyolojisinde altında yatan. Hasar moleküler modelleri (DAMPs) ilişkili veya çok çeşitli enfeksiyonların inflamatuar yanıt patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPs) sitozolik algılama tarafından tetiklenir. Desen tanıma reseptörleri (PRR), NOD benzeri reseptör (NLR) aile üyeleri de dahil olmak üzere bu algılama PAMPs ve DAMPs oligomerize. Bu PRR, apoptozis ile ilişkili leke gibi protein içeren bir C-terminal caspase-işe alım etki alanı (kart) (ASC) ve yanlısı şeklinde adaptör protein içeren inflammasome olarak adlandırdığı bir çok protein kompleksi oluşumunu tetikler caspase-13,4. Bu karmaşık yakınlık kaynaklı auto-harekete geçirmek-in caspase-1 sağlar. Active caspase-1 sonra özelliği inflamatuar hücre ölüm yolu pyroptosis olan olayları yol açar. Bu olaylar şunlardır: bölünme ve inflamatuar sitokinlerin IL-1β ve IL-18, lysosome ekzositozu ekstrasellüler boşluk, nükleer yoğunlaşma ve gasdermin D bölünme lizozomal İçindekiler sürümüyle serbest bırakılması. Plazma membran rüptürü ve yayın patojen çoğaltma5, için koruyucu bir niş zannetme yanı sıra inflamatuar İçindekiler neden gözenekleri oluşturan plazma zarı gasdermin D yayımlanan N-terminal alanı ekler 6 , 7.
Burada, iyi okudu NLRP3 inflammasome ele. NLRP3 inflammasome aktivasyonu ile iki adımlı işlem8oluşur. İlk "macun" adım tanıma programını Toll benzeri reseptörler bir mikrobiyal ürünün tarafından (TLR) oluşur. Bu TLR4 uyarmak için LPS kullanarak laboratuar ortamında çoğaltılır. Bu uyarımı upregulates NLRP3 ve NF-kB sinyal aracılığıyla pro-IL-1β. Ayrıca priming NLRP3 transkripsiyon mekanizmalar aracılığıyla onun deubiquitination9,10 ve fosforilasyon veya belirli artıkları11,12dephosphorylation inducing tarafından lisans verir.
İkinci sinyal NLRP3 harekete geçirmek için ne kadar zor8NLRP3 harekete geçirmek için birleştirici bir mekanizma kalır mitokondrial faktörler, reaktif oksijen türleri, potasyum sızma ve sinyal, kalsiyum içeren düşünülmektedir. Aktif NLRP3 onun NACHT etki alanları arasındaki etkileşimler yoluyla oligomerizes ve ASC pyrin (PYD) etki alanları13bağlama yolu ile acemi. Her hücre, tek bir mikroskobik görünür odak makromoleküllerin bu kompleksler oluşturur. ASC aslında insan lösemi hücreleri apoptosis sırasında bir "leke" oluşturan 22 KDa protein ve bir kart14içeren adlandırılmış apoptozis ile ilişkili leke gibi protein olarak tespit edilmiştir. Bu daha sonra ASC pro-caspase-1 inflammasome15şekillendirme kartı pro-caspase-1, ASC kartıyla etkileşimi aracılığıyla acemi belirlendi.
Tüm NLR'ler caspase-1 aktivasyon ikna etmek için ASC varlığını gerektirir. NLRP3, aksine NLRC4 ve NLRP1b kartı etki alanları var ve pro-caspase-1 caspase-1 aktivasyon ikna etmek için kart etkileşimleri aracılığıyla doğrudan işe. ASC yokluğunda active caspase-1 sitozol yaygın olarak kalır ve tek bir odak noktası formu değil. Bu yaygın active caspase-1 pyroptotic hücre ölümü ikna etmek yeterli ama pro-IL-1β13,16işleyemiyor.
Bu makale, inflammasome harekete geçirmek değerlendirmek için iki yol ele alınacak. İlk floresan faaliyet kullanan sonda, FAM-YVAD-caspase-1 proteaz ailesinin bağlayan FMK,. Bu aile caspase-1, ama aynı zamanda fare caspase-11 ve insan caspase-4 ve caspase-5 içerir. Caspase-1/11 eksik fare üzerinden makrofajlar tüm deneyler kullanarak, bu sonda özgüllük ele alınacaktır. Bu yöntem ayrıca anlatacağız inflammasome bileşenlerinin antikor etiketleme ile kombine edilebilir. Mikroskobik görselleştirme için tek tek hücreleri aktif caspase-1 ve oligomerized ASC içeren kimlik sağlar. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar inflammasome oluşumu cascade bir etkisi konak hücre veya altında eğitim patojen organizma kendi işlemler olduğu belirlemek mümkün olacak. Örneğin, belirli bir müdahale ASC alımı karmaşık NLRP3 engeller ya da sonraki işe alım ve caspase-117aktivasyonu hedefleyen bir ayırt edebilirsiniz. Caspase-1 etkinleştirme IL-1β salgı gibi sonuçlarını inceleyerek bu iki olasılık arasında ayırt etmek mümkün olmaz. Ayrıca, IL-1β salgı hücreleri yetenek caspase-1 etkinleştirmek ve pyroptotic hücre ölüm16geçmesi değiştirmeden değişmiş.
İkinci yöntem yukarıda açıklanan caspase-1 harekete geçirmek izleyip pyroptotic makrofaj lizis sırasında oluşan serbest bırakılması laktat dehidrogenaz (karaciğer) süpernatant, hücre içine ölçer. Tüm karaciğer sürümünde de ölçülen bu ikinci yöntem nüfus temelli bir yaklaşım olur. Bu basit yaklaşım hızlı analiz örnekleri için (kuluçka süresi 30 dk) caspase-1-aracılı hücre ölümü olup olmadığını belirlemek için izin verir ve bir 96-şey plaka biçimde gerçekleştirilebilir.
Bu yöntemleri tamamlayıcı, her biri farklı avantajları ve her ikisi de kolayca değişiklikler mükellef bulunmaktadır. Örneğin, makrofaj tedavi ile hedeflenen küçük molekül ağırlıklı bileşikler inflammasome stimülasyon önce rol proteinler inflamatuar yanıt-e doğru kontrol üzerinde olabilir belirli araştırmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>E-MEM</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>For growing L929 cells</td></tr><tr><td>NCRC clone 929 (L929)</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biorad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-G1780</td><td>Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid</td></tr><tr><td>FAM-YVAD-FMK</td><td>Immunocytochemistry Technologies</td><td>98</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, no glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS, no calcium, no magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Heat inactivated at 55&amp;deg;C for 50 min</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Mounting Medium</td><td>Invitrogen</td><td>p36934</td><td>Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46</td></tr><tr><td>goat anti-mouse ALEXA555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>far-red fluorescent nucleic acid stain</td></tr><tr><td>C57BL/6J mouse</td><td>Jackson Laboratoy</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>caspase-1/11-/- mouse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>016621</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8X Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)</td><td>List Biologicals</td><td>434</td><td></td></tr><tr><td>anti-ASC clone 2EI-7</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-417</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercapto-ethanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M3 plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td>5000414</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages

Inflammasomes birçok patojen organizmalar başarılı kontrolü için gerekli olan ama aynı zamanda inflamatuar teşvik doğuştan gelen bağışıklık sinyal gönderme platformları ve otoinflamatuvar hastalıklar vardır. Inflammasomes başını sallamak-benzeri reseptör (NLR) aile üyeleri de dahil olmak üzere sitozolik desen tanıma reseptörleri tarafından aktif hale gelir. Bu reseptörler mikrobiyal veya hasar ilişkili uyarinin algılama oligomerize. Sonraki artan adaptör protein alımı caspase-1 ile yakınlık kaynaklı auto-harekete geçirmek harekete geçirmek bir mikroskobik görünür inflammasome karmaşık, oluşturur. Harekete geçirmek, caspase-1 pro-IL-1β ve pro-IL-18, harekete geçirmek ve bu pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını lider cleaves. Caspase-1 Ayrıca inflamatuar formdaki membran bütünlüğü ve hücre lizis kaybı özellikleri pyroptosis olarak adlandırdığı hücre ölümü aracılık eder. Caspase-1 gasdermin için ozmotik lizis önde gelen D, plazma zarı gözenekleri, oluşturan N-terminal parça bırakmadan cleaves.
İçinde vitro, belgili tanımlık harekete geçirmek caspase-1 caspase-1 faaliyet sonda FAM-YVAD-FMK ile kemik iliği türevi makrofajlar etiketleme ve adaptör protein ASC karşı antikor hücrelerle etiketleme belirlenebilir. Bu teknik inflammasome oluşumu ve caspase-1 harekete geçirmek floresans mikroskobu kullanarak tek tek hücreleri içinde kimliği sağlar. Pyroptotic hücre ölümü Orta serbest bırakılması sitozolik laktat dehidrogenaz ölçüm tarafından tespit edilebilir. Bu basit, uygun maliyetli ve filtreleme için uyum sağlayan bir 96-şey plaka biçiminde gerçekleştirilen işlemdir. Bu makale, nigericin tarafından NLRP3 inflammasome aktivasyonu için adaptör protein ASC ve etkin caspase-1, yerelleştirme iş açar pyroptosis için önde gelen gösteriyoruz.

Caspase-1 harekete geçirmek nigericin maruz takip algılamak için hücreleri Protokolü bölümünde açıklandığı gibi işlendi. FAM-YVAD-FMK ve ASC ASC ve etkin caspase-1 NLRP3-aracılı inflammasome harekete geçirmek takip işbirliği yerelleştirmek olduğunu göstermek için antikor etiketleme kombine. Şekil 1A 5 mikron nigericin maruz vahşi türü makrofajlar Perinükleer bölgede bir ASC odak oluşumu olduğunu gösterir. Bu resimde de ASC FAM-YVAD-FMK ile ortak yerelleştirme tarafından görüldüğü gibi aktif caspase-1 içerir. Active caspase-1 için pozitif hücreler bu hücreler pyroptosis geçiren gösterilen nükleer yoğunlaşma var. Şekil 1B makrofajlar caspase-1/11 eksik farelerin bir ASC odak oluşumu var iken, onlar herhangi bir etkin caspase-1 FAM-YVAD-FMK boyama yokluğu tarafından gösterildiği gibi bu odak ile ilişkili yok gösterir. Bu hücrelerin çekirdekleri, hiçbir pyroptotic olduğunu gösteren Özet değil ölüm meydana gelen hücre. Görüntüleri bir 63 X yağı daldırma amacı ile tarama confocal mikroskop kullanarak alındı. Görüntüleri TIFF dosyaları olarak başka herhangi bir işleme olmadan kaydedildi.
Nigericin maruz kalma ile ilişkili hücre ölümü düzeyini belirlemek için biz bir karaciğer yayın tahlil süpernatant kültür gerçekleştirilen. Şekil 2 vahşi türü makrofaj hücre ölümü nigericin maruz kaldıktan sonra tabi gösterir. Buna ek olarak, makrofajlar caspase-1'eksik karaciğer hücreleri eksiksiz olduğunu gösteren hücre süpernatant, serbest değil.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57463/57463fig1.jpg"> Şekil 1: FAM-YVAD-FMK ve anti-ASC etiketleme. (A)vahşi türü (WT) ve (B) caspase-1/11 eksik (c1/11- / -) makrofajlar 1 h için 5 mikron nigericin maruz ve etkin caspase-1 için etkin caspase-1 ve anti-ASC algılamak için FAM-YVAD-FMK kullanarak confocal mikroskobu tarafından analiz ASC algılamak için birincil ve keçi-anti-fare ikincil antikor oluşumu odaklan. <a href="/files/ftp_upload/57463/57463fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57463/57463fig2.jpg"> Şekil 2: karaciğer yayın tahlil sonuçları. Vahşi türü ve caspase-1/11 eksik makrofajlar 1 h için 5 mikron nigericin sinin ve hücre süpernatant karaciğer varlığı için analiz edildi. Anlamına gelir ± SD üç çoğaltır verilerdir. <a href="/files/ftp_upload/57463/57463fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages at JoVE.com

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

NLRP3 inflammasome harekete geçirmek algılama floresans mikroskobu kullanarak ve etkin caspase-1 ve adaptörü, ASC için boyama hücresel olarak açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz yayın tahlil pyroptotic lizis nüfus olarak algılamak için sunulmuştur. Bu teknikler birçok açıdan inflammasome biyoloji çalışmaya adapte edilebilir.

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

detection-inflammasome-activation-pyroptotic-cell-death-murine-bone

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K Görüntüleme.  University of Washington. NLRP3 inflammasome harekete geçirmek algılama floresans mikroskobu kullanarak ve etkin caspase-1 ve adaptörü, ASC için boyama hücresel olarak açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz yayın tahlil pyroptotic lizis nüfus olarak algılamak için sunulmuştur. Bu teknikler birçok açıdan inflammasome biyoloji çalışmaya adapte edilebilir.

Video: Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Aktivasyon ve İnsan monosit türevli dendritik hücreler, IL-1β kullanarak NLRP3 Inflammasome Aktivitenin Ölçümü

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development and implementation of biomedical devices and tissue engineering constructs. Macrophages, an innate immune cell, are key players in the foreign body reaction because they remain at the implant site for the lifetime of the device, and are commonly studied to gain an understanding of this detrimental host response. Many biomaterials researchers have shown that adsorbed protein layers on implanted materials influence macrophage behavior, and subsequently impact the host response. The methods in this paper describe an in vitro model using adsorbed protein layers containing cellular damage molecules on polymer biomaterial surfaces to assess macrophage responses. An NF-&#1082;B/AP-1 reporter macrophage cell line and the associated colorimetric alkaline phosphatase assay were used as a rapid method to indirectly examine NF-&#1082;B/AP-1 transcription factor activity in response to complex adsorbed protein layers containing blood proteins and damage-associated molecular patterns, as a model of the complex adsorbed protein layers formed on biomaterial surfaces in vivo.

This protocol provides researchers with a rapid, indirect method of measuring TLR-dependent NF-&#1082;B/AP-1 transcription factor activity in a murine macrophage cell line in response to a variety of polymeric surfaces and adsorbed protein layers that model the biomaterial implant microenvironment.

Polimerik Yüzeylerde Adsorbe Protein Katmanlarında Sinyalizasyonu NF-kB/AP-1 Sinyallerini İnceleyecek Bir Makrofaj Muhabiri Hücre Tetkik

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development ...

Biyomühendislik

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Activation of Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages in Response to Antibodies

Source: Kozicky, L. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the activation of bone marrow-derived macrophages in response to bacterial lipopolysaccharide and intravenous immunoglobulin.

Antikorlara Yanıt Olarak Fare Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Aktivasyonu

Source: Kozicky, L. et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation. J. Vis. Exp. (2017)
In ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

Bağışıklık Yanıtları

Konak Savunma Mekanizması

Detection of Inflammasome Activation via Fluorescence Microscopy

Source: den Hartigh, A. B. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57463">Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2018)
This video demonstrates a method to detect NLRP3 inflammasome activation in macrophages using fluorescent reporter probes. The cells are treated with potassium ionophores and glycine to induce inflammasome assembly and caspase-1 activation. Fluorescent reporter probes visualize activated caspase-1, and cells are stained with a fluorescent dye for nuclei visualization.

Floresan mikroskobu ile inflamatuar aktivasyonun tespiti

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

An In Vitro Technique to Study Inflammasome Complex Formation in Macrophages

Source: den Hartigh, A. B., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57463">Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique to study NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome formation in primary macrophages via immunofluorescence. The macrophages are first primed with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to upregulate NLRP3 protein expression. Exposing the macrophages to nigericin&#8212;a potassium ionophore&#8212;leads to the activation of NLRP3 and the formation of inflammasomes, which are visualized via immunofluorescence.

Makrofajlarda İnflamatuar Kompleks Oluşumunu İncelemek İçin İn Vitro Bir Teknik

A Lactate Dehydrogenase Release Assay To Detect Macrophage Death Following Nigericin Exposure

Source: den Hartigh, A.B. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57463">Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the lactate dehydrogenase assay to detect inflammasome-mediated macrophage death. The macrophages are exposed to lipopolysaccharide for priming, followed by exposure to nigericin to cause inflammasome-induced cell death, which is determined by the lactate dehydrogenase assay.

Nigerisin Maruziyetini Takiben Makrofaj Ölümünü Tespit Etmek İçin Bir Laktat Dehidrojenaz Serbest Bırakma Testi

1. LDH Release Assay
NOTE: For the LDH release assay, seed the cells in a 96-well plate. Do not remove the medium after priming.

	Replace the medium with ...