Name: a seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model
Uploaded: 2018-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model at JoVE.com

Bu eser NIGMS (R01GM11755) için P.W.J. ve S.R.W. ve J.H. eğitim grant bursu üzerinden Ulusal Kanser Enstitüsü (NIH) (CA009110) tarafından desteklenmiştir

Fare kullanımı kurumsal hayvan bakım ve kullanmak Komitesi, Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Deneyler gerçekleştirilen çocuk (20-26 gün post-partum, dpp) C57BL/6J fareler, sperma yarı zaman uyumlu ilk nesil yararlanarak. Ancak, bu teknik aynı zamanda yetişkin fare kullanılarak gerçekleştirilebilir.
1. diseksiyon ve fare seminifer tübüllerin yalıtım
<ol><li>Tablo 1 ve Tablo 2' de anlatıldığı düzeltme/lizis çözüm ve antikor seyreltme arabellek (ADB) hazırlayın.</li>
	<li>Bir 35-mm Petri kabına 1 fosfat tamponlu tuz (1 x PBS, pH 7,4) x 3 mL ile ve 2 mL fare başına düzeltme/lizis çözeltisi ile başka bir 35 mm yemek hazırlamak.</li>
	<li>Fareyi servikal yerinden çıkması veya CO2 Havasızlıktan Boğulma yoluyla kurban ve ventral karın % 70 etanol ile sprey. V şeklinde bir açılış yapmak steril makas kullanarak abdominopelvic boşluğu açın. Sonra testis forseps kullanarak epididimal yağ yastığı çekerek çıkarın ve tunica albuginearahatsız edici kaçının. Testis bir 35 mm 1 x PBS içeren kabında yerleştirin. Not: Sperma ilk dalga faiz14zenginleştirilmiş hücre nüfusu gözlemlemek amacıyla kullanmaktadır. Sperma belirli aşamalarında farklı fare yaş (Tablo 3) zenginleştirilmiş.</li>
	<li>Testis tunica albuginea keskin uçlu Forseps ile doku delinme tarafından kaldırmak ve gevşek seminifer tübüllerin toplamak. Tübüllerin 2 mL düzeltme/lizis çözeltisi içeren yeni 35-mm Petri kabına için transfer.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 min için düzeltme/lizis çözümde tübüllerin kuluçkaya.</li>
</ol>2. seminifer tübüllerin hazırlanması
<ol><li>Poli-L-lizin kaplamalı cam slayt slayt kenarlarını sıvı engelleyici kalemle özetleyen tarafından hazırlayın.</li>
	<li>Düzeltme/lizis çözeltinin 100 µL cam slayt merkezi için geçerlidir.</li>
	<li>Steril forseps kullanarak ve makas yavaşça alay ayrı seminifer tübüllerin. Uzun bireysel tübül kesmek yaklaşık 20 mm boylarda kesim. Not: Centrosomes gibi uzun süre sabitleştirici maruz duyarlıdır yapıları görselleştirmek, tübüllerin ilk 1 x PBS ayrı sonra doğrudan yüzeyinde tübüllerin bin dereden su getirmek için düzeltme-lysis çözüm 100 µL içinde Poli-lizin slaytlar kaplı.</li>
	<li>Beş 20 mm uzun seminifer tübül segmentleri düzeltme/lizis solüsyon içeren hazır Poli-L-lizin kaplamalı cam slayt aktarın.</li>
	<li>Steril makas kıyma seminifer tübüllerin 1,5-3,0 mm kesimleri içine kullanarak.</li>
	<li>Kullanarak steril forseps böylece hiçbir doku ile çakışıyor, cam slayt tübül kesimlerinde düzenlemek ve tübüllerin eşit olarak dağıtılır. Not: Bir cam slayt tübül kesimlerinde en uygun sayısı 20 ve 40 arasında olduğunu.</li>
</ol>3. ezici, seminifer tübüllerin
<ol><li>Dağınık seminifer tübül kesimleri üzerine bir benchtop içeren cam slayt aktarın. Aşırı sıvı doku squash adımı sırasında kaybetmemek için laboratuvar mendil kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Cam slayt üzerine bir coverslip (22 x 60-1.5 mm) uygulamak ve 10-20 saniye için palmiye topuk ile basınç uygulayın. Spermatocytes seminifer tübüllerin dağıtmak için yeterli kuvvet uygulamak önemlidir. Not: Böylece tüm tübül kesimleri kesintiye squashing adım optimize etmek için bir diseksiyon mikroskop kullanarak tübüllerin gözlemlemek.</li>
	<li>Slayt forseps kullanarak, hemen flaş dondurma cam slayt sıvı N2 küçük bir dewar içinde 15 saniye veya sıvı kabarcık kesildiğinde kadar. Düz kenarlı jilet ile coverslip immunolabeling hemen, kaldırırsanız, ipucu forseps veya 21'lik iğne iyi. Not: En iyi sonuçlar, immunolabel için hemen slaytlar (bkz. Adım 4). Ancak, bu noktada slaytlar-80 ° C'de iki haftaya kadar korunabilir. Proteinler ve hücresel yapılar ömrünü en üst düzeye çıkarmak için hemen kuru buz veya-80 ° C dondurucu transfer slaytları depolamanızı ve coverslip slayt üzerinde tutun. İmmunolabeling slaytlar saklandığında, coverslip 15 saniye boyunca sıvı N2 slaytları çeker tarafından 3.3 adımda anlatıldığı gibi kaldırın.</li>
</ol>4. Immunolabeling bağlı seminifer tübüllerin
<ol><li>Slayt 1 x PBS ve yıkama üç kez 50 mL Coplin kavanoza 1 x PBS içeren 5 min için bırakın. Not: Slaytlara asla izin immunolabeling sırasında tamamen kuru.</li>
	<li>Antikor seyreltme arabelleği için 1-2 h oksijen odasında engellemek için cam slayt üzerine 1 mL uygulanır.</li>
	<li>Antikor seyreltme arabellek kaldırmak ve birincil antikor antikor seyreltme arabellekte bir oksijen odası içinde seyreltilmiş 100 µL uygulayın. Not: En iyi sonuçlar için birincil antikorlar gecede 4 ° C'de kuluçkaya Antikor (örneğin 50 µL) daha küçük hacimli bir coverslip veya parafilm içeren slaydı kapsayan tarafından kullanın. Doğrulamak ve birincil antikorlar15en iyi duruma getirme.</li>
	<li>Üç kez 5 min için slaytlar 1 x PBS içeren bir 50 mL Coplin kavanoza durulayın. Not: Yıkar geliştirmek için bir küçük manyetik heyecan çubuğunu kullanarak Coplin kavanoz kışkırtmak ve düşük hızda bir manyetik heyecan tabakta yerleştirin veya düşük hızda masa üstü bir mikser Coplin kavanoz yerleştirin.</li>
	<li>İkincil antikor antikor seyreltme arabelleği için 1-1.5 saat oda sıcaklığında bir oksijen odasında seyreltilmiş 100 µL uygulanır. Fotoğraf Birleşik fluorophore antikorlar ağartma önlemek için koyu bir kutu içindeki slaytları kuluçkaya. Not: Antikor (örneğin 50 µL) daha küçük hacimli bir coverslip veya parafilm içeren slaydı kapsayan tarafından kullanın.</li>
	<li>İki kez 5 min için slaytlar 1 x PBS içeren bir 50 mL Coplin kavanoza durulayın.</li>
	<li>Montaj orta (DAPI, 1,5 µg/mL) 4', 6-diamidino-2-phenylindole içeren slayt monte ve coverslips (22 x 60-1.5 mm) uygulayın.</li>
	<li>Coverslips açık oje slaytları korumak ve coverslips taşınmasını engelleme içeren slaytlara kapatın.</li>
</ol>5. analiz ve görüntüleme tübül squash hazırlıkları
<ol><li>Kesin z ekseni hareketi ve görüntü yakalamak için yüksek çözünürlüklü bir kamera sağlar otomatik sahne ile bir epifluorescence mikroskobu kullanın. Alternatif olarak, lazer confocal mikroskop kullanın. Not: Herhangi bir kullanılabilir donanım ve yazılım için bu adımı kullanın. Örneğin, şekil 1 ve Şekil 2 görüntülenen görüntüleri kullanarak bir hücre gözlemci bir ORCA-Flash 4.0 CMOS kamera bağlı ve Zeiss ZEN 2012 mavi edition görüntü yazılım ile analiz Zeiss Z1 ele geçirildi.</li>
	<li>Squash hazırlık kalitesini belirlemek için bir 20 X hedefi kullanarak slaytları değerlendirmek. Kaliteli slaytların eşit şekilde dağıtılır çekirdeği monolayer olacaktır. Not: Bazı bölümler slaydın diğerlerinden daha iyi olabilir, daha yüksek büyütme kullanarak daha ayrıntılı bir çözümleme için slayt en iyi bölgelerinde bulunabileceği koordinatları Not yararlıdır.</li>
	<li>Yüksek büyütme objektif (örneğin 63 X veya 100 X), çekirdek tutarlı bir monolayer var yakalama bölgeleri slayt kullanarak. Bir bölge seçtikten sonra üst ayarla ve tüm odak ışık yakalanır emin olmak için Z-yığınları daha düşük. Not: Z-yığınlar alt ve üst sınırı arasında yakalanan en uygun sayısı genellikle görüntü alma yazılımı tarafından atanır ve her amaç için farklı değil.</li>
	<li>Genişletilmiş derinlik odak resim derlemek için görüntü işleme yazılımı kullanın. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı her Z-yığın, odakta ışıktan birleştirir ve tübül squash hazırlıklar en iyi görüntüleme için esastır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Morelli, M. A., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+germ+cells+are+created+equal:+Aspects+of+sexual+dimorphism+in+mammalian+meiosis.">Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis.</a> Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).</li><li>Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+meiotic+prophase+I+to+metaphase+I+transition+in+mouse+spermatocytes.">Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes.</a> Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).</li><li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slide+preparation+method+to+preserve+three-dimensional+chromatin+architecture+of+testicular+germ+cells.">Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells.</a> J Vis Exp. (83), e50819 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+spermatogenesis:+how+far+from+clinical+application?.">In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?.</a> Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).</li><li>Staub, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+research+on+mammalian+male+germ+cell+meiotic+differentiation+in+vitro.">A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro.</a> J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).</li><li>Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squash+procedure+for+protein+immunolocalization+in+meiotic+cells.">Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells.</a> Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Xu, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+cryosection+method+for+mouse+testis+tissue.">A modified cryosection method for mouse testis tissue.</a> Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).</li><li>Hess, R., Moore, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+methods+for+evaluation+of+the+testis.">Histological methods for evaluation of the testis.</a> Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).</li><li>Bellv&#233;, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).</li><li>Bellv&#233;, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+mouse+testis+and+characterization+of+isolated+spermatogenic+cells.">Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells.</a> J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+pairing,+and+synapsis+of+homologs+during+meiosis.">Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).</li><li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+recombination:+the+essence+of+heredity.">Meiotic recombination: the essence of heredity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).</li><li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere+and+telomere+movements+during+early+meiotic+prophase+of+mouse+and+man+are+associated+with+the+onset+of+pairing.">Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing.</a> J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leptotene-zygotene+transition+of+meiosis.">The leptotene-zygotene transition of meiosis.</a> Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).</li><li>Scherthan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bouquet+makes+ends+meet.">A bouquet makes ends meet.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).</li><li>Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+sex+chromosome+inactivation.">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li><li>Royo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+acts+stage+specifically+to+regulate+multiple+aspects+of+mammalian+meiotic+silencing.">ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing.</a> Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).</li><li>Turner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+unsynapsed+meiotic+chromosomes+in+the+mouse.">Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse.</a> Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).</li><li>Marjanovi&#263;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEP63+deficiency+promotes+p53-dependent+microcephaly+and+reveals+a+role+for+the+centrosome+in+meiotic+recombination.">CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination.</a> Nat Commun. 6, 7676 (2016).</li><li>Inan&#231;, B., Dodson, H., Morrison, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Centrosome-autonomous+signal+that+involves+centriole+disengagement+permits+centrosome+duplication+in+G2+phase+after+DNA+damage.">A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage.</a> Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+mammalian+sperm+cells+identifies+new+components+of+the+centrosome.">Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).</li><li>Fukuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transacting+factor+CBF-A/Hnrnpab+binds+to+the+A2RE/RTS+element+of+protamine+2+mRNA+and+contributes+to+its+translational+regulation+during+mouse+spermatogenesis.">The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).</li><li>Lahn, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Previously+uncharacterized+histone+acetyltransferases+implicated+in+mammalian+spermatogenesis.">Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).</li><li>Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomal+association+of+histone+macroH2A1.2+in+embryonic+stem+cells+and+somatic+cells.">Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells.</a> Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).</li><li>Shanmugam, M., Hernandez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+functions+for+SNAP45,+a+subunit+of+the+small+nuclear+RNA-activating+protein+complex+SNAPc.">Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).</li><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability.">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Amory, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+spermatogenesis+by+bisdichloroacetyldiamines+is+mediated+by+inhibition+of+testicular+retinoic+acid+biosynthesis.">Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis.</a> J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+early+and+massive+wave+of+germinal+cell+apoptosis+is+required+for+the+development+of+functional+spermatogenesis.">An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis.</a> EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).</li><li>Kangasniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+basal+and+FSH+dependent+cyclic+AMP+production+in+rat+seminiferous+tubules+staged+by+an+improved+transillumination+technique.">Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique.</a> Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+arrest+of+spermiogenesis+and+germ+cell+apoptosis+in+mice+lacking+the+TBP-like+TLF/TRF2+gene.">Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene.</a> Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).</li><li>Henriks&#233;n, K., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+apoptosis+of+male+germ+cells+in+the+rat:+Mechanisms+of+cell+death+studied+by+supravital+squash+preparations.">Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations.</a> Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Fareler spermatogenez sırasında segregasyonun ilerleme yöneten hücresel olaylar çalışmak için faydalı model organizma olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, ben segregasyonun profaz gibi birçok olay, çıkmak çünkü spermatogenez çalışma için yiyecek ve içecek araçları geliştirmek için gerekli, cinsel dimorfik vardır. Bu iletişim kuralı görselleştirme ve fare spermatogenez farklı aşamalarında incelenmesi için seminifer tübül squash yöntemi açıklar. Bu yöntem hücresel bütünlüğü koru...

Mayoz, DNA ikileşmesi bir turu hücre bölünmesi iki ardışık tur tarafından takip edilir karmaşık bir hücresel olaydır. Birkaç mayoz özel olay mayoz doğru kromozom segregasyon sağlamak için ilk aşamalarında koordine edilmelidir. Homolog Rekombinasyon, kardeş ortak yönünü tamamlanması bu olaylar dahil ilk segregasyonun bölünme ve homologs arasında chiasmata gidermek için cohesin kompleksleri kademeli kaybı sırasında kinetochores. Hassas düzenleme bu işlemler, doğurganlık korumak için ve gelişimsel bozukluklar genetik ve spontan düşük1yol açabilir kromozom missegregation olayları önlemek için gereklidir.
Mayoz önemli olaylar ve erkeklerde gerçekleşecek olsa da, önemli zamansal ve mekanik sperma ve oogenesis2farklar. Örneğin, kadın mayoz sırasında embriyonik gelişim sırasında oluşur ve dictyate aşamada ergenlik kadar tutuklamalar profaz. Buna ek olarak, ergenlik ve dalgalar tutuklama olmadan yetişkin hayatı boyunca ilerledikçe, sperma başlar. Erkek ve dişi mayoz arasındaki farklar özellikle spermatocytes ve yumurta bu işlemlerde değerlendirmek doğru yiyecek ve içecek yöntemleri geliştirmek gerek vurgular. Şu anda, büyük ölçüde segregasyonun ilerleme değerlendirirken Kromatin yayılır3,4,5kullanımına dayanıyor. Kromatin yayılır segregasyonun kromozomlar eğitim için yararlı olsa da, onlar Milli mikrotübüller, centrosomes, nükleer zarf ve telomer ekleri gibi hücresel yapıların değerlendirilmesi önleme hücresel bütünlüğünün korunması için başarısız. Canlı görüntüleme ve uzun vadeli kodlamayla teknikleri kadın mayoz anlayışımızı büyük ölçüde gelişti; Tüm sağlam hücre görselleştirmek için benzer yaklaşımlar ancak, daha az sıklıkla spermatogenez6,7çalışma için geçerli olur. Erkek mayoz boyunca dinamik olaylar görselleştirmek için fare spermatocytes8,9geliştirme saytolojik özellikleri hızlı bir şekilde değerlendirmek için kurulan tübül squash teknikleri adapte olması. Burada açıklanan yöntemi birden çok hücresel yapılarının incelenmesi spermatogenez farklı aşamalarında etkinleştirme hücre bütünlüğünü korur.
Bu tübül squash teknik ayirt mikroskobu ile hücresel yapıların değerlendirilmesi için izin verir tüm cep telefonu yaklaşımdır. Haematoxylin ve Eozin gömülü parafin testis ve cryosections immünfloresan etiketleme boyama gibi erkek farelerde segregasyonun ilerleme görselleştirmek için ortak histolojik yaklaşımlar segregasyonun ilerleme geniş bir bakış için izin. Ancak, bu teknikler, mayoz10,11gerçekleşen olayların ayrıntılı analiz için gerekli ölçüde tek hücreler gidermek başarısız. Alternatif teknikleri segregasyonun süreçlerini görselleştirin önemli chemiosmotic kesinti belirleyip nükleer madde3,4,5çözmek için spermatocyte güveniyor. Bu kimyasal tedaviler gözlem hücre tiplerinin dışında birincil spermatocytes engel. Namekawa son zamanlarda açıklanan yöntemle izole spermatocytes nükleer mimarisini korumak araştırma topluluğu sağladı, ama bir cytospin ve bazı laboratuar4' e hazır olmayabilir aksesuar kullanımını gerektirir. Buna ek olarak, tübül squash tekniği sadece çoğu hücre biyoloji laboratuvarlarında genellikle standart ekipman gerektirir.
Burada açıklanan tübül squash yöntem sertoli hücreleri, spermatogonia, birincil ve ikincil spermatocytes ve spermatids de dahil olmak üzere seminifer tübül içinde bulunan farklı hücre tipleri görselleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik spermatogenez Juvenil farelerde-zaman uyumlu ilk dalga ile tarafından kaplin, mayoz12ilerledikçe zenginleştirilmiş nüfus spermatogenic hücre elde etmek mümkündür. Bu işlem süreçleri boyunca sperma, erken profaz olayları gibi ayrıntılı analizini, G2/MI ve metafaz anafaz geçişler ve spermiogenesis için izin verir. Ayrıca, tübül squash hazırlıklar kromozomlar (interchromatid etki alanları (ICDs) ve kinetochores gibi) ve centrosomes (centrioles ve pericentriolar malzeme/matrisler) saytolojik özelliklerini görselleştirmek için kullanılabilir. Squash yöntemi Kromatin yayılır ve protein ayıklama gibi diğer deneysel yaklaşımlar ile paralel olarak kolayca gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, bu tekniği yaşam spermatogenic hücreleri doğrudan görselleştirme13slaytlarda yatırmak için başarıyla değiştirildi.
Burada açıklanan yöntemi G2/MI geçiş vahşi tipli C57BL/6J farelerde analiz etmek için tüm cep telefonu seminifer tübül squash tekniği içerir. Birincil spermatocytes ilk segregasyonun bölümü girerek saytolojik özelliklerini segregasyonun iğ gözlemlemek için ayirt mikroskobu ile görüntülenir. Bu çok yönlü teknik diğer segregasyonun aşamaları ve farklı hücre tipleri görselleştirmek için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca DNA ve RNA balık yaklaşımlar gibi alternatif görselleştirme stratejileri için mükellef bir tekniktir.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehyde Aqueous</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated glass slides</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker Pen</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Humid Box</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microsopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>4109431007994000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 blue edition image software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 CMOS camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Human anti-Centromere Protein</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Mouse anti-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;gamma;H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>1 in 500</td></tr><tr><td>Mouse anti-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-pericentrin</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-REC8</td><td>Courtesy of&amp;nbsp; Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>1 in 1000</td></tr></tbody></table>

a seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model

Erkeklerde segregasyonun ilerleme, son derece düzenlenmiş hücresel olaylar birkaç uyumlu eylem gerektiren bir süreçtir. Mayoz sırasında oluşan hatalar infertilite, gebelik kaybı veya genetik kusurların yol açabilir. Başlangıcı ergenlik ve yetişkinlik devam, başlayan, spermatocytes sürekli yarı zaman uyumlu dalgalar spermatogenez geçmesi ve sonuçta haploit sperm oluştururlar. Fare spermatocytes segregasyonun başlatma geçiren ilk dalga gün 10 post-partum (10 dpp) görünür ve seminifer tübüllerin Lümen 35 dpp, olgun sperm olarak serbest bırakılır. Bu nedenle, faiz zenginleştirilmiş olasılığını elde etmek için bu gelişimsel zaman penceresi içinde fare kullanmak avantajlıdır. Nadir hücre aşamaları analizini tübüllerin içinde hücresel nüfus çeşitliliği artırmak art arda spermatogenic dalgalar katkı nedeniyle büyük farelerde daha zordur. Burada açıklanan yöntemi spermatogonia, spermatocytes ve spermatids de dahil olmak üzere fare, seminifer tübüllerin içinde bulunan hücreler saytolojik değerlendirilmesi için kolayca uygulanan bir tekniktir. Tübül squash teknik izole erkek germ hücreleri bütünlüğünü korur ve diğer teknikleri ile kolayca görselleştirildiği değil hücresel yapılarının incelenmesi sağlar. Bu tübül squash teknik olası uygulamaları göstermek için iğ derleme için ben geçiş metafaz profaz yoluyla ilerliyor spermatocytes (G2/MI geçiş) takip. Buna ek olarak, centrosome çoğaltılması, segregasyonun kromozomal inactivation (MSCI) ve kromozom buket oluşumu bu tübül squash yöntemi kullanarak gözlenen saytolojik yapıları örnek olarak değerlendirildi. Bu teknik spermatogenez sırasında mutasyon veya eksojen pertürbasyon, neden belirli kusurları kesin olarak belirlemek için kullanılabilir ve böylece, sperma moleküler anlayışımızı katkıda bulunur.

Burada, metafaz profaz geçiren geçici hücre popülasyonlarının görselleştirmek için tübül squash yöntemi kullandık ben (G2/MI) testis sperma (24 ilk dalga geçiyor Juvenil vahşi tipi fareler gelen hasat tarafından zenginleştirilmiş geçiş DPP). Şekil 1 tübül squash yöntemi kullanılarak görüntülenir çeşitli hücre aşamalarında temsilcisi görüntülerini gösteriyor. Zenginleştirilmiş metafaz nüfus ben spermatocytes Alfa-tübül...

Watch this Scientific Journal Video about A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model at JoVE.com

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Bu tübül squash teknik hızla hücresel bütünlüğünü koruyarak fare spermatocytes geliştirme saytolojik özellikleri değerlendirmek için hedeftir. Bu yöntem tüm aşamalarında spermatogenez çalışma için izin verir ve diğer biyokimyasal ve moleküler biyolojik yaklaşımlar için fare mayoz çalışmanın yanında kolayca uygulanabilir.

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.8K Görüntüleme.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. Bu tübül squash teknik hızla hücresel bütünlüğünü koruyarak fare spermatocytes geliştirme saytolojik özellikleri değerlendirmek için hedeftir. Bu yöntem tüm aşamalarında spermatogenez çalışma için izin verir ve diğer biyokimyasal ve moleküler biyolojik yaklaşımlar için fare mayoz çalışmanın yanında kolayca uygulanabilir.

Video: A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama&#39;yı Akışı Sitometrinin tarafından

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Gelişim Biyolojisi

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Meni kadın üreme sistemi ve meni الرسالة farelerde ölçümü sonrası çiftleşme koleksiyonu

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Embriyonik Gelişimi İncelemek için Murin Round Spermatid Enjeksiyon Prosedürü

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germ Hücre Nakli ve Testis Dokusu Farelerde Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Biyoloji

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama'yı Akışı Sitometrinin tarafından

Meni kadın üreme sistemi ve meni الرسالة farelerde ölçümü sonrası çiftleşme koleksiyonu

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Germ Hücre Nakli ve Testis Dokusu Farelerde Xenografting

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar