Name: in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

Biz Jean-Baptiste Sibarita ve Daniel Choquet (IINS, CNRS/Bordeaux Üniversitesi) tek molekül analizi ile tür destek için teşekkür ederiz. Nick Valmas özellikle teşekkür ediyoruz ve Jessica Mcgaw (QBI, Queensland Üniversitesi) video ile onların yardım için kayıt, ses hem de grafik tasarım rakam. Bu eser Avustralya Araştırma Konseyi (AR) keşif project tarafından desteklenmiştir (F.A.M. DP170100125), Avustralya Araştırma Konseyi (LIEF Grant LE0882864, F.A.M.) gelecek arkadaş grubu (B.V.S. FT100100725), Avustralya Araştırma Konseyi (LIEF Grant LE130100078 F.A.M için.) ve NHMRC Projesi (B.V.S. APP1103923) verin. F.A.M. NHMRC üst düzey araştırma görevlisi (ONT1060075) olduğunu.

1. tasarım transgenik Drosophila mEos2 öğesini proteinler ifade
<ol><li>MEos2 protein ile etiketlenmesi için protein seçin. Proteinler bir transmembran etki alanı ile görüntüleme başarı oranını artırmak için proteinler sinaptik veziküller veya autophagosomes26,27 (Örneğin, nöronal plazma zarı14 ' te (örneğin, sözdiziminin-1A), seçin Synaptobrevin-2), ya da yakın etkileşim nöronal plazma membran proteinlerinin (örneğin, Munc18-1) ile sitozolik protein.</li>
	<li>Transgenes (şekil 1) mEos2 öğesini protein kodlama oluşturmak. Protein ve mEos2 için ileriye ve geriye doğru astar tasarım. Not: MEos2 kodlama dizisi üzerinden faiz protein C-terminus sigorta için tasarlanmış pmEos2-N1 plazmid çoğaltılabilir. Klonlama örneğin yapılabilir pFL44S kullanarak Saccharomyces cerevisiae vivo içinde rekombinasyon tarafından-attB-MCS-w + vektör14,28, klonlama başka yöntemler Gibson gibi alternatif olarak kullanılabilir derleme protokolü29.<ol>
<li>Vektör BamHI ve XbaI ile linearize ve ura3 - Maya hücreleri mEos2 ve faiz protein kodlama PCR parçaları ile birlikte ortak dönüştürmek. Drosophila embriyo bir transgenik sinek çizgi30oluşturmak için sahip yapı enjekte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transgenik sinek kültürler standart Maya ve Şeker Pekmezi orta veya bazı diğer uygun yerine Plastik şişeleri bulunan arka. Sağlıklı ve oldukça büyük sinaptik boutons31emin olmak için şişeleri doluluk sinekli önlemek ve sinekler için yeni tüpleri yumurta atma her gün sonra çevir; Bu üçüncü INSTAR larva iyi beslenir ve medyada dolaşan başlamak zaman uygun büyüklük ulaşmak sağlar. Oda sıcaklığında (25 ° C) transgenik sinek yükseltmek. Not: Daha büyük sinaptik boutons proteinler görüntüleme sırasında görselleştirildiği daha büyük miktar verim eğilimindedir.</li>
</ol>2. üçüncü INSTAR Larva diseksiyon
<ol><li>Silindirik veya semicylindrical şekilli polydimethylsiloxane (PDMS) temel ≤20 mm çap ve ≤20 mm yüksekliğinde bir uygun silikon elastomer Kiti (şekil 2A) kullanarak olun. Ajan 10:1 oranında artırma bir silikon silikon elastomer karıştırın.<ol>
<li>İyice için 5 dk. dimsensions ile bir kalıp içine karışımı yukarıda listelenen Pour karışımı ilave edin. Bir fırında 45 dk için 100 ° C'de sertleşmesine izin. PDMS Bankası hangi diseksiyon taşımak temel olarak hizmet verecek. PDMS Bankası kültür cam popolu çanak kuyuya uyuyor emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir göçebe üçüncü INSTAR larva şişe duvardan seçin. Optik bir stereo mikroskop 4,5 büyütme oranında PDMS silindir tabanı dorsal yüzü yukarı yerleştirilen larva görselleştirmek için kullanın.</li>
	<li>Kavisli ve açılı ön vızıltısı, genişletme ikisi arasında ağız kanca kafasına ve iki arka vızıltısı arasında anüs üzerinde kuyruk minutien iğne sopa için cımbız kullanın. Schneider'ın böcek Orta 40 µL üzerine immobilize larva oda sıcaklığında ekleyin. Not: Hemolyph benzeri çözümler (HL3 veya HL6) de Schneider'ın çözüm32,33yerine kullanılabilir.</li>
	<li>Duvar orta hat deşmek için minutien iğne kullanımı tarafından larva karın vücut duvarına sırt tarafında üzerinden erişimi sağlar.</li>
	<li>Vücut duvar kesmek için kullanım bahar makas kesiği noktadan açın. Ön-arka yönü34orta çizgi boyunca kesin.</li>
	<li>İyi forseps kullanın ve bahar larva deşeceğin makas: tükürük bezleri, trakea ve gut gibi iç organların kaldırın. Larva Schneider'ın böcek orta ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>İyi Forseps ile iki vücut duvar flep tutun, yavaşça onları dışarı uzatmak ve her iki tarafta iki minutien iğne sopa. Bu bir Altıgen şeklinde hazırlık (şekil 2A) üretmek gerekir.</li>
	<li>Beyin görüntüleme sırasında kas hareketi olasılığını azaltmak için Bahar makas kullanarak ventral sinir kablosu bağlantısını kesin; Bu da hazırlık karşı düz görüntüleme çanak tutmak için hizmet vermektedir. Tüm altı minutien mandal PDMS temel içine itmek için eğri cımbız kullanın. Not: Pimleri yalnızca küçük bir bölümünü karın duvarı içinde gömülü olması.</li>
	<li>Larva diseksiyon yordamı yaşamıştır onaylamak, biraz it ventral sinir kablosu için bu larva karın duvarı Peristaltik bir daralma temin.</li>
</ol>3. hafifçe eğik aydınlatma tek-parçacık izleme mikroskobu
<ol><li>Bir cam popolu kültür yemek üzerine disseke larva-PDMS Bankası tersine çevirin. Görüntüleme yemek oda sıcaklığında Schneider'ın böcek orta (şekil 2B) 2 mL ile doldurulması.</li>
	<li>Motor nöronlar sinapslarda karın kasları 6 ve 735 63 x kullanarak üzerinde olan ikinci ve üçüncü kesimi bulun / 1.2 NA su-daldırma amaçta floresan toplam iç yansıma (TIRF) floresan mikroskop.</li>
	<li>Mikroskop göz mercekleri disseke larva bulmak için kullanın; kas 6 parlak alan aydınlatma kullanımı ile tanımlayın.</li>
	<li>Mikroskop edinme yazılım kullanın (bkz. Tablo reçetesi) TIRF yapılandırma; Kolimatör kamera açısını penetrasyon arttırmak, aksi takdirde eğik aydınlatma elde etmek için TIRF kritik açı dışarı taşımak için 1 ° için kaydırın.</li>
	<li>488 nm lazer mEos2 yeşil görselleştirmek için geçiş yapma. Düşük lazer gücü kullanmak (22,8 az % 5 mW) yeşil Floresans ağartma önlemek için. (Bu boncuklar gibi bir ipe bak) nöromüsküler kavşak bulun ve düşük çözünürlüklü TIRF görüntü elde etmek.</li>
	<li>Aynı anda 405 nm lazer üzerinde geçiş (photoconverts mEos2 gelen yeşil kırmızı türler için) ve stochastically tek mEos2 floresan proteinler yerelleştirmek için 561 nm lazer (İmaj photoconverted kırmızı mEos2). Not: Düşük 405 nm lazer güç kullanılması tavsiye edilir (4,78 %0,9 0.005 mW) gibi bu film satın alma sırasında bir nispeten sabit photoconversion oranı için sağlar. 50 ve 561 nm lazer % 75'i arasındaki kullanım (20,1 mW), bu olumsuz nöromüsküler kavşak çevreleyen kas dokusu morfolojisi etkilemeden Floresans kırmızı mEos2 türlerden elde etmek yeterli olduğu gibi.</li>
	<li>Her nöromüsküler kavşak zinciri için serisi 15.000 çerçeveler ya da daha fazla 33 Hz., as.czi biçimi eşlik eden meta veri olası başvuru için korumak için oluşan bir zaman alacak.</li>
	<li>ImageJ '.czi' film dosyaları '.tiff' dosyalarını dönüştürmek için kullanın.</li>
	<li>Uygun tek molekül FIJI/ImageJ37 ' TrackMate gibi analitik yazılım11,14,36 izleme ile alınan Filmler analiz ( Tablo malzemelerigörmek). 'X' ve 'y' bulur her yerelleştirme tarafından Gauss uygun yoğunluk noktasının koordinatlarını yayıldı fonksiyonu (PSF). Not: sorun giderme: yeşil floresan değil görülmektedir veya çok karanlık 488 nm lazer maruz üzerine nöromusküler kavşakta, kısaca photoconverting ve lazerler Imaging geçiş (405 nm ve 561 nm), bu kırmızı daha fazla üretmek için yardımcı olarak mEos2 tür. 488 nm lazer geri geçiş yapmak ve TIRF resim al.</li>
</ol>4. tek molekül yerelleştirme sabit larva içinde
<ol><li>Protein nanocluster boyutu PALM ile ölçmek için sonra diseksiyon bir sabitleştirici - fosfat tamponlu tuz (PBS) seyreltilmiş %4 paraformaldehyde ile Schneider'ın böcek orta yerine.</li>
	<li>Larva, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Diseksiyon pimleri ve sabit larva 1.7 mL içinde yer Kaldır ek kilit microcentrifuge tüp temizleyin.</li>
	<li>İncelemek ve birçok diğer larvalar gerektiği gibi o zaman onları üç kez PBS ile yıkamak gibi düzeltin.</li>
	<li>PBS blok arabellek (PBS, %0.1 Triton X-100 ve % 3 normal keçi serum bir çözüm) ile değiştirin.</li>
	<li>Larvalar PBS ile üç kez yıkayın, sonra gerekli birincil antikor (blok arabellek çözümde seyreltilmiş) ile kuluçkaya.</li>
	<li>Gecede 4 EyC. kuluçkaya</li>
	<li>Larvalar üç kez PBS ile yıkayın, sonra gerekli ikincil antikor (blok arabellek çözümde seyreltilmiş) ile kuluçkaya.</li>
	<li>Larvalar üç kez PBS ile yıkayın, larva geri PDMS Bankası ve daha önce açıklanan tek molekül izleme için görüntü üzerine ekleyin.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı tek molekül izleme Drosophila Üçüncü INSTAR larva nöromusküler kavşakta mEos2 öğesini proteinlerin açıklar. Transgenik proteinin aşırı ifade önlemek için sözdiziminin-1A-mEos2 ifade endojen sözdiziminin-1A düzenleyici tarafından tahrik edildi. Sinaptik protein hareketlilik çalışmalar çoğunlukla kültürlü hücrelerin ve kortikal nöronlar9,11,12,13 vitro araştırmalar için sınırlı olmuştur. Bu proteinler canlı hayvan benzer hareketlilik imzalarında sergi büyük ölçüde bilinmiyor. Tek-protein hareketlilik içinde vivogörselleştirmek için aşılması gereken optik şeffaflık, erişilebilirlik ve penetrasyon derinliği gibi kısıtlamalar bulunmaktadır. Larva hazırlık anatomi ve kas yüzeyinde gömülü nöromüsküler kavşak görüntülenmesi, optik şeffaflık ve erişilebilirlik sorunu kaçının. Görüntü tek molekül hareketlilik normal TIRF yapılandırma girişimleri başarısız oldu. Ancak, hafifçe eğik aydınlatma için artan uyarma lazer derinlemesine nüfuz sağlar. Ayrıca, larva hareketsiz için kullanılan minutien iğne anestezik kullanım mümkün herhangi bir olumsuz etkisi protein hareketliliği üzerine önlemek için yardımcı oldu. Tek molekül içinde vivogörselleştirmek için 100 x yağı daldırma hedefleri, gibi daha yüksek büyütme hedefleri kullanmak mümkündür. Ancak, artan büyütme sürüklenir yak²n oluşumu artabilir. Buna ek olarak, biz-si olmak kullanılmış daha düşük yoğunluklu (~ %30) 561 nm lazer motor sinir terminallerinde görüntü tek moleküller için başarılı bir şekilde. Ek sınama daha düşük lazer güç kullanmak için gerekli.
Bu iletişim kuralı nöronal plazma zarı yakınlık içinde sinaptik proteinler hareketliliğini görselleştirmek uygundur. Bu yaklaşımı kullanarak, SNARE proteini - sözdiziminin-1A ve protein Atg18a bağlı autophagosome - hareketliliğini başarıyla görüntülü içinde vivo14,26olmuştur. Motor nöron aksonlar da olabilir proteinler hareketliliğini27araştırıldı. Ancak, soruşturma beyin veya ventral sinir kordonu proteinlerin hareketlilik nedeniyle temel doku tarafından üretilen yüksek arka plan sinyal değerlendirmek zor olabilir; Buna ek olarak, protein hareketlilik aynı beyin yapısı üzerinde görüntülenmesi fluorescently etiketleme (Yinelenebilirlik) sağlamak için beyin yapısı gerektirir ve çift-kamera görüntüleme kullanımını gerekli olacaktır.
Yerine daha üçüncü INSTAR larva38,39geliştirilen Drosophila süper çözünürlük mikroskopi için kullanılabilen geçerli yöntemleri çoğunlukla görüntüleme embriyolar için sınırlıdır. Bu protokoller ile ana konu onlar yörüngeleri görüntüsü alan az sayıda verim ve dolayısıyla hareketlilik Birleşik22,40derinlemesine analiz önlemek olduğunu. İletişim kuralı izleme bizim vivo içinde tek molekül yörüngeleri yüksek bir sayı üretmek için kapasitesine sahiptir ve bu nedenle Caenorhabiditis elegans ve Zebra balığı gibi diğer hayvan modellerinde kullanılabilir. Gerçekten de, her NMJ zinciri farklı mobil durumları ve geçişleri bu Birleşik14,27arasında analiz etmek için uygun hale ~ 2400 yörüngeleri oluşturulur. Ayrıca, birçok vivo içinde tek molekül görüntüleme stratejileri olan altında görüntüleme yapılır fizyolojik işlevi değiştirmek hayvan20,22, hareketsiz anestezi kullanımını güveniyor. Burada minutien iğne kullanarak larvaları hareketsiz bir 'anestezi-ücretsiz' protokolü optimize.
Bu iletişim kuralı bir potansiyel kullanımı proteinler üç boyutlu hareketliliğini görüntülenmesi için olabilir. Süper çözünürlük mikroskobu son gelişmeler izin görüntülenmeyecektir vitro 'x', içinde olmak protein hareketlilik 'y' ve 'z' boyutları41,42. Geçerli yöntem için hareket eden 'z' ekseninde proteinlerin hesaba katmaz. Henüz Drosophila motor sinir terminal küresel bir yapıdır ve protein hareketlilik bir üç boyutlu ses43ölçmek için değerli bir gelecek yaklaşım olacaktır. Z-boyut görüntüleme astigmatik bir lens ile mümkün olabilir. Alternatif olarak, TIRF modu44,45' z-çözünürlük da arttırılır. Ancak, bizim deneyler, syntaxin1A-mEos2 astigmatik lens olmadan tek molekülleri görselleştirmek için hafifçe eğik aydınlatma kullandık.
Sonuç olarak, proteinler ifade hem de bir transgenik Drosophila sinek stok kullanılabilirliğini değiştirme imkanı ile donatılmış TIRF mikroskop yanı sıra transgenik larva incelemek için bir photoconvertible protein, bir PDMS temel ile etiketlendi aydınlatma açısını tek proteinler bu protokol için açıklandığı gibi görselleştirmek için gerekli en önemli araç vardır.

Nöronal iletişim nörotransmitter içeren sinaptik veziküller plazma zarı1ile düzenlenmiş füzyon yoluyla oluşur nörotransmitter yayın kullanır. Ekzositozu2,3,4,5,6 adı verilen bu işlem son derece dinamik ve yukarı - veya aşağı-düzenlenmiş göre stimülasyon7oranı dalgalanmalar olabilir. Bu süreçlerle ilgili proteinler Albert hareket tabi vardır ve bu nedenle Ortaölçek organizasyon bu fizyolojik fonksiyonları temelini oluşturan eylemleri bağlama bir dizi sürdürülmesi yetenekli görüntüleyin. Plazma membran proteinlerinin plazma zarı7,8,9,10,11nanoclusters içine moleküllerin yanal yakalama sağlayan son derece dinamik, 12. Bu nedenle, bu proteinler hareketliliğini soruşturma eylem8onların modu aydınlatmak için yardımcı olur. Sinaptik proteinler çözünür N-ethylmaleimide hassas faktör ek protein reseptörü (tuzaklarına), örneğin sözdiziminin-1A, gibi şimdi yanı sıra yanal hızlı hareketlilik sergi lateral görüntü bindirme olarak moleküler sunabilir nanoclusters içinde olduğu bilinmektedir depoları ve siteleri vezikül füzyon9,13,14,15.
Monomeric (m) Eos16,17 ve Kaede18, gibi photoconvertible floresan proteinlerin son gelişmeler böyle nöronal plazma membran proteinlerinin yaklaşımlar kullanarak Ortaölçek çözünürlüğe sağladı Fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)14,15,19. Bu gelişmeler hareketlilik ve nanoclustering kültürlü canlı hücreleri ve nöronlar biyolojik proteinlerin soruşturmalar etkinleştirdiniz. Daha yakın zamanlarda, çalışmalar (benzer yüksek çözünürlüklerde) dinamiği ve canlı olduğu gibi organizmalar nöronlar içinde bu membran proteinlerinin organizasyonu böyle Mus musculus, Caenorhabditis elegans ve aydınlatmak için gerçekleştirilen Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Araştırma dynamics ve protein vivo içinde organizasyonu sadece (örneğin fluorophores) PALM, fırtına ve photoconvertible, son zamanlarda geliştirilen süper çözünürlük görüntüleme araçlarının kullanımı bu tür engelleri aşmak için de alması gereken Erişilebilirlik protein ve düşsel lazer penetrasyon derinliği. Sağlam bir hayvan hücre içi proteinlerin Imaging proteinler sağlam hayvan, sağlam bir farenin Hipokampus gibi dokuların yaşam içinde derin gömülü yapıları üzerinde görüntüleme doğal olarak meydan okuyor. Bu nedenle, proteinler veya doku yüzeyine yakın daha kolay görüntüsü. Vivo Imaging ile başka bir zorluk hayvanlar arasında tekrarlanabilirlik sağlamada olduğunu. Anatomi bir örnekten diğerine farklı olabilir gibi farklı olduğu gibi hayvan örnekleri çoğaltması kolaylığı ile bir yapı seçerek de zorlu kanıtlamak. Basmakalıp yapıların kullanımını gibi synapses, bazı bu zorlukların üstesinden ile yardımcı.
Diğer araştırmalar yüzeyi protein organizasyonu bir doku/organ, örneğin yansıma iken son yıllarda yapılan çalışmalarda protein hareketlilik Caenorhabditis elegans22gibi optik şeffaf bir epidermis ile hayvanlarda görüntüsü bir canlı fare21kafatası ile kortikal nöronlar aktin görüntüleme. Bazı durumlarda, anestezikler hayvan hareketsiz tutmak için kullanılmıştır; Ancak, belirli anestezikler faiz protein olumsuz etkileyebilir. Hayvanlar vivo içinde görüntüleme sırasında hareketsiz tutmak için alternatif yolları bu nedenle hata en aza indirmek için keşfedilmeyi.
Süper çözünürlük görüntüleme vivo içinde için başka bir uyarı faiz proteinlerin aydınlatmak için kullanılan lazerler çevreleyen doku olumsuz etkileyebilecek ve bu nedenle uyarma yoğunluk mümkün olduğunca düşük tutmak tavsiye edilir. Aydınlatma lazer tarafından çevreleyen doku aynı zamanda arka plan sinyal artırmak eğilimindedir. Düşük uyarma yoğunluğu kullanımı arka plan azaltmak yardımcı olur, olmak uyarı da floresan protein foton verim azalmasına neden olabilir. Alternatif arka plan sinyal görüntü analizi önce azaltmak aracı olarak arka plan çıkarma analizi sırasında kullanılabilir.
Drosophila belirli protein fonksiyon incelenmesi için köklü genetik araçları sağladığından vivo içinde görüntüleme için ideal bir organizma sunar. Ters yönde harekete geçirmek sıra (UAS)-Gal4 sistemi proteinlerin zamansal ve mekansal ifade sağlar ve bu nedenle neurotransmission23, işlemek için kullanılabilir öyle ki termo-genetik stimülasyon Drosophila geçici kullanma reseptör olası alt aile A1 (dTRPA1)24 veya opto-genetik uyarı far kırmızı kaymıştır CsChrimson25 kullanarak14Imaging ile birleştirilebilir. Vivo içinde tek molekül görüntüleme programında küçük bir sistem performans komplikasyonlar çoğunun üstesinden var ve şimdi nasıl tek-parçacık izleme Drosophila melanogaster üçüncü INSTAR larva içinde yürütülen olabilir açıklar.

<table><tbody><tr><td>PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed Culture Dish</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D29-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Optical Stereo-microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Curved Tweezers (Style 5/45)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0208-5AC-PO</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins (0.1mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma, Life Sciences</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>PS.1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16%)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black acquisition software</td><td>Carl Zeiss, 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph software</td><td>Molecular Devices</td><td>7.7.8</td><td>PALM Tracer Plugin</td></tr><tr><td>Fly strain</td><td></td><td>w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;; HA-Sx1A-mEos2</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal

Süper çözümleme mikroskobu teknikleri giderek artan sayıda Nano hücresel dünya yöneten mekanizmaları ortaya çıkarmak için yardımcı oluyor. Canlı hücreler içinde bireysel moleküllerin görselleştirme olağanüstü erişim sağlar gibi tek molekül görüntüleme ivme kazanıyor. Burada, tek-parçacık izleme fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (sptPALM) Drosophila larva gerçekleştirmek için geliştirdiğimiz bir tekniğini tanımlamak. Sinaptik iletişim kullanır bağlantı istasyonu, astar ve nörotransmitter içeren füzyon teşvik hareket anahtar presynaptic proteinler veziküller ile plazma zarı. Presynaptic proteinler bu nedenle bu önemli olaylar ile ilişkili hareket değişiklikleri sergi ve a sıra-in protein-protein ve protein-lipid etkileşimleri sıkıca bu işlemleri düzenler. Nasıl bu proteinler hareketliliğini sağlam bir canlı hayvan fizyolojik işlevleri ile ilişkili olan soruşturma kesin onların etki mekanizmaları anlamak için gerekli. Protein hareketlilik ile yüksek çözünürlüklü vivo içinde açılan optik şeffaflık, erişilebilirlik ve penetrasyon derinliği gibi sınırlamalar üstesinden gerektirir. Biz nasıl photoconvertible floresan proteinler ile hafif eğik aydınlatma görüntülenir ve motor sinir terminalinde veya üçüncü motor nöron akson boyunca izlenen sözdiziminin-1A presynaptic protein öğesini Drosophila biçim tarif larva.

Yukarıda listelenen, sözdiziminin-1A-mEos2 transgenik Drosophilamelanogaster vardı protokolü kullanılarak oluşturulan (şekil 1). Transgenik üçüncü Drosophila biçim larva PDMS silindirik Bankası (şekil 2A-F) disseke. Sözdiziminin-1a tek molekülleri görselleştirmek için PALM üzerinde hafifçe eğik lazer aydınlatma14TIRF mikroskopla kullandık.
Sözdiziminin-1a tek molekülleri kas 6 ikinci karın parçasının presynaptic motor sinir terminalde üzerinde takip. MEos2 yeşil Floresans sözdiziminin-1A-mEos2 düşük çözünürlüklü görüntü 488 nm lazer (şekil 3A) kullanarak heyecanlı zaman tip 1b boutons üzerinde görüldüğü gibi tespit edilemedi. Görüntüleme deneylerde, 405 nm ve 561 nm uyarma lazer görüntüleme derinliklerinde idi 133.5 nm ve 165.6 nm, anılan sıraya göre. Yeşil resim 16 tek tek kare ortalama satın alınmıştır. Bu yeşil görüntü bölge presynaptic motor sinir terminallere yalnız photoconverted filmi yerelleştirmeler analizini sınırlamak için kullanılan ilgi oluşturmak için kullanılan.
Çözümleme alınan photoconverted sptPALM film süper çözümlenmiş bir yoğunluk, difüzyon katsayısı, oluşturulan ve yörünge (şekil 3A) eşler. Sözdiziminin-1A-mEos2 hareketlilik daha fazla bireysel yörüngeler (şekil 3B) ortalama kare deplasman (MSD) analizi ile sayısal. İstatistiksel karşılaştırmalar yapılabilir (şekil 3B) MSD eğri altındaki alan kullanarak. Hareketlilik daha fazla çözümleme sözdiziminin-1A-mEos2 Difüzyon katsayısı dağılımı verir ve bu istatistiksel olarak hareketsiz nüfus (şekil 3 c) mobil karşılaştırma tarafından değerlendirilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> Resim 1 : MEos2 öğesini yapıları oluşturuluyor. PFL44S-attB-MCS-w + vektör doğrusallaştırılmış BamHI ve XbaI ile. Faiz (POI) protein kodlama örtüşen Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) parçaları ve mEos2, sırasıyla, örneğin, in vivo rekombinasyon ura3 - Maya hücrelerinde veya Gibson derleme klonlanmış. Sözdiziminin-1A-mEos2 transgene üretmek için biz endojen sözdiziminin-1A organizatörü ve Sonlandırıcı dizileri tarafından çevrili yapı klonlanmış olduğunu unutmayın. Elde edilen yapı daha sonra mEos2 için erimiş protein (POI) ilgi ifade transgenik bir sinek satır oluşturmak için Drosophila embriyo içine enjekte edilir. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> Resim 2 : Drosophila larva diseksiyon ve eğik aydınlatma. Yarım silindirik PDMS üste yürütülen Drosophila larva diseksiyon gösteren(a)şema. Filetoların larva üzerine düzenlenen PDMS minutien iğne kullanımı ile jel. (B-C) Larva PDMS hazırlık Schneider'ın böcek orta içeren bir kültür cam popolu çanak yerleştirilmiştir. TIRF mikroskop hafifçe eğik aydınlatma yapılandırmasında sözdiziminin-1A-mEos2 motor sinir terminallerine görselleştirmek için kullanıldı. (D-F) Yarım silindirik PDMS Bankası disseke Drosophila larva ile. Larva PDMS hazırlık Schneider'ın orta ile dolu bir görüntüleme tabağına yerleştirildi ve larva süper çözünürlük PALM mikroskobunun görüntüsü. Ölçek çubuğu, 10 mm. (bu rakam14değiştirildi). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> Şekil 3 : Vivo sözdiziminin-1A-mEos2 presynaptic motor sinir terminal, bir izleme. (A) A düşük çözünürlüklü TIRF görüntü sözdiziminin-1A-mEos2 üzerinde bir tip 1b motor sinir terminal. Photoconversion film analizi 33 oluşturulan Hz sptPALM süper çözümlenmiş yoğunluğu, difüzyon katsayısı ve yörünge haritalar görüntüsü. 5,309 bireysel yörüngeleri görüntülü üzerinde 16.000 kare film satın alma olduğunu. Ölçek çubuğu, 3 mikron. (B-C) Ortalama kare deplasman (MSD) sözdiziminin-1A-mEos2 6 farklı motor sinir terminallerine çizildi; (AUC) MSD eğri altındaki alan hareketlilik düzeyini ölçmek için kullanıldı. Difüzyon katsayısı dağıtım birbirlerinin oranları sayısal telefon ve hareketsiz sözdiziminin-1A nüfus ortaya koymaktadır; ~ 2400 yörüngeleri ortalama motor sinir terminal elde (n = 3 larva). Ortalama ortalama standart hatası sunulan veri. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

in-vivo-single-molecule-tracking-at-drosophila-presynaptic-motor

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

8.4K Görüntüleme.  The University of Queensland. Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Video: In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Nörobilim

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Gelişim Biyolojisi

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Biyoloji

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Nöron Dejenerasyonu

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Drosophila Nöromüsküler Kavşaklarda ve Kas Hücrelerinde Mikrotübül Ağlarının Görüntülenmesi

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Yazar Spotlight: Drosophila nöromüsküler kavşaklarında mikrotübül ağını anlamak 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler