Name: surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating at JoVE.com

Ulusal Doğa Bilimleri fonları of China (31770968) ve Tianjin araştırma programı uygulama Vakfı ve ileri teknoloji (17JCZDJC33400) finansal destek için sana şükrediyoruz.

1. Starpeg Nanocoating Heparin dahil imalatı
<ol><li>
Heparin succinimidyl süksinat (Heparin-NHS) sentezi
	<ol>
<li>Heparin 0.69 g tartmak ve buz gibi soğuk deiyonize su 2.0 mL geçiyoruz.</li>
		<li>NHS 0,23 g tartmak ve bir yuvarlak alt şişe buz gibi soğuk deiyonize suyla 0.5 ml geçiyoruz.</li>
		<li>EDC 0,77 g ağırlığında ve bir yuvarlak alt şişe buz gibi soğuk deiyonize suyla 0.5 ml geçiyoruz.</li>
		<li>Bir yuvarlak alt şişesi NHS ve EDC çözümlerinde karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika oda sıcaklığında bankta karışık çözüm bırakın.</li>
		<li>5,031 x g aşırı EDC ve NHS kaldırmak 10 min için EDC NHS karisimin santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>30 mL soğuk etanol karışım çözüm ve 10 dk santrifüj 5,031 x g de ekleyin.<ol>
<li>İki kez tekrarlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
StarPEG-heparin nanocoating hazırlanması
	<ol>
<li>1.0 mL % 10 (w/v) starPEG-(NH2)8 yuvarlak alt şişe ekleyin.</li>
		<li>0.67 mL % 10 (w/v) heparin-NHS aynı yuvarlak alt şişe ekleyin.</li>
		<li>StarPEG-(NH2)8 ve heparin-NHS karışık çözüm bir kuluçka viskozite ile net bir çözüm elde etmek 20 dk için 25 ° C'de yerleştirin. Not: yıldız - PEG-(NH2)8 deiyonize su 5(6) - ile desteklenmiş dağıldı dışında fluorescently etiketli heparin (FAM-heparin) gerekli deneyler için üretim yordamı aynıdır carboxyfluorescein N- succinimidyl ester %0,1 (molar oranı) starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Heparin-PEG nanocoating Fourier Transform Infrared spektroskopisi (FT-IR) tarafından karakterizasyonu
	<ol>
<li>Başlamadan önce akik harç, havaneli ve peletleme aygıtı (13 mm çapı ile küçük diskleri) aseton ve deiyonize su ile durulayın. Cam ürünleri kullanmadan önce fırında kuru.</li>
		<li>Mix yaklaşık 0.1-%1 heparin-PEG örnek ile ince KBr toz 200 – 250 mg.</li>
		<li>Akik havanda heparin-PEG ve KBr karışımı yerleştirin ve ince 2 µm çapı küçük granül haline ezmek.</li>
		<li>Karışımı bir Pelet cihaza aktarın. Yüksek sıkıştırma Kuvvetleri (8 T/cm2) 1-2 saydam peletleri oluşturmak üzere min için bir vakum uygulanır.</li>
		<li>Örnek Pelet Pelet aygıt uzak yavaşça çekin. Çatlaklar uğramak değil o kadar da zor değil çekmek dikkat et.</li>
		<li>Örnek granül bir Fourier Transform Infrared örnek kimyasal yapısı belirlemek için spektroskop için çok dikkatli bir şekilde aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Heparin-PEG nanocoating tarafından taranan elektron mikroskobu (SEM) gözenekli iç yapılarının incelenmesi
	<ol>
<li>Aşağıdaki yordamlar için standart 48-şey hücre kültür plaka ve pipetler hazırlayın.</li>
		<li>Heparin-PEG kopolimer çözüm 48-şey kültür plaka kuyu pipette.</li>
		<li>Plakayı 24 h için-80 ° C'de dondurmak.</li>
		<li>Lypophilize-50 ° c vakum ortamında örnekleri (0,1 Pa) 24 h için.</li>
		<li>Örnekleri bir alüminyum saplama yapışkan yüzeyi boyunca yayıldı.</li>
		<li>Altın örnekleriyle ceket ve iç gözenekli yapıları gözlemlemek için taranan elektron mikroskobunda gözlemlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Heparin-PEG nanocoating yüzey atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarafından incelenmesi
	<ol>
<li>Temiz silis cam slaytlar piranha çözüm ile (%70 H2SO4, %30 H2O2) 40 dk 80 ° C'de.</li>
		<li>Slaytlar metanol 10 dakika ve sonra Toluen 10 min için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>Slayt Vakum kurutma tarafından kuru.</li>
		<li>3-aminopropyl-triethoxysilane çözüm (%2 Toluen), yavaşça sallayın bol slaytlar yıkayın.</li>
		<li>Metanol Toluen 10 dk sonra 10 min için slaytları solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>Yer 100 µL % 3 heparin-PEG çözüm bir çift pipet kullanarak slaytları yüzey üzerinde.</li>
		<li>Heparin-PEG bir atomik kuvvet mikroskobu altında yüzey inceleyin (bir rezonans frekansı 50-80 kHz, kuvvet sabit 0,350 N m 21, ipucu RADIUS 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fare adacık yüzey Mühendisliği Heparin-PEG Nanocoating ile
<ol><li>
Fare adacık yüzey kaplama heparin-PEG nanocoating ile
	<ol>
<li>Daha önce bildirilen Jüpiter19' collagenase sindirim ve histopaque degrade arıtma tarafından fare adacıkları ayıklayın.</li>
		<li>1.5 mL tüp diseksiyon mikroskop altında 200 adacıkları futbolla.</li>
		<li>PBS 500 µL adacıkları ve 1 dk. için 503 x g , santrifüj ekleyin.</li>
		<li>Süpernatant alın ve heparin-PEG çözüm 250 µL ekleyin ve karışımı 10 dk. pipet yukarı ve aşağı adacıkları heparin-PEG çözüm ile karıştırmak izin vermek için buz üzerinde tutun.</li>
		<li>1 dk. için 503 x g , santrifüj.</li>
		<li>Süpernatant kaldırın ve PBS 500 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı karıştırın için pipet.</li>
		<li>Vasıl 503 x g 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın ve daha fazla kullanmak için adacıkları tutun. Heparin-PEG ile kaplı fare adacıkları sınavına FAM-heparin-PEG aşağıdaki adımları adacık kaplama için kullanıldı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
FAM-heparin-PEG nanocoating ile kaplı fare adacıkları incelenmesi
	<ol>
<li>1-2 mL RPMI boyalı adacıklar için % 10 fetal Sığır serum ile takıma 1640 ekleyin ve bu adacıkları bir ücret steril bakteri kültürü tabak içine aktarın.</li>
		<li>FAM-heparin-PEG nanocoating boyalı adacıklar bir ters floresan mikroskop altında Morfoloji ve floresan sinyallerini gözlemlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. işlevi Heparin-PEG, Sigara kaplı adacıkları göre fare adacıkları kaplı
<ol><li>
Heparin-PEG kaplı fare adacıkları canlılık
	<ol>
<li>20 heparin-PEG kaplı fare adacıklar BitTorrents ve 96-şey hücre kültür plaka bir kuyunun içine koyun.</li>
		<li>Her şey için 20 heparin-PEG kaplı fare adacıkları ile toplam 10 Wells doldurun.</li>
		<li>20 noncoated denetim adacıklar BitTorrents ve aynı 96-şey hücre kültür plaka bir kuyunun içine koyun.</li>
		<li>Her şey için 20 noncoated denetim adacıkları ile toplam 10 Wells doldurun.</li>
		<li>RPMI % 10 fetal Sığır serum ile adacıkları içerir 96-şey plaka her kuyuya takıma 1640 200 µL koymak ve kültürü korumak için 14 gün.</li>
		<li>2 günde adacık kültür ortamı değiştirin.</li>
		<li>Adacıkları ile yaşamak/kültür 14 gün sonunda kiti boyama ve bir ters floresan mikroskop altında gözlenen ölü bir tedavi.</li>
		<li>PI+ (kırmızı) hücreleri her adacık bir ters floresan mikroskop altında içinde saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Heparin-PEG revaskülarizasyon fare adacıklar içinde vitro kaplı
	<ol>
<li>Kültür plaka dahil olmak üzere tüm deneysel plastik ön serin ve pipet kullanmadan önce en az 12 h ipuçları.</li>
		<li>Soğutma bir yastık üzerinde 24-iyi yer. Buz 250 µL eklemek soğuk büyüme faktörü indirgenmiş Matrigel 24-şey hücre kültür plaka her kuyuya. Yer için en az 30 dk 4 ° C'de kaplamalı 24-şey plaka.</li>
		<li>Matris çözüm buzdolabında ayarlama iken fare pankreas adacık endotel Mile Sven 1 (MS1) hücreleri trypsinize.<ol>
<li>Tüm kültür medya doku kültürü balonun kaldırın. Şişesi 5 mL de PBS ile yıkayın.</li>
			<li>PBS kaldırın ve tripsin-EDTA 3 mL ekleyin. Standart bir kuluçka 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
			<li>Hücreleri ayırmak ve 5 mL serum desteklenen medya ekleyin şişeye dibine hafifçe dokunun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>15 mL santrifüj tüpü ve 5 min için 1000 x g , santrifüj hücreleri toplamak.</li>
		<li>Süpernatant almak ve 5 mL PBS de ekleyin. Yukarı ve aşağı karıştırın için pipet.</li>
		<li>1000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant alır.</li>
		<li>Serum takıma DMEM ortamı tüpün içine ekleyin ve 50.000 hücreleri matris çözüm kaplı 24-şey plaka her kuyuya temel olarak belirler.</li>
		<li>5 heparin-PEG boyalı adacıklar veya noncoated denetim adacıkları her kuyunun içine ekleyin.</li>
		<li>DMEM medya serum takıma iyi başına 500 µL toplam her kuyunun içine ekleyin.</li>
		<li>Hafif bir mikroskop altında 4 h ve 24 h kuluçka sonra tüp oluşumu gözlemlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Heparin-PEG boyalı adacıklar glikoz uyarılmış insülin salgılanması Not: heparin-PEG kaplı ve noncoated adacıkları glikoz uyarılmış insülin salgılanmasını nanocoating fare adacıkları fonksiyonu etkileyeceğini değerlendirmek için değerlendirildi.<ol>
<li>30 heparin-PEG boyalı adacıklar veya noncoated denetim adacıkları bir 1,5 mL tüp içine futbolla. Toplam 10 tüpler için boyalı adacıklar ve noncoated adacıkları hazırlamak.</li>
		<li>1 mL 2 mmol/L glikoz20 ile desteklenmiş fizyolojik tuz çözeltisi ekleyin ve 2 h 37 ° C'de kuluçkaya. Not: fizyolojik tuz solüsyonu tarifi için lütfen Tablo 1' e bakın. Tüpler kap Kuluçka kuluçka sırasında serbest bırak.</li>
		<li>Mümkün olduğu kadar çözüm kaldırın.</li>
		<li>Adacıkları 600 µL fizyolojik tuzlu çözüm için 30 dk 37 ° C'de 20 mmol/L glikoz ile takıma ekleyerek teşvik.</li>
		<li>200 µL süpernatant, her tüpün ticari insülin ELISA kullanarak ELISA miktar kit insülin için toplamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+ameliorates+myocardial+infarction-induced+myocardial+injury:+mechanisms+of+action+in+rats+and+diabetic+mice.">Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice.</a> Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).</li><li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+skin-derived+precursors+and+collagen+sponge+facilitates+diabetic+wound+healing+by+promoting+local+vascular+regeneration.">Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration.</a> Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction.">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).</li><li>Sarkar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cell+homing.">Engineered cell homing.</a> Blood. 118 (25), 184-191 (2011).</li><li>Kato, M., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewiring+cell+adhesion.">Rewiring cell adhesion.</a> J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).</li><li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+membrane+engineering+for+cell+rolling+using+peptide+conjugation+and+tuning+of+cell-selectin+interaction+kinetics.">Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics.</a> Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).</li><li>Merzaban, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+glycan+engineering+of+neural+stem+cells+augments+neurotropism+and+improves+recovery+in+a+murine+model+of+multiple+sclerosis.">Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis.</a> Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).</li><li>Silvescu, C. I., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-CSF+induces+membrane+expression+of+a+myeloperoxidase+glycvariant+that+operates+as+an+E-selectin+ligand+on+human+myeloid+cells.">G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).</li><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+bioactive+multilayered+nanocoatings+on+pancreatic+islet+cells:+incorporation+of+alpha1-antitrypsin+into+the+coatings.">Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings.</a> Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).</li><li>Lou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+surface+bioengineering+with+a+heparin-incorporated+starPEG+nanofilm.">Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).</li><li>Orlando, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+strategies+aimed+at+reconstitution+of+the+beta-cell+compartment+in+type+1+diabetes.">Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).</li><li>Kollmer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+function+of+alginate-encapsulated+islets.">Long-term function of alginate-encapsulated islets.</a> Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).</li><li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation.">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).</li><li>Kizilel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+pancreatic+islets+with+nano-thin+functional+polyethylene+glycol+coatings+for+enhanced+insulin+secretion.">Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).</li><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-scale+encapsulation+enhances+allograft+survival+and+function+of+islets+transplanted+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).</li><li>Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer+deposition+of+antifouling+coatings+on+stainless+steel+via+catechol-amine+reaction.">Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).</li><li>Kollmer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+function+of+alginate-encapsulated+islets.">Long-term function of alginate-encapsulated islets.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).</li><li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation.">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).</li><li>Zmuda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Gey, G. O., Gey, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maintenance+of+human+normal+cells+and+tumor+cells+in+continuous+culture.+I.+Preliminary+report:+Cultivation+of+mesoblastic+tumors+and+normal+tissue+and+notes+on+methods+of+cultivation.">The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation.</a> Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-selective+azide+incorporation+into+endogenous+RNase+A+via+a+"chemistry"+approach.">Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach.</a> Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).</li><li>Cabric, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchoring+of+vascular+endothelial+growth+factor+to+surface-immobilized+heparin+on+pancreatic+islets:+implications+for+stimulating+islet+angiogenesis.">Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).</li><li>Cabric, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+surface+heparinization+prevents+the+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction+in+islet+transplantation.">Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation.</a> Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).</li><li>Asif, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparinization+of+cell+surfaces+with+short+peptide-conjugated+PEG-lipid+regulates+thromboinflammation+in+transplantation+of+human+MSCs+and+hepatocytes.">Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes.</a> Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).</li><li>Teramura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulation+of+cells,+including+islets,+within+stable+ultra-thin+membrane+of+maleimide-conjugated+PEG-lipid+with+multifunctional+crosslinkers.">Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers.</a> Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).</li><li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+nanoencapsulation:+A+nanomedicine+technology+for+diabetes+research+and+management.">Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management.</a> Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu makalede, biz yaşamak için "kolay-için-evlat edinin" bir yaklaşım göstermek hücre yüzeyine heparin dahil starPEG nanocoating yolu ile pseudo-bioorthogonal Kimya nanocoating N- hydroxysuccinimide grupları arasında mühendislik ve pankreas adacık yüzey membran Amin grupları. Gerçekten de, hücre içindeki amino grupları büyük ölçüde reaktif ve sonuç olarak, daha önceki çalışmaları birincil amino grupları ile harekete geçirmek N- hydroxysuccinimidyl (NHS) ester fizyolojik koşullarda14 arasındaki etkileşimler bildirdin ,16,21. Ayrıca, kapsamlı bir araştırma heparin, son derece sülfatlanmış glikozaminoglikan ve hücre dışı matriks önemli bileşeni birleşme sırasında adacık kapsülleme, gelişmiş sonrası nakli için yol açabileceğini bildirdi revaskülarizasyon ve azaltılmış IBMIR22,23. PEG biyouyumluluk ve heparin multivalent özellikleri göz önüne alındığında, biz 8 kollu PEG maksimal heparin nanocoating imalat sırasında yükleme için kullanılır. Heparin -NHS, hangi daha sonra -NH2 gruplarıyla adacık hücre zarı üzerinde tepki vereceğini ile güncellenmiştir. -NH2 (Toplam hücre zarı) ve - Hep PEG NHS arasında adacıkları kolayca "kaplı olması" kovalent bağ oluşumu tarafından heparin dahil PEG etkinleştirerek, böylece dış yüzeyinde pankreas oluşturan bir nano-ince tabaka (nanocoating) adacıkları.
Mevcut yaklaşım da o pseudo-bioorthogonal Kimya -NHS (Toplam nanocoating) ve -NH2 adacık hücre arasında adacık microencapsulation için büyük polimer olarak PEG seçilmiş daha önce yayımlanmış yöntemleri farklıdır membran kullanılmıştır. Adacık/hücre bu kararlılığını göz önüne alındığında plazma gibi karmaşık ortamlarda özellikle kaplama sonrası nakli revaskülarizasyon için önemlidir ve hayatta kalma, oluşumu -NH2 arasındaki -NHS kıyasla daha istikrarlı olur hidrofobik etkileşim PEG ve hücre zarının24, elektrostatik etkileşimler9,15,24,25,26 veya biotin arasında biyolojik bağlantı arasında streptavidin14.
Buna ek olarak, adacık aksine aynı zamanda genişletilmiş adacık işleme süresi çok katmanlı ifade14,16,25, mevcut teknik LBL yaklaşımla dayanan kaplama yaklaşım en az gerektirir işleme ve çok kısa kaplama döneminde izole adacıkları. Adacıkları canlılığı kez zaten uzlaşma aşağıdaki adacık yalıtım nedeniyle zarar görmüş ECM enzimatik sindirim sırasında bu yana bu faktörlerin her ikisi de sonrası nakli adacık hayatta kalmak için gereklidir. Ancak, bir mevcut yaklaşım LBL, hangi yolu ile dış kaplama kalınlığı artan veya katman biriktirme, sayısını azaltarak denetlenebilecek aksine Hep PEG nanocoating kalınlığı şu an için uygun değil, kısıtlamasıdır.
Ayrıca, kimyasal reaksiyon -NHS ve -NH2 yer alır, mevcut yaklaşım arasında yaşayan hücre için uygun nerede hafif koşulu nedeniyle mühendislik değil yüzey pankreas adacıkları ama çoğu hücre tedavisi için sınırlı. Ayrıca, heparin dizi sitokinler ve biyolojik olarak aktif molekülleri ile etkileşim bilinmektedir göz önüne alındığında, Hep PEG nanocoating de sınırsız biyolojik arabulucu birleşme için potansiyele sahip açık bir platform sunar gibi daha karmaşık hücre yüzey Mühendisliği için arabirimler.

Hücre tabanlı terapiler tedavi edici etkinliği düşük hücre saklama ve zavallı hayatta kalma1,2sınırlıdır. Yüzey mühendisliği enzimatik manipülasyon yoluyla hücre, hücre tedaviler sonucu geliştirmek için peptid konjügasyon, bioorthogonal kimya, Biyomalzemeler ile fiziksel kapsülleme olmuştur istismar3,4, 5,6,7,8,9,10. Geçerli protokol yüzey Mühendisliği yaşayan hücrelerin hücre yüzeyine bir ultrathin heparin dahil starPEG (heparin-PEG) nanocoating uygulayarak bir "kolay-için-evlat edinin" yöntemi kullanarak elde amaçlamaktadır. Pankreas adacıkları yüzey Mühendisliği sunuldu burada of Langerhans adacıkları ve geçerli klinik adacık nakli aşağılayıcı sonuçlarının heterojen yapısı nedeniyle örnek olarak.
Nitekim, klinik adacık nakli Şu anda izole adacıkları karaciğer portal ven içine direkt enjeksiyon tarafından gerçekleştirilir ve bu yordamı yalnızca donör malzeme ve düşük terapötik etkinlik azlığı nedeniyle seçici hastalar için kullanılabilir 11. aljinat ve inflamatuvar ilgili fibrozis12, kimyasal dengesizlik nedeniyle ideal daha az olmasına rağmen geleneksel, aljinat adacık kapsülleme ve yüzey modifikasyonu için en sık kullanılan biomaterial oldu 13. Ayrıca, 100-200 µm arasında değişmektedir doğal adacıkları büyüklüğüne göre aljinat-adacık microcapsules hangi oksijen fizyolojik akışkanın mesafesini aşan daha büyük, 400 ve 800 µm arasında değişen vardır. Açıkorur adacık kapsülleme, i.e., adacıkları adacık hacminin önemli değişiklik olmadan Kapsüllenen, sonra geliştirilmiştir. Böylece, nanomembranes birikimi oluşur PEG, tetrafluoroethylene, silikon membran ya da çok katmanlı nanocoating ("katmanı tarafından katmanı" [LBL] tekniği olarak da bilinir) bildirdi, geliştirilmiş vitro adacık hayatta14 kaynaklanan ,15,16,17,18, LBL yaklaşım gerektirir olmasına rağmen genellikle geniş adacıkları dönem adacık canlılığı uzlaşma olabilir birden çok katman ifade için teslim . Ayrıca, biomembrane katmanlar veya nanomembranes ve adacık yüzey arasındaki hidrofobik etkileşimler elektrostatik veya kovalent Hofstede dayanan nanomembranes istikrarsızlık da endişeleri9,14 yol açmaktadır , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
İntraportal adacık nakli, tedavi sonucunu encumbers başka bir sınırlayıcı faktör implante adacıkları ile kan trombosit toplamada kaynaklanan, doğrudan temas neden anlık kan-aracılı inflamatuar (IBMIR) reaksiyondur, Koagülasyon ve bağışıklık bir olumsuz etkisi veya istenmeyen hücresel etkinleştirme9. Bu sorunları gidermek için yıldız şeklinde Polietilen glikol (starPEG) oluşan bir ultra-ince nanocoating kurulan biyouyumluluk ve çok yönlülük adacık malzeme konut olarak hazırlanmıştır. Heparin, son derece sülfatlanmış glikozaminoglikan da starPEG nanocoating anti-inflamatuar, Anti-koagulant özelliklerini ve pro-anjiogenik büyüme faktörleri22işe alma tarafından vaskülarizasyon kolaylaştırmak yeteneği için kuruldu, 23.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototin</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Solution</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 phalloidin</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/PI apoptosis kit</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium, Type XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8-armed PEG</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead staining kit</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;, basement membrane matrix, growth factor reduced</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 99.5%</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

Hücre yüzey Mühendisliği implante hücreleri konak immün saldırılara karşı korumak. Ayrıca greft işlevini geliştirmek için hücresel manzara şekillendirebilirsiniz ve hayatta kalma sonrası nakli. Bu iletişim kuralı yüzey Mühendisliği pankreas adacıkları ultrathin heparin dahil starPEG (Hep-PEG) nanocoating kullanarak elde amaçlamaktadır. Pankreas adacık yüzey Mühendisliği için Hep PEG nanocoating üretmek için heparin succinimidyl süksinat (Heparin-NHS) ilk N-(3-dimethylamino propyl) - kullanarak onun karboksilat grupları değişikliğe göre sentezN'-etil carbodiimide hidroklorür (EDC) ve N- hydroxysuccinimide (NHS). Hep PEG karışımı sonra amino son functionalized sekiz kollu starPEG (starPEG-(NH2)8) ve Heparin-NHS polietilenin tarafından kuruldu. Adacık yüzey kaplama için fare adacıkları collagenase sindirim ve degrade arıtma Histopaque kullanarak yolu ile izole edildi. İzole adacıkları sonra buz soğuk Hep PEG çözüm NHS ve adacık hücre zarı Amin grupları arasında kovalent bağ izin vermek 10 dakika ile tedavi edildi. Nanocoating Hep PEG ile minimal değişiklik adacık boyuta çeker ve hacim ve heparinization adacıklar Hep PEG ile kan-aracılı anlık inflamatuar reaksiyon adacık nakli sırasında da azaltabilir. Bu "kolay-için-evlat edinin" hücre canlılığı ödün vermeden canlı hücreler yüzey Mühendisliği için yeterince hafif bir yaklaşımdır. Heparin bağlama benzeşimi için birden fazla sitokinler göstermiştir göz önüne alındığında, Hep PEG nanocoating de sınırsız fonksiyonel biyolojik arabulucu ve yaşam için çok katmanlı yüzeyler sağlar açık bir platform sağlar hücre yüzeyine Biyomühendislik.

Heparin-PEG nanocoating starPEG-(NH2)8 ve EDC ve NHS ajanlar (Şekil 1) kaplin olarak kullanarak heparin konjugasyon tarafından sentezlenen. Heparin-PEG nanocoating kimyasal yapısı FT-IR tarafından incelenmiş ve Şekil 2' de gösterildiği gibi 3300-3600 cm-1heparin (Şekil 2 hidroksil grupları karşılık gelen, heparin karakteristik doruklarına gözlenen Kırmızı). 3300-3600 cm-1 (Şekil 2 mavi) zirve genliğini azalma starPEG (NH2)8 Amid grupları ve heparin karbonil grubu arasındaki konjügasyon temsil eder. Tepe 1.650 cm-1 genliği karşılık gelen Amid için titreşim germe karbonil da düşürüldü, heparin ile succinimidyl süksinat karboksilat grupları ve Amin, starPEG-(NH2) arasında yeterli tepki gösteren 8. heparin-PEG nanocoating yüzey yapısını atomik kuvvet mikroskobu tarafından muayene ve Lou ve ark.gösterilir, nanocoating yaklaşık 30 nm yüksekliği ve genişliği arasında değişen küçük gözenekli özellikleri (siyah noktaları) ile 2 µm 100 ile 200 arasında çapı10nm. Taranan elektronik mikroskobu elde edilen veri de içinde vivo teslimat sırasında hücre hayatta kalmak için uygun olabileceğini düşündüren çok birbirine bağlı gözenekli yapısı heparin-PEG (Şekil 3), onaylamak.
Yüzey kaplama izole fare adacıklar incelenmiş ve Şekil 4' de gibi yeşil floresans tarafından gösterilen nanocoating, ince tabaka eşit olarak boyalı adacıklar yüzeyi boyunca adacık birim/boyutu üzerinde belirgin değişiklikler neden olmadan yatırılır. Kaplama sırasında bu adacıkları canlılığı korumak için buz üzerinde tutmak için tavsiye edilir. Benzer şekilde, kaplama dönemi 10 dk bu durumda, aynı zamanda bakım adacıkları canlılık sağlamak için optimize edildi. Bu veriler oluşturulur, ancak nanocoating daha iyi gözlem için elektron mikroskopi kesit boyalı adacıklar daha önce raporlanmış9,16 olarak inceleyen daha uygun olacağını dikkati çekiyor kültürde yaşayan adacıkları yerine sabit ve katıştırılmış adacıkları.
İle ilgili olarak hayatta kalma ve boyalı adacıklar, adacık revaskülarizasyon ve fonksiyonları değerlendirildi içinde vitroolmuştur. Heparin yararlı özellikleri göz önüne alındığında, heparin functionalization adacık yüzeyine adacık revaskülarizasyon kültür ve sonuç olarak onun hayatta kalma kolaylaştırabilir. Heparin-PEG kaplı fare adacıkları sağlam adacık canlılığı Kültür (Şekil 5) sergilenen gözlemledim. Önemli ölçüde daha gelişmiş damar oluşumu da heparin-PEG ile birlikte kültürlü adacık endotel hücreleri (MS1) belirgin uzamış microvessel benzeri yapıları ve ağ benzeri vasküler yapılar (Şekil 6 tarafından belirtilen adacıkları, kaplanmış ).
Nanocoating işlemi sonucunda oluşan heparin-PEG boyalı adacıklar hiçbir etkisi glikoz uyarılmış insülin salgı yeteneği. Ne zaman adacıkları glikoz (2 mmol/L; sub-stimulatory düzeyiyle desteklenen fizyolojik tuz solüsyonu ile derin insülin salgılanması düşük düzeyde tüm tedavi gruplarında gözlenmiştir Şekil 7). Glikoz (20 mmol/L glikoz) supra fizyolojik bir düzeyiyle adacıkları uyardığında, insülin salgılanması artış tüm tedavi gruplarında gözlendi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Şekil 1: Kimyasal yapısı pankreas adacık yüzey Mühendisliği için Hep PEG nanocoating. Adacık kaplama hücre zarı ve yıldız - PEG-(NH2)8içinde birincil aminler ve heparin-NHS arasında kovalent çapraz sağlanır. Her heparin molekül bir NHS her grubunuz için değiştirildi birden çok karboksil grubuna sahiptir. NHS aktif karboksil grupları formu Amid bağlantılar, hangi yolu ile nanocoating Hep PEG ve adacıkları stabil için protein Birincil aminler ile tepki olacaktır. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Resim 2 : Yıldız - PEG-(NH2)8, heparin ve Hep PEG nanocoating Kızılötesi spektrum kurutulmuş devlet. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Şekil 3: Hep-PEG kurutulmuş durumda elektronik mikroskobu görüntülerini taranan. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Şekil 4: Heparin-PEG temsilcisi görüntülerini boyalı adacıklar floresan mikroskop altında. Heparin (yeşil renkle gösterilmiştir) FAM ile önceden etiketli. 100 adacıkları temsilcisi görüntülerdir. Ölçek çubuğu 100 µm. = <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Şekil 5: Heparin-PEG boyalı adacıklar sergilenen güçlü adacık canlılığı. (A) anlamına gelir, n mean± standart hata sunulan veri grubu başına 50 adacıkları =. (B) canlı hücreler kırmızı yeşil ve ölü hücreleri içinde gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 µm. temsilcisi 50 adacıklar görüntülerdir. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Şekil 6: Heparin-PEG nanocoating kolaylaştırır Intra-adacık revascularisation. Matrigel tüp heparin-PEG kaplı adacıkları ve noncoated kontrol adacıkları ile birlikte kültürlü MS1 hücre oluşumu. Görüntüleri 4 ile 24 h. ölçek çubuğu alınmıştır 100 µm. = <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Şekil 7: Heparin-PEG nanocoating maruz kalırsa herhangi bir değişiklik adacık insülin salgısı fonksiyonları üzerine. Heparin-boyalı adacıklar PEG ve noncoated kontrol adacıkları (her 30) 2 mmol/L (beyaz çubuğu) maruz ya da 30 dk yanıt olarak 20 mmol/L glikoz insülin salgılanması için 20 mmol/L (siyah bar) glikoz kaplı arasında karşılaştırılabilir ve kontrol adacıkları. Veri anlamına gelir, n ortalama ± standart hata gösterilir = 10. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating at JoVE.com

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Heparinized StarPEG Nanocoating ile pankreas adacıkları yüzey Mühendisliği

Bu iletişim kuralı yüzey Mühendisliği pankreas adacıkları heparin dahil starPEG nanocoating nanocoating N- hydroxysuccinimide grupları ve adacık Amin grupları arasında pseudo-bioorthogonal Kimya yoluyla kullanarak elde amaçlamaktadır hücre zarı.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

surface-engineering-pancreatic-islets-with-heparinized-starpeg

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K Görüntüleme.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. Bu iletişim kuralı yüzey Mühendisliği pankreas adacıkları heparin dahil starPEG nanocoating nanocoating N- hydroxysuccinimide grupları ve adacık Amin grupları arasında pseudo-bioorthogonal Kimya yoluyla kullanarak elde amaçlamaktadır hücre zarı.

Video: Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

İnsan Pankreas Adacıklar için boyama Protokoller

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Tıp

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Biyomühendislik

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

Bir fare pankreas adacık hücre tabanlı tarama diyabetojenik çevresel kimyasallar için

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

3D Hücre Yüklü Pankreas Dokusu Yapıları Baskı için Pankreas Doku Türetilmiş Ekstrasellüler Matrix Bioink

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix ECM Production

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biyoloji

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Pankreas adacık parafin kesitler için katıştırma

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Isolated Pancreatic Islet Treatment and Apoptosis Measurement

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of fluorescence staining techniques and confocal microscopy to assess cell viability, apoptosis, and &#946;-cell-specific death. Isolated mouse islets were treated with varying concentrations of a cytokine cocktail, including TNF-&#945;, IL-1&#946;, and IFN-&#947;, to mimic immune-mediated apoptosis during the development of type 1 diabetes. The viability of islet cells was evaluated with FDA/PI dual staining, where FDA conversion to fluorescein indicated viable cells, and PI marked membrane-compromised cells. YOPRO-1 and nuclear staining provided additional data on apoptosis, with Annexin-V confirming early apoptotic cells. Quantitative analysis revealed significant increases in apoptosis and cell death rates in cytokine-treated islets. To specifically assess effects on &#946;-cells, Zn2+ selective indicator staining was used to label insulin-producing cells through the zinc association in insulin granules, revealing substantial &#946;-cell loss following treatment of islets with pro-inflammatory cytokines for 24 h. These multi-staining protocols effectively capture and quantify the extent of cytokine-induced damage in islets and can be used to evaluate therapeutics designed to prevent &#946;-cell apoptosis in early type 1 diabetes.

This study utilizes multi-staining fluorescence-based markers of cell death and apoptosis combined with confocal microscopy to assess cytokine-induced apoptosis and &#946;-cell-specific death in pancreatic islets. It reveals spatial and temporal changes in cell death and apoptosis in response to extracellular stimuli.

İzole Pankreas Adacık Tedavisi ve Apoptoz Ölçümü

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of ...